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Vor Beginn dieses Protokoll, sammeln neugeborenen Mäusen an postnatalen Tag 1-3 (P1-3) in einem sterilen Behälter mit Original-Käfig Bettwäsche für Schutz und Wärme verschachtelt. Es ist wichtig, schnell und effizient durch dieses Protokoll arbeiten, um Mikroglia-Ausbeute zu optimieren. Bitte siehe Tabelle 1 für vollständige Reagenzienliste. 1. Vorbereitung der Instrumente, Kultur, Medien und Gerichte <ol><li> Vorbereitung 10 ml / Welpen Mikroglia komplette Medien (MCM; 1x Minimal Essential Medium Earles [MEM], ergänzt mit 1 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 0,6% v / v D-(+)-Glucose, 100 &amp;mgr; g / ml Penicillin / Streptomycin (P / S), 4% v / v Fetal Bovine Serum (FBS), 6% v / v Pferdeserum), und fügen Sie zu jedem T-75-Kolben (1-Kolben / Welpe), Kappe und Ort horizontal in einen Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) für 1 h äquilibrieren gelassen. Es ist wichtig, dieses Medium in Flaschen (en) vor Beginn der Präparation äquilibrieren. </li><li> Prepare, aliquote, und warm im 37 ° C warmen Wasserbad für MCM-Dissektion (6 ml / Welpe) und in einem separaten konischen Rohr MCM für Zell Aufwirbelung (2 ml / Welpe). Bereiten aliquote, und Chill auf Eis Mincing Medien (MM; HBSS, ergänzt mit 100 ug / ml P / S, 0,01 M HEPES, 3 ml / Welpe) und Dissecting Medien (DM; MEM mit 100 ug / ml ergänzt P / S; 2 ml / Welpe). </li><li> Sterilisieren Sie die folgenden chirurgische Instrumente durch Eintauchen in 70% Ethanol für 10 min: Schere Nr. 1 (1; zu enthaupten), forcep # 1 (2; Nase sichern und Rinden entfernen), Schere Nr. 2 (1; nonangled; zu öffnen Kopfhaut ), forcep Nr. 2 (1; Kopfhaut entfernen), forcep Nr. 3 (1; Schädel zu entfernen), forcep # 4 (2; Hirnhaut entfernen), Schere Nr. 3 (1; Hirngewebe Hackfleisch). An der Luft trocknen auf einer sterilen Unterlage. </li><li> Wischen Sie den horizontalen Luftstrom-Workstation und Dissektionsmikroskop mit 70% Ethanol. </li><li> Dispense DM in zwei sterile, 100 mm Petrischalen für die Erfassung Kopf (3 ml; ein Gericht / 3 Jungtiere) und Zerlegung (1 ml;Ein Gericht / pup; vor der Dissektion auf Eis gekühlt). Dispense MM in ein steriles, 100 mm Petrischale zum Zerkleinern von Hirngewebe (1 ml, 1 Schale / Welpe). </li></ol> 2. Gehirngewebe Dissection <ol><li> Vor der Euthanasie, sanft desinfizieren Hals und Kopf des Welpen mit 70% Ethanol mit Hilfe eines Labor-Gewebe. Mit Scheren Nr. 1, schnell Welpen einschläfern durch Entfernen der Kopf, Kopf-Capture in vorbereitete Petrischale. Euthanize und füllen Sie die Dissektion der ein Welpe, bevor Sie mit dem nächsten Tier. </li><li> Übertragen Sie den Kopf auf die Kaltschale Dissektion, unter Dissektionsmikroskop sichern den Kopf durch Kneifen die Nase mit Zange # 1 (alternativ kann der Kopf durch Durchstechen der Zange durch die Augenhöhle befestigt werden), offene Kopfhaut mit Scheren Nr. 2 durch die Schaffung eines Y-Schnitt: Anfang von der Basis des Kopfes und in einem Winkel in Richtung der Augen. Verwenden forcep Nr. 3 zu entfernen sanft die Kopfhaut durch seitlich Peeling, Aussetzen der Schädel. </li><li> Mit Pinzette # 3, entfernen Sie vorsichtig Bindegewebe an der Basis derKopf. Wenn der Schädelbasis ausgesetzt ist, vorsichtig öffnen Schädel durch Einfädeln einem Arm in forcep zwischen Gehirn und Schädel (nach der Interhemisphärenspalt); Griff; ziehen Sie vorsichtig nach oben, um den Schädel aufreißen. </li><li> Stören Bindegewebe unter