Wir danken Manon Laprise für die Ausbildung in der Echokardiographie und Ann Chamber für die Aufnahme der in den 1 und 2 gezeigten Fotos. Diese Arbeit wurde vom kanadischen Institutes of Health Research Zuschuss MOP 44363 und Kanada Chair 950-216684 unterstützt.

Alle in diesem Protokoll gezeigt Verfahren von der IRCM Animal Care Committee genehmigt. 1. Ultraschallsystem und Station Vorbereitung <ol><li> Starten Sie den Ultraschall-Bildgebungssystem und verbinden Sie den Schallkopf als auch die Physiologie Steuereinheit nach der Anleitung des Herstellers (Abbildung 1). Wählen Cardiac Messprogramm und der Schallkopf, der dem 30-MHz-Wandler entspricht. </li><li> Füllen Sie das Mundstück des Schallkopfes mit VE-Wasser. Vermeiden Sie Luftblasen, wie sie mit Bildauflösung stören. Platzieren Sie den Abtastkopf mit der Griffseite auf seinem Halter in der Nähe der Abbildungs ​​Plattform (1A). </li><li> Desinfizieren Sie die Imaging-Plattform-und Arbeitsbereich. </li><li> Füllen Sie die Flasche komplett von Ultraschall-Gel, um die Bildung von Blasen zu vermeiden, und legen Sie sie auf den Kopf in seiner Vorwärmung Container-Set bis 37 ° C (Abbildung 1B). </li><li> Überprüfen Sie die Ebenen von Oxygen und Isofluran und das Rohrsystem für die Anästhesie. Ein Experiment mit ~ 8 Embryonen ca. 15-20 L Sauerstoff zu verwenden. </li><li> Legen Sie die Flaschen von Augenbalsam, Enthaarungscreme und Elektroden-Gel in der Nähe des Imaging-Plattform (Abbildung 1B). </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Infrarot-Wärmelampe Funktionen. Während der Ausbildung, stellen Sie die Heizstufe, die Position der Lampe und den Abstand der Lampe, um Mäuse, um eine konstante Körpertemperatur und Herzfrequenz. Hinweis: Die richtige Vorbereitung des Systems und Material ist kritisch. Langwierige Verfahren können die physiologischen und hämodynamischen Eigenschaften des Föten beeinflussen, so lange drückt Narkose Herzfunktion durch eine Senkung der Herzfrequenz, Blutdruck und Blutsauerstoffsättigung Ebene. Die Bearbeitungszeit für ~ 8 Feten (durchschnittliche Wurfgröße in C57BL / 6) sollte ca. 1 Stunde sein. Andere Mausstämme kann eine höhere Anzahl von Föten bereitzustellen, möglicherweise mit einem größeren weiblichen Größe. Training ist unerlässlich, um die Processi optimierenng Zeit. </li></ol> 2. Maus-Vorbereitung <ol><li> Anesthetize die schwangere Frau in eine Kammer mit kontinuierlichen Versorgung von 2% Isofluran in Sauerstoff (200 ml / min), bis sie nicht reagierende wird. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf dem Imaging-Plattform in Rückenlage, passen Sie den Schlauch für die kontinuierliche Inhalation von 1,5% Isofluran in Sauerstoff (200 ml / min), und befestigen Sie das Inhalationsschlauch mit Klebeband (Abbildung 2A). Ausreichende Anästhesie sollte während des Verfahrens durch die entspannte Haltung der Maus und dem Fehlen jeglicher Reaktion auf Schwanz und Zehen drückt bestätigt werden. </li><li> Platz Elektroden-Gel nur auf der linken oberen und rechten unteren Elektrode Pads (rechte Vorderbein und das linke Hinterbein, auch Blei-II-Position genannt) für Elektrokardiographie. Ableitung II Position bietet eine bessere definiert aufrecht positive P-Welle und QRS-Komplex um die Herzfrequenz zu bestimmen. Sichern Sie sich die vier Pfoten den einzelnen Pads mit Klebeband (Abbildung 2A). Um Trockenheit der Augen zu vermeiden, 1 TropfenAugenbalsam in jedes Auge. </li><li> Rasieren Sie den Bauch von der Brust zur Blase mit einer Haarschneidemaschine. Dann bewerben Sie sich Enthaarungscreme für 2 Minuten und wischen Sie es mit Gaze und / oder Wattestäbchen vorsichtig entfernen Sie alle verbleibenden Haare. Achten Sie darauf, die Brustwarzen abgeschnitten. </li><li> Stecken Sie das Thermometer mit Elektroden-Gel in das Rektum des Weibchens, um die Körpertemperatur zu überwachen vorgeschmiert (sollte bei 37 ± 0,5 ° C durch Einstellen einer Infrarot-Wärmelampe über der Plattform platziert gehalten werden). Die Herzfrequenz sollte 450 ± 50 Schläge / min (bpm) sein. Sowohl die Temperatur und Herzfrequenz werden auf die Physiologie Steuereinheit (1B) dargestellt. Hinweis: Lang Betäubung, Haarausfall und Ultraschall-Gel (obwohl vorgewärmten) kann zu Unterkühlung führen, die Herzfrequenz der Frau beeinflussen können. Wenn die Körpertemperatur sinkt unter 36,5 ° C, stoppen Sie das Verfahren und die Position der Wärmelampe, die Temperatur-und die Herzfrequenz einstellen ändern. Warten Sie ein paar Minuten befErz wieder fortfahren. </li></ol> 3. Embryo Identification <ol><li> Drücken Sie vorsichtig auf den nackten Bauch, um die Embryonen zu finden. Langsam und leicht verbreiten sie aus, um die meisten der Embryonen in einer einzigen Schicht unter der Bauchoberfläche haben. In jedem Uterushorn werden Säcke linear miteinander verbunden. Versuchen Sie, diese