우리는 그림 1과 2의 사진 촬영을 위해 심 초음파 앤 Chamberland에서 훈련 마농 Laprise 감사합니다. 이 작품은 건강 연구 보조금 MOP 44,363의 캐나다 연구소와 캐나다 의자 950-216684에 의해 지원되었다.

이 프로토콜에 표시된 모든 절차는 IRCM 동물 보호위원회에 의해 승인되었습니다. 1. 초음파 시스템 및 역 준비 <ol><li> 초음파 영상 시스템을 시작하고, 제조업체의 지시 (그림 1)에 따라 scanhead뿐만 아니라 생리 컨트롤러 장치를 연결합니다. 심장 측정 프로그램 및 30 MHz의 변환기에 해당하는 scanhead을 선택합니다. </li><li> 탈 이온수로 scanhead의 노즈 피스를 입력합니다. 그들은 영상 해상도 방해로 공기 방울을 피하십시오. 이미징 플랫폼 근처의 홀더의 손잡이 사이드 (그림 1A)와 scanhead를 놓습니다. </li><li> 영상 플랫폼과 작업 영역을 소독. </li><li> 거품의 형성을 방지하고 37 ° C (그림 1B)에 해당 prewarming 용기 세트에 거꾸로 배치 완전히 초음파 젤의 병을 채우십시오. </li><li> 옥시의 검증 레벨세대와 이소 플루 란 마취의 튜브 시스템. ~ 8 배아와 함께 한 실험은 약 15 ~ 20 L의 산소를 사용합니다. </li><li> 안과 크림, 제모 크림과 영상 플랫폼 (그림 1B) 부근의 전극 젤의 병을 놓습니다. </li><li> 그 적외선 열 램프의 기능을 확인합니다. 트레이닝 동안, 열 레벨, 램프의 위치와 상수 체온과 심박을 유지하기 위하여 생쥐 램프의 거리를 설정한다. 참고 : 시스템 및 재료의 적절한 준비가 중요합니다. 긴 절차는 한 마취는 심장 박동, 혈압 및 혈액 산소 수준을 낮추는 방법으로 심장 기능을 우울하게 태아의 생리 학적 및 혈역학 적 특성에 영향을 미칠 수 있습니다. (C57BL / 6 평균 산자 수) ~ 8 태아에 대한 처리 시간은 약 1 시간이어야한다. 다른 마우스 변종 가능성이 큰 여성의 크기로, 태아의 높은 숫자를 제공 할 수 있습니다. 교육은 플라스틱 가공을 최적화하는 것이 필수적입니다NG 시간. </li></ol> 2. 마우스 준비 <ol><li> 이 응답하지 않는 될 때까지 산소의 2 % 이소 플루 란 (isoflurane)의 연속 공급 장치 (200 ㎖ / 분)와 챔버에서 임신 여성을 마취. </li><li> 산소 1.5 % 이소 플루 란 (200 ㎖ / 분)의 연속 흡입을위한 튜브를 조정하고, 테이프 (그림 2A)로 흡입 튜브를 고정, 앙와위에서 이미징 플랫폼에 마우스를 놓습니다. 충분한 마취 마우스의 편안한 자세와 꼬리와 발가락 핀치에 대한 응답의 부재로 절차를 수행하는 동안 확인해야한다. </li><li> 만 심전도 용 (오른쪽 다리도 리드 II 위치라는 왼쪽 뒷다리, 앞) 왼쪽 상단과 오른쪽 하단 전극 패드에두고 전극 젤. 리드 II 위치는 심장 박동을 결정하는 복잡한 더 나은 정의 똑바로 긍정적 인 P 파 및 QRS을 제공합니다. 테이프 (그림 2A)를 사용하여 각 패드에 네 발을 고정합니다. 눈의 건조를 방지하기 위해, 1 방울의 적용각각의 눈에 안과 연고. </li><li> 머리 깎기와 방광에 가슴에서 복부를 면도. 그런 다음 2 분 동안 제모 크림을 적용하고 신중하게 남아있는 머리카락을 제거하기 위해 거즈 및 / 또는 면봉으로 닦아냅니다. 젖꼭지를 잘라하지 않도록주의하십시오. </li><li> 몸의 온도를 모니터링하기 위해 여성의 직장에 전극 젤 prelubricated 온도계를 삽입 (플랫폼 위에 배치 적외선 가열 램프를 조정하여 37 ± 0.5 ° C로 유지해야한다). 심박수는 450 ± 50 비트 / 분 (BPM)해야한다. 온도와 심박수 모두는 생리 컨트롤러 장치 (그림 1B)에 표시됩니다. 참고 : 긴 마취, 탈모 및 초음파 젤 (데워진하지만) 여성의 심장 박동에 영향을 미칠 수있는 저체온증으로 이어질 수 있습니다. 체온이 36.5 ° C 이하로 떨어질 경우, 절차를 중단하고 온도 및 심박수를 조정하는 가열 램프의 위치를​​ 수정한다. BEF 몇 분을 기다립니다다시 진행 광석. </li></ol> 3. 배아 확인 <ol><li> 부드럽게 배아를 찾을 수 벌거 벗은 복부를 아래로 누릅니다. 천천히 가볍게 복부 표면에서 단일 층에서 배아의 대부분을 가지고 그들을 밖으로 확산. 