Bauchseite der Gehirn mit Zange # 1, und anschließend entfernen Gehirn mit dem gleichen Werkzeug. Heben Sie das Gehirn aus der Schädel durch die Verwendung eines nach oben gerichteten Kraft unter der Bauchseite des Gehirns. </li><li> Halten Sie das Gehirn in seiner anatomischen Position: Rückenseite nach oben, um die Rinden unter der Dissektionsmikroskop visualisieren, sichern das Gehirn an Ort und Stelle durch Einfügen von Spitzen der Pinzette in der Kreuzung des Mittelhirns und des Kortex; kortikalen Hirnhaut vollständig zu entfernen mit Zange Nr. 4, fahren Sie dann mit der ventralen Hirnhäute entfernen. Sobald die Hirnhaut vollständig entfernt wurden, trennen Sie die Rinden von dem Rest des Gehirns mit Zange Nr. 4. Es ist wichtig, vollständig zu entfernen Hirnhautgewebe Mikroglia Reinheit und yiel maximierend. </li></ol> 3. Gehirngewebe Mincing <ol><li> Über Kortex zuvor vorbereitet Hacken Schüssel; weiterhin Hacken Schritt mit sterilen Technik in der Klasse II Biologische Sicherheitswerkbank. </li><li> Mit Scheren Nr. 3 Mince Hirngewebe, die Übertragung zerkleinerte Gewebe in ein 15 ml konischen Röhrchen;. Spülen Scheren und Hacken Schüssel mit 1 ml MM jeden, sammeln und abzugeben Spülungen in die 15 ml konischen Röhrchen, die das zerkleinerte Gewebe wird dieser Spülvorgang zu maximieren die Ausbeute an Mikrogliazellen durch Sicherstellung, dass alle Restgewebe ist mit konischen Röhrchen überführt. Lassen Gewebesuspension für 1-2 min ungestört, so dass zerkleinerte Gewebe auf dem Boden des Röhrchens zu begleichen. Haben 2 Minuten nicht überschreiten, da MM nicht essentiellen Nährstoffe enthalten. </li><li> Entfernen und entsorgen 2 ml Überstand mit generischen 1000 ul Mikropipette mit einer Standard-Pipettenspitze, dass bestimmte nicht zu den niedergelassen Hackfleisch-Gewebe zu stören. </li&gt; <li> 3 ml MCM zu der Hackfleisch-Gewebe; verreiben das Gewebe mit voller Kraft mit einem generischen 1000 ul Mikropipette mit einem Standard-Pipettenspitze ohne erkennbare feste Gewebe sollte bleiben, wenn Verreiben abgeschlossen ist.. Fügen Sie weitere 3 ml MCM mit der gleichen Pipettenspitze, sammeln Rest verrieben Probe aus der Pipettenspitze. </li></ol> 4. Wachsende kortikalen Zellen <ol><li> Zentrifuge das zerkleinerte Gewebe Zellen zu pelletieren (215 xg; 5 min; RT; klinischen Zentrifuge mit Ausschwingrotor). Zurück pelletierten Zellen zur biologischen Sicherheitsschrank, entfernen und den Überstand verwerfen; sanft Zellpellet (2 ml / Rohr; MCM), fügen Sie die Zelle Aufwirbelung zu der vorher hergestellten T-75-Kolben; Kappe der Flasche und legen Sie sie horizontal in einer befeuchteten Standardgewebekultur-Inkubator (37 ° C, 5% CO 2). Lassen Sie die Zellen für 24 h inkubiert. </li><li> Nach 24 Stunden, klopfen Sie leicht Kolben gegen die Handfläche zu störenGewebereste. Check-Zellen vor und nach dem Abstich, um eine vollständige Entfernung von Rückständen sicherzustellen. Set Kolben vertikal; entfernen und entsorgen Medien, fügen frische MCM auf den Boden der Flasche (12 ml, 37 ° C), Kappe und legen Sie wieder in den Inkubator, horizontal. </li><li> Überprüfen Zellen täglich auf Verschmutzung und das Wachstum zu überwachen. </li><li> Bei etwa 17 bis 21 Tagen in vitro (DIV), werden Mikrogliazellen bereit für die Ernte aus dem gemischten Gliazellen Kultur. Um festzustellen, ob Zellen sind bereit, zu prüfen Zellen unter einem inversen Phasenkontrastmikroskop. Mikroglia sind bereit für die Ernte, wenn sie bei ~ 