Ordnung zu wahren, wenn sie breitet sich aus. </li><li> Mark jeder Embryo auf dem nackten Bauch der Frau mit einem Permanent-Marker mit ihren vorderen / hinteren und dorsalen / ventralen Richtungen. Wissen die Orientierung erleichtert Auffinden der Herzen mit der Sonde. Anzahl der Embryonen in den rechten und linken Hörner ausgehend von der Zervix (1, 2, 3 ... und 1 &#39;, 2&#39;, 3 &#39;... jeweils, Fig. 2B). Hinweis: (i) Vermeiden Sie die Verbreitung der Embryonen mit übermäßiger Kraft. Skizzieren Sie ihre Standorte auf einem Stück Papier, um sie zu verfolgen (Abbildung 2C). (Ii) C57BL / 6 Weibchen ~ 8 Feten pro Wurf. , 0-2 Embryonen in jedem Wurf sind jedoch located unter die anderen, die ihre Bild unmöglich. Ausschließen diese Embryonen aus der Analyse und Bewertung von mehr Würfe, wenn nötig. </li></ol> 4. Herzfrequenzmessung <ol><li> Legen Sie eine kleine Menge des vorgewärmten Ultraschall-Gel auf den nackten Bauch und gleichmäßig verteilen. Blasenbildung zu vermeiden. Hinzufügen einer größeren Menge an Gel (~ 5 ml) auf den spezifischen Bereich zu Bild. </li><li> Halten Sie die Sonde in Kontakt mit der dicken Gel-Schicht (10 mm) und nach und nach verschieben Sie die Sonde in Richtung der Haut, während der Suche nach dem schlagenden Herzen. Sobald das schlagende Herz wird auf dem Bildschirm sichtbar, stellen Sie den Winkel der Sonde an beide Ventrikel in ihrer größten Größe in der Bildebene (2D) zu haben. </li><li> Beginnen Erfassen von Bild. Mit der Unterarm auf der Station ruhen, legen Sie den Wandler auf dem Ultraschall-Gel, ein Live-Bild auf dem Bildschirm (2D) zu erhalten. Die Aufrechterhaltung der Grat des Wandlers auf der Oberseite und auf den Schallkopf Veranlagunn-Marker (in der linken oberen Ecke des Bildes) ermöglichen die Koordination der Handbewegung und die Fläche auf dem Bildschirm visualisiert. </li><li> Ausgehend von der Zervix, gehen Sie zum nächsten Embryo markiert (1 bzw. 1 &#39;in der rechten oder linken Uterushorn, respectively), um den Herzschlag auf dem Bildschirm visualisieren. Weil Schärfentiefe festgelegt ist, sanft bewegen die Sonde nach oben / unten und zur Seite, ohne den Kontakt mit Gel, um den gewünschten Bildebene zu erhalten. </li><li> Positionieren Sie das schlagende Herz in der Mitte des Bildschirms in der Region durch den gelben gestrichelten Linie, die die Fokuszone für eine bessere Datenerfassung angegeben. </li><li> Erwerben Sie die Live-Aufnahme. Erhalten Sie die Bild-und Pfadfinder Fortsetzen der Aufnahme (Abbildung 3A). Sobald ein Minimum von 10 Sekunden von einer stabilen Aufzeichnung erhalten wird, stoppen Sie die Aufnahme und sparen. </li><li> Gehen Sie zum nächsten Embryo. </li><li> Sobald alle Embryonen werden analysiert, drücken Sie auf &quot;Durchsuchen&quot; auf der Tastatur, um die Liste der Aufnahmen anzuzeigen. Spiele jeden aufgezeichnet M-Modus tracing und vielfache Messungen (mindestens 5 pro Spur) der Abstand zwischen benachbarten Spitzen (Zeit / Strömungszyklus), um die durchschnittliche Herzfrequenz (Fig. 3B) zu erhalten. Hinweis: Einige Protokolle vorschlagen, mit einem feststehenden Ständer für den Schallkopf zu vermeiden schüttelnd. Allerdings hemmt es den Winkel der Analyse, so dass die Beobachtung der Seiten Embryonen schwierig. Es verlangsamt auch die Analyse, wie der Ständer für jede Embryo eingestellt werden. Halten Sie den Schallkopf während Beilegung der Unterarm auf der Station effizient minimiert schüttelnd. Training mit 5-10 schwangeren Frauen wird empfohlen, um das Ergebnis zu optimieren. </li></ol> 5. Genotypisierung <ol><li> Mit sauberen chirurgischen Schere und Pinzette, längs einschneiden, die Haut-und Muskelschicht des Bauches. Suchen Sie die Säcke in jedem Uterus Horn und entsprechen die Zahlen. Schneiden Sie den Dottersack, den Embryo in der obigen Reihenfolge verwendet aussetzen. Wenn nicht in einer linearen Anordnung, die Skizze der Embryo Positionen auf einem StückPapier wird entscheidend sein, wenn die Flecken auf der Haut sind nicht mehr sichtbar. </li><li> Schneiden Sie nur ~ 4 mm des Schwanzes für die Genotypisierung als genomische DNA sehr effizient aus embryonalen Schwänze extrahiert. Anmerkung: (i) Das chirurgische Verfahren kann in einem separaten Ort von den Bildgebungsraum durchgeführt werden. Allerdings ist es wichtig, nicht die Maus bewegen und den chirurgischen Eingriff auf dem Imaging-Plattform, um den Überblick der nummerierten Embryonen zu halten. Wenden Sie das Tier Facility-Manager, um den chirurgischen Eingriff zu optimieren. (Ii) Die schwangere Frau schnell stirbt aufgrund von Blutverlust, wie die Föten für die Genotypisierung nach der Bebilderung entfernt. Nach Schwanz geschnitten, werden die Föten durch Hypothermie platziert 3 min auf Eis für Anästhesie und dann mit einer Schere enthauptet, wie unsere Tierpflege empfahl. </li></ol>