각 자궁 혼, 주머니가 선형 적으로 서로 연결되어있다. 확산 할 때이 순서를 존중하려고합니다. </li><li> 마크 자신의 전방 / 후방 및 지느러미 / 복부 방향과 영구 마커와 여성의 벌거 벗은 복부의 각 배아. 방향을 아는 것은 프로브와 심장의 위치를​​ 용이하게합니다. (; 그림 2B 각각 1, 2, 3, ..., 1 &#39;, 2&#39;, 3 &#39;...) 자궁 경부에서 시작 번호 오른쪽에있는 배아 왼쪽 뿔. 참고 : (I) 과도한 힘을 가진 배아를 확산하지 마십시오. (그림 2C)을 추적하기 위해 종이에 자신의 위치를 스케치합니다. (II) C57BL / 6 여성은 리터당 8 ~ 태아있다. 그러나 각 쓰레기에 0-2 배아는 L입니다자신의 이미지가 불가능하고, 다른 사람 아래에 ocated. 분석에서 이러한 배아를 제외하고 필요한 경우 더 많은 새끼를 평가합니다. </li></ol> 4. 심박수 측정 <ol><li> 벌거 벗은 복부에 데워진 초음파 젤을 소량 넣고 골고루 퍼졌다. 거품 형성을 피할 것. 이미지에 특정 지역에서 겔 다량 (~ 5 ㎖)를 첨가. </li><li> 두꺼운 겔 층 (10mm)과 접촉 프로브를 잡고 심장 박동을 찾고있는 동안 서서히 피부쪽으로 프로브를 이동합니다. 심장 박동이 화면에 가시화되면, 촬상면 (도 2D)에 자신의 최대 크기 모두 심실을 갖도록 프로브의 각도를 조정한다. </li><li> 영상을 획득 시작합니다. 팔뚝 역에 쉬고,보기 화면 (그림 2D)에서 라이브 영상을 얻기 위해 초음파 젤에 변환기를 배치합니다. 상단의 트랜스 듀서의 능선을 유지하고 scanhead의 취향을 클릭(이미지의 왼쪽 상단 모서리에있는) 해당 마커가 화면에 시각화 손 운동과 지역의 조정을 할 수 있습니다. </li><li> 자궁 경부에서 시작 화면의 심장 박동을 시각화 (각각 오른쪽 또는 왼쪽 자궁 경적의 1 또는 1 &#39;)으로 표시된 가장 가까운 배아로 이동합니다. 초점 심도가 고정되어 있기 때문에, 부드럽게 원하는 이미지 평면을 얻기 위해 젤과의 접촉을 잃지 않고 / 아래 및 옆으로 프로브를 이동합니다. </li><li> 더 나은 데이터 수집을위한 초점 영역을 나타내는 황색 점선으로 표시된 영역 내 화면의 중심에 심장 박동을 위치. </li><li> 라이브 녹음을 획득. 스카우트의 이미지를 획득하고 (그림 3A)를 기록 다시 시작합니다. 안정적인 기록 10 초 최소 취득하면, 녹음을 중지하고 저장합니다. </li><li> 다음 배아를 진행합니다. </li><li> 모든 배아는 기록의 목록을 보려면 키보드의 키를 눌러 &quot;찾아보기&quot;를 분석하면. 각 기록 M 모드 TRACI을 재생NG와 평균 심장 박동수 (도 3b)을 구하는 인접한 피크 (시간 / 유동주기) 사이의 간격의 다수의 측정 (추적 당 적어도 5)를 수행한다. 참고 : 일부 프로토콜 흔들림 scanhead의 고정 스탠드를 사용하는 것이 좋습니다. 그러나, 횡 배아의 관찰 어렵게 분석의 각도를 억제. 스탠드 각 배아 조정되어야 것으로도, 분석 속도가 느려. 역에 팔을 정착하면서 scanhead을 잡고 효율적으로 흔들림 최소화 할 수 있습니다. 5-10 임신 한 여성과 훈련의 결과를 최적화하는 것이 좋습니다. </li></ol> 5. 유전자형 <ol><li> 깨끗한 수술 가위 집게를 사용하여, 길이 방향으로 피부와 복부의 근육 층을 새겨. 각 자궁 경적의 주머니를 찾아 번호를 일치합니다. 위에서 사용 된 순서로 배아를 노출하는 난황을 열 컷. 선형 배열에없는 경우, 조각에 태아 위치의 스케치피부에 자국이 더 이상 볼 수 있습니다 일단 종이 필수적 일 것이다. </li><li> 게놈 DNA는 매우 효율적으로 배아의 꼬리에서 추출한으로 유전자형에 꼬리 만 ~ 4mm를 잘라. 참고 : (I) 수술은 영상 실에서 별도의 위치에서 수행해야 할 수 있습니다. 그러나, 마우스를 이동 번호 배아의 트랙을 유지하기 위하여 이미징 플랫폼에서 수술을하지 않는 것이 중요하다. 수술을 최적화하는 동물 시설 관리자에게 문의하십시오. 태아는 촬영 후 유전자형에 제거 할 때 (II) 임신 한 여성이 빠르게 인한 혈액 손실에 죽는다. 우리의 동물 관리위원회에서 권장하는대로, 꼬리 절단 한 후, 태아는 저체온증에 의해 마취 얼음에 3 분을 배치 한 다음 가위로 목을 베. </li></ol>