40% Konfluenz. Sie erscheinen als kleine, hell, Kugelzellen wachsen als Monolayer auf andere Gliazellen. </li></ol> 5. Isolierung von Mikroglia vom gemischten Gliazellen Kultur <ol><li> Um Mikroglia zu isolieren, kräftig tippen Kolben gegen Labortisch. Diese Bewegung hilft separaten Mikroglia aus anderen Gliazellen aufgrund der niedrigen Hafteigenschaften von Mikroglia. </li><li&gt; Seal T-75-Kolben-Kappen mit Parafilm und die gemischten Gliakulturen drehen (200 Upm; 37 ° C; 5 h). Verwendung einer Temperatur-kontrollierten, nonhumidified Rotationsschüttler Nicht Zellen länger als 5 Stunden schütteln Sichtprüfung. dass Mikroglia haben sich die Kolben-Oberfläche nach 5 Stunden aufgehoben, mit einem inversen Phasenkontrastmikroskop. Mikroglia sind hell, kugelförmig, frei schwimmende Zellen. Es wird eine Restschicht von Astrozyten und Oligodendrozyten zu dem Boden des Kolbens zu haften. </li><li> Sammeln Stand Medien, die Mikroglia in einen sterilen konischen Zentrifugenröhrchen; Pellet Mikroglia (215 xg, 5 min; Ausschwingrotor). </li><li> Resuspendieren der Mikropellets in warmem Mikroglia-Wachstumsmedium (MGM, MEM, ergänzt mit 1 mM Natriumpyruvat, 0,6% v / vglucose, 1 mM L-Glutamin, 100 ug / ml P / S, 5% v / v FBS, 2 ~ ml / Kolben), bestimmen die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer und Platte 1 x 10 5 Zellen / Well in einer 24-Well-Plattenformat aufKunststoff-oder sterilen Glasdeckgläser (500 ul /; MGM). Mit diesem Verfahren die durchschnittliche Mikroglia Ausbeute beträgt 7,5 x 10 5 Zellen / pup Kortex. </li><li> 24 Stunden nach der Beschichtung, entfernen Sie alle Medien-und Rückführungs Zellen mit frischem MGM (37 ° C), um schwimmende Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. Dieser Schritt ist entscheidend für das Überleben der Zelle und Ruhe Mikroglia zu halten. Die Zellen können zum Experimentieren unmittelbar nach refeeding genutzt werden. </li></ol> 6. Beispiel Behandlungen <ol><li> Aussetzen Zellen 10 ng / ml von Pam 3 CSK 4 (Pam), 10 ng / ml Lipopolysaccharid (LPS) oder einer Fahrzeugsteuerung; Inkubation für 2 oder 24 h in befeuchteten Inkubator (37 ° C, 5% CO 2). </li></ol> 7. Analyse von Mikrogliazellen für Funktionalität Ex-vivo-Imaging über Immunfluoreszenz-und Immunzytochemie <ol><li> Nach der Behandlung der Ernte von Zellkulturmedien in Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml) und zentrifuge mit einer Tischmikrozentrifuge (2 min; 900 xg), um Medien zu löschen. Den Überstand in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen; Test sofort oder bei -20 ° C bis zur Verwendung. TNF-α Analysieren Konzentration in Zellkulturüberstand über handelsübliche Maus TNF-α-ELISA-Kit. </li><li> Waschen der Zellen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), und fixieren die Zellen mit 4% (w / v) Paraformaldehyd / 4% (w / v) Saccharose / PBS pH 7,4 (4% PFA, 15 min, RT). Nach der Fixierung, waschen Sie die Zellen mit PBS für 5 min unter leichtem Schütteln auf einem Rundschüttler. <ol><li> Immunfluoreszenz / Immunocytochemistry. Nach der Fixierung und PBS waschen, Prozess Mikroglia für Immunzytochemie. Alle Schritte mit leichtem Schütteln durchgeführt. Zellen permeabilisiert PBS/0.1% Triton X-100; Blockzellen in PBS/10% normalem Ziegenserum für eine Stunde. Zellen O / N Inkubieren bei 4 ° C mit Kaninchen-Anti-NF-&amp;kgr; B-Antikörper (p65-Untereinheit; 1/1, 250) oder Kaninchen-anti-Iba-1-Antikörper (1/750) in Blockierungspuffer. Visuellize Antigen: Antikörper-Komplex