<ol>
	<li>Hoffman, J. I., Kaplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+congenital+heart+disease.">The incidence of congenital heart disease.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 39, 1890-1900 (2002).</li><li>Miller, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+brain+development+in+newborns+with+congenital+heart+disease.">Abnormal brain development in newborns with congenital heart disease.</a> N. Engl. J. Med. 357, 1928-1938 (2007).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+genetics+of+congenital+heart+disease.">The developmental genetics of congenital heart disease.</a> Nature. 451, 943-948 (2008).</li><li>Wessels, A., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+anatomy+of+the+heart:+a+tale+of+mice+and.">Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and.</a> 15, 165-176 (2003).</li><li>Yu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ENU+induced+mutations+causing+congenital+cardiovascular+anomalies.">ENU induced mutations causing congenital cardiovascular anomalies.</a> Development. 131, 6211-6223 (2004).</li><li>Seidah, N. G., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+therapeutic+targeting+of+the+proprotein+convertases.">The biology and therapeutic targeting of the proprotein convertases.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 11, 367-383 (2012).</li><li>Roebroek, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+of+ventral+closure+and+axial+rotation+in+embryos+lacking+the+proprotein+convertase+Furin.">Failure of ventral closure and axial rotation in embryos lacking the proprotein convertase Furin.</a> Development. 125, 4863-4876 (1998).</li><li>Roebroek, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+redundancy+of+the+proprotein+convertase+furin+in+mouse+liver.">Limited redundancy of the proprotein convertase furin in mouse liver.</a> J. Biol. Chem. 279, 53442-53450 (2004).</li><li>Kisanuki, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tie2-Cre+transgenic+mice:+a+new+model+for+endothelial+cell-lineage+analysis+in+vivo.">Tie2-Cre transgenic mice: a new model for endothelial cell-lineage analysis in vivo.</a> Dev. Biol. 230, 230-242 (2001).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+endothelial+furin+leads+to+cardiac+malformation+and+early+postnatal+death.">Loss of endothelial furin leads to cardiac malformation and early postnatal death.</a> Mol. Cell Biol. 32, 3382-3391 (2012).</li></ol>

Kein Interessenkonflikt erklärt.