<ol>
	<li>Hoffman, J. I., Kaplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+congenital+heart+disease.">The incidence of congenital heart disease.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 39, 1890-1900 (2002).</li><li>Miller, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+brain+development+in+newborns+with+congenital+heart+disease.">Abnormal brain development in newborns with congenital heart disease.</a> N. Engl. J. Med. 357, 1928-1938 (2007).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+genetics+of+congenital+heart+disease.">The developmental genetics of congenital heart disease.</a> Nature. 451, 943-948 (2008).</li><li>Wessels, A., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+anatomy+of+the+heart:+a+tale+of+mice+and.">Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and.</a> 15, 165-176 (2003).</li><li>Yu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ENU+induced+mutations+causing+congenital+cardiovascular+anomalies.">ENU induced mutations causing congenital cardiovascular anomalies.</a> Development. 131, 6211-6223 (2004).</li><li>Seidah, N. G., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+therapeutic+targeting+of+the+proprotein+convertases.">The biology and therapeutic targeting of the proprotein convertases.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 11, 367-383 (2012).</li><li>Roebroek, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+of+ventral+closure+and+axial+rotation+in+embryos+lacking+the+proprotein+convertase+Furin.">Failure of ventral closure and axial rotation in embryos lacking the proprotein convertase Furin.</a> Development. 125, 4863-4876 (1998).</li><li>Roebroek, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+redundancy+of+the+proprotein+convertase+furin+in+mouse+liver.">Limited redundancy of the proprotein convertase furin in mouse liver.</a> J. Biol. Chem. 279, 53442-53450 (2004).</li><li>Kisanuki, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tie2-Cre+transgenic+mice:+a+new+model+for+endothelial+cell-lineage+analysis+in+vivo.">Tie2-Cre transgenic mice: a new model for endothelial cell-lineage analysis in vivo.</a> Dev. Biol. 230, 230-242 (2001).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+endothelial+furin+leads+to+cardiac+malformation+and+early+postnatal+death.">Loss of endothelial furin leads to cardiac malformation and early postnatal death.</a> Mol. Cell Biol. 32, 3382-3391 (2012).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

M-모드 초음파 심장 검진 법은 마우스 배아의 자궁 내 심장 요금에 측정 할 수있는 효과적이고 간단한 방법입니다. 시판 트랜스 듀서는 작은 고동 치는 마음을 시각화하기에 충분한 해상도를 제공합니다. 따라서, 그런 펄스 측정과 같은 다른 방법에 비해, 매우 정확한 심박수 측정을 허용하고, 고해상도 비디오 현미경을 대체 할 수있다. 그러나, 현재의 도구는 배아의 각을 시각화하는 지루?...