nach Inkubation mit Fluoreszenz-konjugierte Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper (1 h, 1/1, 000). Entfernen von ungebundenem sekundärem Antikörper durch Waschen mit PBS/0.1% Triton X-100 (3 × 5 min). </li><li> Gegenfärbung Zellen mit 4 &#39;,6-Diamidino-2-phenylindol / PBS (DAPI, 0,1 ug / ml). In den Zellkern zu visualisieren Alle Mikroglia aus CX3CR1-GFP + / abgeleitet - Mäuse exprimieren GFP. Nutzen Sie eine 350 nm Wellenlängenfilter, um DAPI visualisieren, ein 488 nm Wellenlängenfilter mit GFP zu visualisieren, und ein 594 nm Wellenlängenfilter an p65 und Iba-1-Immun visualisieren. </li></ol></li><li> Berg Deckgläser unter Verwendung wässriger Lösung und Montage visualisieren Mikroglia mit Fluoreszenzmikroskopie. </li></ol>

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Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigenpresentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared.</a> J. Immunol. 154, 4309-4321 (1995).</li><li>Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+digestion+with+dispase+substantially+reduces+lymphocyte+and+macrophage+cell-surface+antigen+expression.">Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression.</a> J. Immunol. Methods. 194, 71-75 (1996).</li><li>Pino, P. A., Cardona, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+brain+and+spinal+cord+mononuclear+cells+using+percoll+gradients.">Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Veremeyko, T., Starossom, S. C., Weiner, H. L., Ponomarev, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+microRNAs+in+microglia+by+real-time+PCR+in+normal+CNS+and+during+neuroinflammation.">Detection of microRNAs in microglia by real-time PCR in normal CNS and during neuroinflammation.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Su, X., Federoff, H. J., Maguire-Zeiss, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+alpha-synuclein+overexpression+mediates+early+proinflammatory+activity.">Mutant alpha-synuclein overexpression mediates early proinflammatory activity.</a> Neurotox. Res. 16, 238-254 (2009).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptorCX(3)CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptorCX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).</li><li>Imai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+molecular+characterization+of+fractalkine+receptor+CX3CR1,+which+mediates+both+leukocyte+migration+and+adhesion.">Identification and molecular characterization of fractalkine receptor CX3CR1, which mediates both leukocyte migration and adhesion.</a> Cell. 91, 521-530 (1997).</li><li>Cardona, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+microglial+neurotoxicity+by+the+fractalkine+receptor.">Control of microglial neurotoxicity by the fractalkine receptor.</a> Nat. Neurosci. 9, 917-924 (2006).</li><li>Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+microgliosis.">Reactive microgliosis.</a> Prog. Neurobiol. 57, 563-581 (1999).</li><li>Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+highly+enriched+and+quiescent+microglia+from+adult+rat+hippocampus:immunophenotypic+and+functional+characteristics.">Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus:immunophenotypic and functional characteristics.</a> J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass die Forschung wurde in Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen, die als potentieller Interessenkonflikt verstanden werden könnte durchgeführt.