M-Mode-Echokardiographie ist eine effektive und einfache Methode, um in utero Herzfrequenzen von Maus-Embryonen zu messen. Im Handel erhältliche Wandler liefern eine ausreichende Auflösung, um kleine schlagenden Herzen zu visualisieren. So ermöglichen sie eine hoch-genaue Herzfrequenz-Messung, im Vergleich zu anderen Methoden wie Pulsmessung, und kann hochauflösende Video-Mikroskopie ersetzen. Allerdings müssen die derzeitigen Instrumente nicht zulassen, dass die gleichzeitige Analyse aller Embryonen, was ...

KHK ist die häufigste nicht-infektiöse Todesursache bei der Geburt ein. Mehrere Operationen werden oft benötigt, um die strukturellen Mängel in den Fächern, deren Lebensqualität beeinträchtigt 1 bleiben zu korrigieren. Kinder mit CHD entwickeln häufig neurologische Erkrankungen, auch wenn sie nicht unterzogen Chirurgie, der angibt, in utero Folgen auf die Entwicklung 2,3 wichtig. Sowohl genetische und Umweltfaktoren, wie beispielsweise die Gefährdung durch Viren oder Chemikalien (Alkohol) während der Schwangerschaft, weil CHD. Die Untersuchung der genetischen Mitwirkenden noch in seiner frühen Phase, aber schnell wächst. Um diese Beitragszahler zu identifizieren und zu verstehen, ihre Rolle in der Herzentwicklung, Phänotypisierung mutierten Mäusen mit einer einfachen und leistungsfähiges Werkzeug wird sehr nützlich sein. Maus ist in der Tat ein Tiermodell der Wahl zur KHK zu studieren, und die meisten der menschlichen Fällen kann bei Mäusen 4,5 reproduziert werden. Folglich hat fetalen Herz Maus Phänotypisierung werden inc.reasingly wichtig, die Ursache der menschlichen CHD untersuchen und erfordert geeignete Instrumente. Obwohl histologische Untersuchungen an festen Proben sind von unschätzbarem Wert, ist eine Echtzeit-Bildgebung von lebenden Tieren entscheidend, die Physiologie des Herzens zu verstehen. Video-Mikroskopie bietet Live-Bildgebung. Allerdings erfordert es Laparotomie Embryonen freizulegen und damit ihre physiologischen und hämodynamischen Zustand beeinträchtigen. Vor kurzem hat sich zum Standard-Echokardiographie bildgebendes Verfahren für die Herz Einschätzungen in der Klinik als auch in Mäusen. Maus-Echokardiographie wird mit Standard-klinischen Ultraschallsysteme sowie Ultrahochfrequenz-Ultraschallsystemen durchgeführt. Letztere stellen ein 30-MHz-Frequenzwandler oder höher, die zweidimensionale Bilder zu erzeugen und damit die Bewertung der frühen embryonalen Stadien. Diese Wandler haben eine relativ schlechte Eindringtiefe (~ 13 mm), das ist jedoch ausreichend, um eine ausreichende Bildebenen zu erhalten und festzustellen, Grund Herz paParameter, wie z. B. Herzfrequenz, linke und rechte ventrikuläre Innendurchmesser an der Diastole und der Systole und der Scheidewand und der Wanddicke, ohne eine Laparotomie. In unserer Studie haben wir eine Ultra-Hochfrequenz-Ultraschallsystem zu Herzraten von Maus-Embryonen an embryonalen Tag E18.5 beurteilen, verwendet. Wir haben uns für eine 30-MHz-Wandler, die ein Feld Ansicht von 20 mm x 20 mm, die ideal ist, angesichts der Größe der Föten, mit einer Brennweite von 12,7 mm bietet. Jedoch kann eine höhere Frequenzwandler gewählt werden, früher Entwicklungsstufen zu analysieren. Die ausgewählte M-Modus ermöglicht die Visualisierung von Gewebe in Bewegung dank einer hohen zeitlichen Auflösung von 1.000 Bilder / Sek. Das vollständige Verfahren ist einfach und so schnell wie möglich durchgeführt werden, um jede Störung der physiologischen und hämodynamischen Zustände des Fötus zu vermeiden. Die Analyse von etwa 8 Embryonen benötigt ca. 1 Stunde.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="591">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:164px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:160px;">Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
			<td style="width:104px;">CP0406v2</td>
			<td style="width:163px;">1-chloro-2,2,2-trifluoroethyl difluoromethyl ether</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Ultrasound gel</td>
			<td>Parker Laboratories Inc.</td>
			<td>Aquasonic Clear</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Electrode gel</td>
			<td>Parker Laboratories Inc.</td>
			<td>Spectra 360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Ophthalmic gel</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>Tear-Gel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Depilatory cream</td>
			<td>Church &#38; Dwight Co., Inc.</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Hair clipper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Gauze/cotton swap</td>
			<td>Q-tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Permanent marker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:164px;">High-Resolution In vivo Ultrasound Imaging System</td>
			<td style="width:160px;">Visual Sonics</td>
			<td style="width:104px;">Vevo770</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">30 MHz Transducer</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>RMV707B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:164px;">Imaging platform and physiology controller unit</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Anesthetic System</td>
			<td>Cyprane North America Inc.</td>
			<td>312462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Infrared heating lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in utero measurement of heart rate in mouse by noninvasive m-mode echocardiography