CHD는 출생 1에서 사망의 가장 흔한 감염성 원인이다. 여러 수술은 종종 삶의 질 1을 손상 남아있을 수 있습니다 주제의 구조적 결함을 해결하기 위해 필요합니다. CHD를 가진 아이들은 자주 개발 2,3에 자궁의 결과에 중요한 나타내는, 그들은 수술을하지 않은 경우에도 신경 장애를 개발한다. 이러한 임신 중 바이러스 나 화학 물질 (알코올)에 노출, 원인 CHD로 모두 유전과 환경 요인. 유전 적 기여를 공부하는 것은 초기 단계에서 아직이지만, 빠르게 성장. 이 참여자를 식별하고 간단하고 강력한 도구와 돌연변이 생쥐를 표현형, 심장 개발에 자신의 역할을 이해하는 것은 매우 도움이 될 것입니다. 마우스는 실제로 CHD을 연구하는 선택의 동물 모델이며, 인간의 대부분의 경우는 마우스 4,5에서 재현 할 수 있습니다. 결과적으로, 태아의 심장 마우스 표현형은 INC되고있다reasingly 중요한 인간의 관상 동맥 질환의 원인을 조사하고 적절한 도구가 필요합니다. 고정 표본에 대한 조직 학적 연구는 매우 중요한 있지만, 살아있는 동물의 실시간 영상은 심장의 생리를 이해하는 것이 중요합니다. 비디오 현미경 라이브 영상을 제공합니다. 그러나, 따라서 자신의 생리 학적 및 혈역학 적 상태를 손상, 배아를 노출하는 개복 수술이 필요합니다. 최근 심 초음파 검사는 병원에서뿐만 아니라 생쥐의 심장 평가를위한 표준 영상 기술이되고있다. 마우스 태아 심장 초음파 검사는 표준 임상 초음파 시스템뿐 아니라 초고 주파수 초음파 시스템을 이용하여 수행된다. 후자는 30 MHz 또는 이차원 화상을 생성하고, 초기 배아 단계의 평가를 허용 고주파 트랜스 듀서를 제공한다. 이 트랜스 듀서는, 그러나, 적절한 영상 평면을 획득하고 근본적인 심장 PA를 결정하기에 충분하다 상대적으로 가난한 침투 깊이 (~ 13mm)을 가지고심장 박동, 심장 확장 및 수축기 및 격벽 및 벽 두께에 좌우 심실 내경, 개복술을 수행하지 않고 같은 rameters. 우리의 연구는 배아 일 E18.5에서 마우스 태아의 심장 박동수를 평가하기 위해 매우 높은 주파수의 초음파 시스템을 사용했습니다. 우리는 12.7 mm의 초점 거리를 가진 태아의 크기, 주어진 이상적인 20mm × 20 ​​mm의 필드보기를 제공하는 30 MHz의 변환기를 선택했다. 그러나, 높은 주파수 변환기는 초기 발달 단계를 분석하기 위해 선택 될 수있다. 선택한 M-모드는 1000 프레임 / 초 높은 시간 해상도에 모션 덕분에 조직의 시각화를 할 수 있습니다. 전체 절차는 간단하고 태아의 생리 학적 및 혈역학 적 상태의 교란을 방지하기 위해 가능한 한 빨리 수행되어야한다. 약 8 배아의 분석은 약 1 시간이 필요합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="591">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:164px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:160px;">Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
			<td style="width:104px;">CP0406v2</td>
			<td style="width:163px;">1-chloro-2,2,2-trifluoroethyl difluoromethyl ether</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Ultrasound gel</td>
			<td>Parker Laboratories Inc.</td>
			<td>Aquasonic Clear</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Electrode gel</td>
			<td>Parker Laboratories Inc.</td>
			<td>Spectra 360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Ophthalmic gel</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>Tear-Gel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Depilatory cream</td>
			<td>Church &#38; Dwight Co., Inc.</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Hair clipper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Gauze/cotton swap</td>
			<td>Q-tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Permanent marker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:164px;">High-Resolution In vivo Ultrasound Imaging System</td>
			<td style="width:160px;">Visual Sonics</td>
			<td style="width:104px;">Vevo770</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">30 MHz Transducer</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>RMV707B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:164px;">Imaging platform and physiology controller unit</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Anesthetic System</td>
			<td>Cyprane North America Inc.</td>
			<td>312462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Infrared heating lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in utero measurement of heart rate in mouse by noninvasive m-mode echocardiography

선천성 심장 질환 (CHD)의 출생에서 사망의 가장 흔한 감염성 원인이다. CHD의 발생 빈도는 4 ~ 50 / 1, 000의 출생 (질병 및 상해 지역 추정, 세계 보건기구, 2004)까지입니다. 종종 삶의 질을 손상 수술은 관상 동맥 질환의 원인을 발견의 중요성을 우리에게 상기시켜, 심장 결함을 해결하는 데 필요한. 돌연변이 마우스 모델과 라이브 영상 기술이 질병의 원인을 연구하는 중요한 도구가되었다. 고급 방법은 태아의 비정상적인 마음의 라이브 영상을 할 수 있지만, 후자의 생리 학적 및 혈역학 적 상태는 종종 인해 수술 및 / 또는 긴 절차에 손상됩니다. 비 침습 초음파 영상은, 그러나, 수술함으로써 그들의 생리 기능을 유지, 배아를 노출하지 않고 사용할 수있다. 여기서, 우리는 자궁에서 E18.5에서 태아의 심장 박동을 평가하기 위해 간단한 M-모드 초음파를 사용합니다. 비정상적인 심장 박동의 검출은 참으로 좋은 인디입니다따라서 심장의 기능 장애의 산 및 심장 마비로 이어질 수 있습니다 발달 결함의 식별의 첫 번째 단계를 구성한다.

위의 방법은 자궁에서 E18.5에서 마우스 태아의 심장 박동수에 내피 세포에 존재 세린 프로테아제 furin의 부재의 영향을 평가하기 위해 사용되었다. Furin 기본 잔류 후 proprotein의의 convertases (PCS) 그 베기 단백질 전구체의 가족에 속한다. Furin와 그 기판은 분비 단백질 및 단리는 골지체, 엔도 좀에서 또는 세포 표면에서 발생할 수있다. furin의 핵심 기판 TGFB 및 심장 개발에 중요한 역할을 같은 ?...

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In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

매우 높은 주파수의 초음파는 작은 동물의 심장 이상을 검사 할 수있는 강력한 라이브 이미징 도구입니다. 그 noninvasiveness는 태아의 생리 학적 상태를 유지 할 수 있습니다. 여기서, 우리는 자궁에서 E18.5에서 태아의 심장 박동수를 측정하는 M-모드 초음파의 사용을 보여줍니다.

비 침습 M-모드 초음파 심장 검진 법에 의한 마우스의 심장 박동의 자궁 측정

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

11.3K 조회수.  Institut de Recherches Cliniques de Montréal.  매우 높은 주파수의 초음파는 작은 동물의 심장 이상을 검사 할 수있는 강력한 라이브 이미징 도구입니다. 그 noninvasiveness는 태아의 생리 학적 상태를 유지 할 수 있습니다. 여기서, 우리는 자궁에서 E18.5에서 태아의 심장 박동수를 측정하는 M-모드 초음파의 사용을 보여줍니다. 

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Transthoracic Echocardiography in Mice

In recent years, murine models have become the primary avenue for studying the molecular mechanisms of cardiac dysfunction resulting from changes in gene expression. Transgenic and gene targeting methods can be used to generate mice with altered cardiac size and function,1-3 and as a result, in vivo techniques are needed to evaluate their cardiac phenotype. Transthoracic echocardiography, pulse wave Doppler (PWD), and tissue Doppler imaging (TDI) can be used to provide dimensional measurements of the mouse heart and to quantify the degree of cardiac systolic and diastolic performance. Two-dimensional imaging is used to detect abnormal anatomy or movements of the left ventricle, whereas M-mode echo is used for quantification of cardiac dimensions and contractility.4,5 In addition, PWD is used to quantify localized velocity of turbulent flow,6 whereas TDI is used to measure the velocity of myocardial motion.7 Thus, transthoracic echocardiography offers a comprehensive method for the noninvasive evaluation of cardiac function in mice.