Angeborene Herzerkrankung (CHD) die häufigste Todesursache noninfectious bei der Geburt. Die Inzidenz der KHK-Bereich von 4 bis 50/1, 000 Geburten (Krankheit und Verletzungen regionalen Schätzungen der Weltgesundheitsorganisation, 2004). Praxen, die oft Kompromisse, die Lebensqualität sind erforderlich, um Herzfehler zu korrigieren, erinnert uns an die Bedeutung der Suche nach den Ursachen der KHK. Mutant Mausmodellen und Live-Imaging-Technologie haben sich zu wichtigen Tools, um die Ätiologie dieser Erkrankung zu untersuchen. Obwohl fortgeschrittene Methoden ermöglichen die Live-Darstellung von abnormalen Herzen in Embryonen werden die physiologischen und hämodynamischen Staaten der letzteren oft auf chirurgische und / oder langwierige Verfahren beeinträchtigt. Nichtinvasiven Ultraschallbildgebung kann jedoch ohne chirurgische Freilegung der Embryonen, wodurch ihre Physiologie Aufrechterhaltung verwendet werden. Hierbei verwenden wir einfache M-Mode-Ultraschall, um die Herzfrequenz von Embryonen bei E18.5 in utero zu beurteilen. Der Nachweis von abnormalen Herzfrequenzen ist in der Tat ein guter Indikatortor der Dysfunktion des Herzens und bildet somit einen ersten Schritt bei der Identifizierung von Entwicklungsdefekten, die zu Herzversagen führen kann.

Das obige Verfahren wurde verwendet, um die Auswirkung der Anwesenheit oder Abwesenheit der Serin-Protease Furin in Endothelzellen auf die Herzraten bei E18.5 Maus-Embryonen im Uterus zu beurteilen. Furin gehört zur Familie der Proproteinkonvertasen (PCs), dass spalten Proteinvorläufer nach der Grundreste. Furin und ihre Substrate sind sekretorische Proteine ​​und Spaltung kann in den Golgi-Apparat, Endosomen oder an der Zelloberfläche auf. Key Substrate von Furin gehören TGFb und TGFb artigen Faktoren,...

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In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Ultrahochfrequenz-Ultraschall ist ein leistungsstarkes Live-Imaging-Tool, um Herzrhythmusstörungen bei Kleintieren zu untersuchen. Seine Nichtinvasivität ermöglicht die Aufrechterhaltung der physiologischen Zustand der Embryonen. Hier zeigen wir die Verwendung von M-Mode-Ultraschall, um die Herzfrequenz von Embryonen bei E18.5 in utero zu messen.

In utero Messung der Herzfrequenz in Mouse von Nichtinvasive M-Mode-Echokardiographie

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

in-utero-measurement-heart-rate-mouse-noninvasive-m-mode

Research

JoVE Journal

Medicine

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

11.3K Aufrufe.  Institut de Recherches Cliniques de Montréal.  Ultrahochfrequenz-Ultraschall ist ein leistungsstarkes Live-Imaging-Tool, um Herzrhythmusstörungen bei Kleintieren zu untersuchen. Seine Nichtinvasivität ermöglicht die Aufrechterhaltung der physiologischen Zustand der Embryonen. Hier zeigen wir die Verwendung von M-Mode-Ultraschall, um die Herzfrequenz von Embryonen bei E18.5 in utero zu messen. 