Transthoracic echocardiography offers a noninvasive method for the evaluation of cardiac function in mice. A combination of ultrasound and Doppler imaging modalities can be used to obtain dimensional measurements of the heart and intracardiac blood flow, which together provide an assessment of cardiac systolic and diastolic performance.

마우스에 Transthoracic Echocardiography

In recent years, murine models have become the primary avenue for studying the molecular mechanisms of cardiac dysfunction resulting from changes in gene ...

연구

의학

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

의 마우스 모델 Utero에 이식

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, the RV is significantly affected in pulmonary diseases such as pulmonary artery hypertension (PAH). In addition, the RV is remarkably sensitive to cardiac pathologies, including left ventricular (LV) dysfunction, valvular disease or RV infarction4. To understand the role of RV in the pathogenesis of cardiac diseases, a reliable and noninvasive method to access the RV structurally and functionally is essential.
A noninvasive trans-thoracic echocardiography (TTE) based methodology was established and validated for monitoring dynamic changes in RV structure and function in adult mice. To impose RV stress, we employed a surgical model of pulmonary artery constriction (PAC) and measured the RV response over a 7-day period using a high-frequency ultrasound microimaging system. Sham operated mice were used as controls. Images were acquired in lightly anesthetized mice at baseline (before surgery), day 0 (immediately post-surgery), day 3, and day 7 (post-surgery). Data was analyzed offline using software.
Several acoustic windows (B, M, and Color Doppler modes), which can be consistently obtained in mice, allowed for reliable and reproducible measurement of RV structure (including RV wall thickness, end-diastolic&#160;and end-systolic dimensions), and function (fractional area change, fractional shortening, PA peak velocity, and peak pressure gradient) in normal mice and following PAC.
Using this method, the pressure-gradient resulting from PAC was accurately measured in real-time using Color Doppler mode and was comparable to direct pressure measurements performed with a Millar high-fidelity microtip catheter. Taken together, these data demonstrate that RV measurements obtained from various complimentary views using echocardiography are reliable, reproducible and can provide insights regarding RV structure and function. This method will enable a better understanding of the role of RV cardiac dysfunction.

Right ventricle (RV) dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease, yet limited methodologies are available for its evaluation. Recent advances in ultrasound imaging provide a noninvasive and accurate option for longitudinal RV study. Herein, we detail a step-by-step echocardiographic method using a murine model of RV pressure overload.

경 흉부 심 초음파에 의한 폐동맥 수축의 마우스 모델에서 마우스 오른쪽 심실 구조 및 기능의 평가

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events of myocardial injuries, various mouse models of myocarditis have been widely used. This study involved experimental autoimmune myocarditis (EAM) induced with cardiac myosin heavy chain (Myhc)-&#945; 334-352 in A/J mice; the affected animals develop lymphocytic myocarditis but with no apparent clinical signs. In this model, the utility of magnetic resonance microscopy (MRM) as a non-invasive modality to determine the cardiac structural and functional changes in animals immunized with Myhc-&#945; 334-352 is shown. EAM and healthy mice were imaged using a 9.4 T (400 MHz) 89 mm vertical core bore scanner equipped with a 4 cm millipede radio-frequency imaging probe and 100 G/cm triple axis gradients. Cardiac images were acquired from anesthetized animals using a gradient-echo-based cine pulse sequence, and the animals were monitored by respiration and pulse oximetry. The analysis revealed an increase in the thickness of the ventricular wall in EAM mice, with a corresponding decrease in the interior diameter of ventricles, when compared with healthy mice. The data suggest that morphological and functional changes in the inflamed hearts can be non-invasively monitored by MRM in live animals. In conclusion, MRM offers an advantage of assessing the progression and regression of myocardial injuries in diseases caused by infectious agents, as well as response to therapies.

This study demonstrates the successful establishment of magnetic resonance microscopy imaging as a non-invasive tool to assess the cardiac abnormalities in mice affected with autoimmune myocarditis. The data indicate that the technique can be used to monitor the disease-progression in live animals.

마우스에있는 자기 공명 현미경 영상으로 실험자가 면역 심근염에있는 심장의 이상 유무 비 침습적 평가

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events ...

Noninvasive Determination of Vortex Formation Time Using Transesophageal Echocardiography During Cardiac Surgery

Trans-mitral blood flow produces a three-dimensional rotational body of fluid, known as a vortex ring, that enhances the efficiency of left ventricular (LV) filling compared with a continuous linear jet. Vortex ring development is most often quantified with vortex formation time (VFT), a dimensionless parameter based on fluid ejection from a rigid tube. Our group is interested in factors that affect LV filling efficiency during cardiac surgery. In this report, we describe how to use standard two-dimensional (2D) and Doppler transesophageal echocardiography (TEE) to noninvasively derive the variables needed to calculate VFT. We calculate atrial filling fraction (&#946;) from velocity-time integrals of trans-mitral early LV filling and atrial systole blood flow velocity waveforms measured in the mid-esophageal four-chamber TEE view. Stroke volume (SV) is calculated as the product of the diameter of the LV outflow track measured in the mid-esophageal long axis TEE view and the velocity-time integral of blood flow through the outflow track determined in the deep transgastric view using pulse-wave Doppler. Finally, mitral valve diameter (D) is determined as the average of major and minor axis lengths measured in orthogonal mid-esophageal bicommissural and long axis imaging planes, respectively. VFT is then calculated as 4 &#215; (1-&#946;) &#215; SV/(&#960;D3). We have used this technique to analyze VFT in several groups of patients with differing cardiac abnormalities. We discuss our application of this technique and its potential limitations and also review our results to date. Noninvasive measurement of VFT using TEE is straightforward in anesthetized patients undergoing cardiac surgery. The technique may allow cardiac anesthesiologists and surgeons to assess the impact of pathological conditions and surgical interventions on LV filling efficiency in real time.

We describe a protocol to measure vortex formation time, an index of left ventricular filling efficiency, using standard transesophageal echocardiography techniques in patients undergoing cardiac surgery. We apply this technique to analyze vortex formation time in several groups of patients with differing cardiac pathologies.

심장 수술 중 심장 Transesophageal 초음파를 사용 하 여와 동 형성 시간의 비 침범 성 결정

Trans-mitral blood flow produces a three-dimensional rotational body of fluid, known as a vortex ring, that enhances the efficiency of left ventricular ...

Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mice

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of acute kidney injury and chronic kidney disease. The measurement system consists of a miniaturized fluorescence detector that is directly attached to the skin on the back of conscious, freely moving animals, and measures the excretion kinetics of the exogenous GFR tracer, fluorescein-isothiocyanate (FITC) conjugated sinistrin (an inulin analog). This system has been described in detail in rats. However, because of their smaller size, measurement of transcutaneous GFR in mice presents additional technical challenges. In this paper we therefore provide the first detailed practical guide to the use of transdermal GFR monitors in mice based on the combined experience of three different investigators who have been performing this assay in mice over a number of years.

Here we describe a protocol to measure glomerular filtration rate (GFR) in conscious, freely moving mice using a transdermal GFR monitor.

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of ...

Noninvasive Electrocardiography in the Perinatal Mouse

Electrocardiography (ECG) has long been relied upon as an effective and reliable method of assessing cardiovascular (and cardiopulmonary) function in both human and animal models of disease. Individual heart rate, rhythm, and regularity, combined with quantitative parameters collected from ECG, serve to assess the integrity of the cardiac conduction system as well as the integrated physiology of the cardiac cycle. This article provides a comprehensive description of the methods and techniques used to perform a noninvasive ECG on perinatal and neonatal mouse pups as early as the first postnatal day, without requiring the use of anesthetics. This protocol was designed to directly address a need for a standardized and repeatable method for obtaining ECG in newborn mice. From a translational perspective, this protocol proves to be entirely effective for characterization of congenital cardiopulmonary defects generated using transgenic mouse lines, and particularly for analysis of defects causing lethality at or during the first postnatal days. This protocol also aims to directly address a gap in the scientific literature to characterize and provide normative data associated with maturation of the early postnatal cardiac conduction system. This method is not limited to a specific postnatal timepoint, but rather allows for ECG data collection in neonatal mouse pups from birth to postnatal day 10 (P10), a window that is of critical importance for modeling human diseases in vivo, with particular emphasis on congenital heart disease (CHD).

Here, we present a noninvasive electrocardiography (ECG) protocol, optimized for early postnatal mice, that does not require the use of anesthetics.

주산기 마우스의 비침습적 전기 검사

Electrocardiography (ECG) has long been relied upon as an effective and reliable method of assessing cardiovascular (and cardiopulmonary) function in both ...