Serie: In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Transthoracic Echocardiography in Mice

In recent years, murine models have become the primary avenue for studying the molecular mechanisms of cardiac dysfunction resulting from changes in gene expression. Transgenic and gene targeting methods can be used to generate mice with altered cardiac size and function,1-3 and as a result, in vivo techniques are needed to evaluate their cardiac phenotype. Transthoracic echocardiography, pulse wave Doppler (PWD), and tissue Doppler imaging (TDI) can be used to provide dimensional measurements of the mouse heart and to quantify the degree of cardiac systolic and diastolic performance. Two-dimensional imaging is used to detect abnormal anatomy or movements of the left ventricle, whereas M-mode echo is used for quantification of cardiac dimensions and contractility.4,5 In addition, PWD is used to quantify localized velocity of turbulent flow,6 whereas TDI is used to measure the velocity of myocardial motion.7 Thus, transthoracic echocardiography offers a comprehensive method for the noninvasive evaluation of cardiac function in mice.

Transthoracic echocardiography offers a noninvasive method for the evaluation of cardiac function in mice. A combination of ultrasound and Doppler imaging modalities can be used to obtain dimensional measurements of the heart and intracardiac blood flow, which together provide an assessment of cardiac systolic and diastolic performance.

Transthorakale Echokardiographie in Mäuse

In recent years, murine models have become the primary avenue for studying the molecular mechanisms of cardiac dysfunction resulting from changes in gene ...

Forschung

Medizin

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

Einem Mausmodell der In Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, the RV is significantly affected in pulmonary diseases such as pulmonary artery hypertension (PAH). In addition, the RV is remarkably sensitive to cardiac pathologies, including left ventricular (LV) dysfunction, valvular disease or RV infarction4. To understand the role of RV in the pathogenesis of cardiac diseases, a reliable and noninvasive method to access the RV structurally and functionally is essential.
A noninvasive trans-thoracic echocardiography (TTE) based methodology was established and validated for monitoring dynamic changes in RV structure and function in adult mice. To impose RV stress, we employed a surgical model of pulmonary artery constriction (PAC) and measured the RV response over a 7-day period using a high-frequency ultrasound microimaging system. Sham operated mice were used as controls. Images were acquired in lightly anesthetized mice at baseline (before surgery), day 0 (immediately post-surgery), day 3, and day 7 (post-surgery). Data was analyzed offline using software.
Several acoustic windows (B, M, and Color Doppler modes), which can be consistently obtained in mice, allowed for reliable and reproducible measurement of RV structure (including RV wall thickness, end-diastolic&#160;and end-systolic dimensions), and function (fractional area change, fractional shortening, PA peak velocity, and peak pressure gradient) in normal mice and following PAC.
Using this method, the pressure-gradient resulting from PAC was accurately measured in real-time using Color Doppler mode and was comparable to direct pressure measurements performed with a Millar high-fidelity microtip catheter. Taken together, these data demonstrate that RV measurements obtained from various complimentary views using echocardiography are reliable, reproducible and can provide insights regarding RV structure and function. This method will enable a better understanding of the role of RV cardiac dysfunction.

Right ventricle (RV) dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease, yet limited methodologies are available for its evaluation. Recent advances in ultrasound imaging provide a noninvasive and accurate option for longitudinal RV study. Herein, we detail a step-by-step echocardiographic method using a murine model of RV pressure overload.

Beurteilung der rechtsventrikulären Struktur und Funktion in Maus-Modell der Lungenarterie Verengung durch transthorakale Echokardiographie

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events of myocardial injuries, various mouse models of myocarditis have been widely used. This study involved experimental autoimmune myocarditis (EAM) induced with cardiac myosin heavy chain (Myhc)-&#945; 334-352 in A/J mice; the affected animals develop lymphocytic myocarditis but with no apparent clinical signs. In this model, the utility of magnetic resonance microscopy (MRM) as a non-invasive modality to determine the cardiac structural and functional changes in animals immunized with Myhc-&#945; 334-352 is shown. EAM and healthy mice were imaged using a 9.4 T (400 MHz) 89 mm vertical core bore scanner equipped with a 4 cm millipede radio-frequency imaging probe and 100 G/cm triple axis gradients. Cardiac images were acquired from anesthetized animals using a gradient-echo-based cine pulse sequence, and the animals were monitored by respiration and pulse oximetry. The analysis revealed an increase in the thickness of the ventricular wall in EAM mice, with a corresponding decrease in the interior diameter of ventricles, when compared with healthy mice. The data suggest that morphological and functional changes in the inflamed hearts can be non-invasively monitored by MRM in live animals. In conclusion, MRM offers an advantage of assessing the progression and regression of myocardial injuries in diseases caused by infectious agents, as well as response to therapies.

This study demonstrates the successful establishment of magnetic resonance microscopy imaging as a non-invasive tool to assess the cardiac abnormalities in mice affected with autoimmune myocarditis. The data indicate that the technique can be used to monitor the disease-progression in live animals.

Nicht-invasive Beurteilung der Herzfehlbildungen in experimentellen autoimmunen Myokarditis von Magnetic Resonance Imaging Microscopy in der Maus

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events ...

Noninvasive Determination of Vortex Formation Time Using Transesophageal Echocardiography During Cardiac Surgery

Trans-mitral blood flow produces a three-dimensional rotational body of fluid, known as a vortex ring, that enhances the efficiency of left ventricular (LV) filling compared with a continuous linear jet. Vortex ring development is most often quantified with vortex formation time (VFT), a dimensionless parameter based on fluid ejection from a rigid tube. Our group is interested in factors that affect LV filling efficiency during cardiac surgery. In this report, we describe how to use standard two-dimensional (2D) and Doppler transesophageal echocardiography (TEE) to noninvasively derive the variables needed to calculate VFT. We calculate atrial filling fraction (&#946;) from velocity-time integrals of trans-mitral early LV filling and atrial systole blood flow velocity waveforms measured in the mid-esophageal four-chamber TEE view. Stroke volume (SV) is calculated as the product of the diameter of the LV outflow track measured in the mid-esophageal long axis TEE view and the velocity-time integral of blood flow through the outflow track determined in the deep transgastric view using pulse-wave Doppler. Finally, mitral valve diameter (D) is determined as the average of major and minor axis lengths measured in orthogonal mid-esophageal bicommissural and long axis imaging planes, respectively. VFT is then calculated as 4 &#215; (1-&#946;) &#215; SV/(&#960;D3). We have used this technique to analyze VFT in several groups of patients with differing cardiac abnormalities. We discuss our application of this technique and its potential limitations and also review our results to date. Noninvasive measurement of VFT using TEE is straightforward in anesthetized patients undergoing cardiac surgery. The technique may allow cardiac anesthesiologists and surgeons to assess the impact of pathological conditions and surgical interventions on LV filling efficiency in real time.

We describe a protocol to measure vortex formation time, an index of left ventricular filling efficiency, using standard transesophageal echocardiography techniques in patients undergoing cardiac surgery. We apply this technique to analyze vortex formation time in several groups of patients with differing cardiac pathologies.

Nicht-invasive Zeitbestimmung Vortex Formation mit transösophagealen Echokardiographie bei Herzchirurgie

Trans-mitral blood flow produces a three-dimensional rotational body of fluid, known as a vortex ring, that enhances the efficiency of left ventricular ...

Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mice

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of acute kidney injury and chronic kidney disease. The measurement system consists of a miniaturized fluorescence detector that is directly attached to the skin on the back of conscious, freely moving animals, and measures the excretion kinetics of the exogenous GFR tracer, fluorescein-isothiocyanate (FITC) conjugated sinistrin (an inulin analog). This system has been described in detail in rats. However, because of their smaller size, measurement of transcutaneous GFR in mice presents additional technical challenges. In this paper we therefore provide the first detailed practical guide to the use of transdermal GFR monitors in mice based on the combined experience of three different investigators who have been performing this assay in mice over a number of years.

Here we describe a protocol to measure glomerular filtration rate (GFR) in conscious, freely moving mice using a transdermal GFR monitor.

Transdermale Messung der glomerulären Filtrationsrate bei Mäusen

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of ...

Noninvasive Electrocardiography in the Perinatal Mouse

Electrocardiography (ECG) has long been relied upon as an effective and reliable method of assessing cardiovascular (and cardiopulmonary) function in both human and animal models of disease. Individual heart rate, rhythm, and regularity, combined with quantitative parameters collected from ECG, serve to assess the integrity of the cardiac conduction system as well as the integrated physiology of the cardiac cycle. This article provides a comprehensive description of the methods and techniques used to perform a noninvasive ECG on perinatal and neonatal mouse pups as early as the first postnatal day, without requiring the use of anesthetics. This protocol was designed to directly address a need for a standardized and repeatable method for obtaining ECG in newborn mice. From a translational perspective, this protocol proves to be entirely effective for characterization of congenital cardiopulmonary defects generated using transgenic mouse lines, and particularly for analysis of defects causing lethality at or during the first postnatal days. This protocol also aims to directly address a gap in the scientific literature to characterize and provide normative data associated with maturation of the early postnatal cardiac conduction system. This method is not limited to a specific postnatal timepoint, but rather allows for ECG data collection in neonatal mouse pups from birth to postnatal day 10 (P10), a window that is of critical importance for modeling human diseases in vivo, with particular emphasis on congenital heart disease (CHD).

Here, we present a noninvasive electrocardiography (ECG) protocol, optimized for early postnatal mice, that does not require the use of anesthetics.

Nichtinvasive Elektrokardiographie in der Perinatonmaus

Electrocardiography (ECG) has long been relied upon as an effective and reliable method of assessing cardiovascular (and cardiopulmonary) function in both ...