Morphological and Functional Assessment of the Right Ventricle Using 3D Echocardiography

Traditionally, it was believed that the right side of the heart has a minor role in circulation; however, more and more data suggest that right ventricular (RV) function has strong diagnostic and prognostic power in various cardiovascular disorders. Due to its complex morphology and function, assessment of the RV by conventional two-dimensional echocardiography is limited: the everyday clinical practice usually relies on simple linear dimensions and functional measures. Three-dimensional (3D) echocardiography overcame these limitations by providing volumetric quantification of the RV free of geometrical assumptions. Here, we offer a step-by-step guide to obtain and analyze 3D echocardiographic data of the RV using the leading commercially available software. We will quantify 3D RV volumes and ejection fraction. Several technical aspects may help to improve the quality of RV acquisition and analysis as well, which we present in a practical manner. We review the current opportunities and the limiting factors of this method and also highlight the potential applications of 3D RV assessment in current clinical practice.

Here, we provide a step-by-step acquisition and analysis protocol for the 3D volumetric assessment of the right ventricle, mainly focusing on the practical aspects that maximize the feasibility of this technique.

3D 심 초음파를 사용한 우심실의 형태 학적 및 기능적 평가

Traditionally, it was believed that the right side of the heart has a minor role in circulation; however, more and more data suggest that right ...

Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion pressure. However, it is difficult to monitor the dynamic changes of the coronary arterioles and the capillaries in the whole heart, primarily due to its motion and non-stop beating. Here we describe a method that enables monitoring of arterial perfusion rate, pressure and the diameter changes of the arterioles and capillaries in mouse right ventricular papillary muscles. The mouse septal artery is cannulated and perfused at a constant flow or pressure with the other dynamically measured. After perfusion with a fluorescently labeled lectin (e.g., Alexa Fluor-488 or -633 labeled Wheat-Germ Agglutinin, WGA), the arterioles and capillaries (and other vessels) in right ventricle papillary muscle and septum could be readily imaged. The vessel-diameter changes could then be measured in the presence or absence of heart contractions. When genetically encoded fluorescent proteins were expressed, specific features could be monitored. For examples, pericytes were visualized in mouse hearts that expressed NG2-DsRed. This method has provided a useful platform to study the physiological functions of capillary pericytes in heart. It is also suitable for studying the effect of reagents on the blood flow in heart by measuring the vascular/capillary diameter and the arterial luminal pressure simultaneously. This preparation, combined with a state-of-the-art optic imaging system, allows one to study the blood flow and its control at cellular and molecular level in the heart under near-physiological conditions.

Presented here is a protocol to study the coronary microcirculation in living murine heart tissue by ex vivo monitoring of the arterial perfusion pressure and flow that maintains the pressure, as well as vascular tree components including the capillary beds and pericytes, as the septal artery is cannulated and pressurized.

마우스 심장의 모세혈관, 동맥 및 페리사이클의 동적 측정 및 이미징

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion ...

Measurement of Heart Contractility in Isolated Adult Human Primary Cardiomyocytes

The evaluation of changes in heart contractility is essential during preclinical development for new cardiac- and non-cardiac-targeted compounds. This paper describes a protocol for assessing changes in contractility in adult human primary ventricular cardiomyocytes utilizing the MyoBLAZER, a non-invasive optical method that preserves the normal physiology and pharmacology of the cells. This optical recording method continuously measures contractility transients from multiple cells in parallel, providing both medium-throughput and valuable information for each individual cell in the field of view, enabling the real-time tracking of drug effects. The cardiomyocyte contractions are induced by paced electrical field stimulation, and the acquired bright field images are fed to an image-processing software that measures the sarcomere shortening across multiple cardiomyocytes. This method rapidly generates different endpoints related to the kinetics of contraction and relaxation phases, and the resulting data can then be interpreted in relation to different concentrations of a test article. This method is also employed in the late stages of preclinical development to perform follow-up mechanistic studies to support ongoing clinical studies. Thus, the adult human primary cardiomyocyte-based model combined with the optical system for continuous contractility monitoring has the potential to contribute to a new era of in vitro cardiac data translatability in preclinical medical therapy development.

This protocol describes how to measure contractility in adult human primary cardiomyocytes from donor hearts with the MyoBLAZER system, a reliable platform for assessing drug-induced changes in contractility during preclinical development.

고립된 성인 인간 원발성 심근세포의 심장 수축성 측정

The evaluation of changes in heart contractility is essential during preclinical development for new cardiac- and non-cardiac-targeted compounds. This ...