Morphological and Functional Assessment of the Right Ventricle Using 3D Echocardiography

Traditionally, it was believed that the right side of the heart has a minor role in circulation; however, more and more data suggest that right ventricular (RV) function has strong diagnostic and prognostic power in various cardiovascular disorders. Due to its complex morphology and function, assessment of the RV by conventional two-dimensional echocardiography is limited: the everyday clinical practice usually relies on simple linear dimensions and functional measures. Three-dimensional (3D) echocardiography overcame these limitations by providing volumetric quantification of the RV free of geometrical assumptions. Here, we offer a step-by-step guide to obtain and analyze 3D echocardiographic data of the RV using the leading commercially available software. We will quantify 3D RV volumes and ejection fraction. Several technical aspects may help to improve the quality of RV acquisition and analysis as well, which we present in a practical manner. We review the current opportunities and the limiting factors of this method and also highlight the potential applications of 3D RV assessment in current clinical practice.

Here, we provide a step-by-step acquisition and analysis protocol for the 3D volumetric assessment of the right ventricle, mainly focusing on the practical aspects that maximize the feasibility of this technique.

Morphologische und funktionelle Beurteilung des rechten Ventrikels mittels 3D-Echokardiographie

Traditionally, it was believed that the right side of the heart has a minor role in circulation; however, more and more data suggest that right ...

Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion pressure. However, it is difficult to monitor the dynamic changes of the coronary arterioles and the capillaries in the whole heart, primarily due to its motion and non-stop beating. Here we describe a method that enables monitoring of arterial perfusion rate, pressure and the diameter changes of the arterioles and capillaries in mouse right ventricular papillary muscles. The mouse septal artery is cannulated and perfused at a constant flow or pressure with the other dynamically measured. After perfusion with a fluorescently labeled lectin (e.g., Alexa Fluor-488 or -633 labeled Wheat-Germ Agglutinin, WGA), the arterioles and capillaries (and other vessels) in right ventricle papillary muscle and septum could be readily imaged. The vessel-diameter changes could then be measured in the presence or absence of heart contractions. When genetically encoded fluorescent proteins were expressed, specific features could be monitored. For examples, pericytes were visualized in mouse hearts that expressed NG2-DsRed. This method has provided a useful platform to study the physiological functions of capillary pericytes in heart. It is also suitable for studying the effect of reagents on the blood flow in heart by measuring the vascular/capillary diameter and the arterial luminal pressure simultaneously. This preparation, combined with a state-of-the-art optic imaging system, allows one to study the blood flow and its control at cellular and molecular level in the heart under near-physiological conditions.

Presented here is a protocol to study the coronary microcirculation in living murine heart tissue by ex vivo monitoring of the arterial perfusion pressure and flow that maintains the pressure, as well as vascular tree components including the capillary beds and pericytes, as the septal artery is cannulated and pressurized.

Dynamische Messung und Bildgebung von Kapillaren, Arteriolen und Pericyten im Mausherz

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion ...

Measurement of Heart Contractility in Isolated Adult Human Primary Cardiomyocytes

The evaluation of changes in heart contractility is essential during preclinical development for new cardiac- and non-cardiac-targeted compounds. This paper describes a protocol for assessing changes in contractility in adult human primary ventricular cardiomyocytes utilizing the MyoBLAZER, a non-invasive optical method that preserves the normal physiology and pharmacology of the cells. This optical recording method continuously measures contractility transients from multiple cells in parallel, providing both medium-throughput and valuable information for each individual cell in the field of view, enabling the real-time tracking of drug effects. The cardiomyocyte contractions are induced by paced electrical field stimulation, and the acquired bright field images are fed to an image-processing software that measures the sarcomere shortening across multiple cardiomyocytes. This method rapidly generates different endpoints related to the kinetics of contraction and relaxation phases, and the resulting data can then be interpreted in relation to different concentrations of a test article. This method is also employed in the late stages of preclinical development to perform follow-up mechanistic studies to support ongoing clinical studies. Thus, the adult human primary cardiomyocyte-based model combined with the optical system for continuous contractility monitoring has the potential to contribute to a new era of in vitro cardiac data translatability in preclinical medical therapy development.

This protocol describes how to measure contractility in adult human primary cardiomyocytes from donor hearts with the MyoBLAZER system, a reliable platform for assessing drug-induced changes in contractility during preclinical development.

Messung der Herzkontraktilität in isolierten adulten humanen primären Kardiomyozyten

The evaluation of changes in heart contractility is essential during preclinical development for new cardiac- and non-cardiac-targeted compounds. This ...