Das vorliegende Verfahren bietet eine effektive Methode zur Isolierung der kortikalen Mikrogliazellen von neugeborenen Mäusen. Dieses Verfahren hat einen zweifachen Vorteil 1) Erhaltung Mikroglia Immunphänotyps und Funktionalität, wie durch Fluoreszenz-Bildgebung, Immunzytochemie und ELISA bestimmt, und 2) ermöglicht Mikroglia in der Gegenwart von anderen Gliazellen (Astrozyten und oligodentrocytes) vor dem reifen Isolation, die während der Gliazellen Kultur Reifezeit wichtige Zell-Zell-Interaktionen ermöglichen k...

Mikrogliazellen, die Überwachungs Makrophagen des ZNS Parenchym, umfassen etwa 12% der Gesamtzellpopulation des erwachsenen Gehirns von Säugetieren. Mikrogliazellen sind aus Dottersack myeloischen Vorläuferzellen abgeleitet und variieren in der Zelldichte und Morphologie in verschiedenen cytoarchitectural Regionen innerhalb der adulten ZNS 05.01. In einem gesunden erwachsenen Gehirn sind Mikroglia kleinen, verzweigten oder polaren Zellen mit feinen, dynamischen Prozessen. Im Gegensatz zu peripheren Makrophagen Morphologie, Mikrogliazellen zeigen eine Ruhe, Low-Profile-Phänotyp in gesunden Gehirnen, die als zelluläre Inaktivität erscheinen können, aber in-vivo-Imaging-Studien zeigen, dass die Mikroglia-Prozesse dynamisch aus-und einfahren, um ihre Mikroumgebung überwachen in einer Art und Weise erinnert an &quot; Probenahme-und Vermessungs &quot;6,7. Mikroglia sind stark unterschiedlich und als Reaktion auf Umwelt und pathophysiologischen Veränderungen im Gehirn, Schaltvon einem Wacher zu einer Effektor-Zustand häufig als ihre Ruhe angesehen und aktivierten Zustände auf. Dieser Schalter kann bei der Aktivierung durch den Eingriff der membrangebundenen Mustererkennungsrezeptoren (PRRS), wie etwa Toll-like Rezeptoren (TLR), die pathogen-associated molecular Muster reagieren (PAMPS), nämlich Bakterien-und Virus-abgeleitete Lipoproteine ​​vermittelt , Nukleinsäuren, Kohlenhydrate und 8-11. Zusätzlich zu PAMPs haben KFVs auch gezeigt, dass Mikroglia-Aktivierung gegen steriles, nicht-pathogenen Molekülen Gefahr / Beschädigung assoziierte molekulare Muster (gedämpft) bekannt, die eine Störung der Homöostase im ZNS darstellen, wie beispielsweise Zellschäden induzieren 12-16. Einmal aktiviert, PRRs initiieren eine intrazelluläre Signalkaskade, die zu Veränderungen in Mikroglia-Zellmorphologie und Genexpression führt, insbesondere aktivierte Mikroglia eine Anpassung amoeboid-ähnlichen Phänotyp, die p65 transloziert NF-kB-Untereinheit (p65) in den Zellkern und regulieren die production und Sekretion von proinflammatorischen Cytokinen, wie Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α), Interleukin-1 β (IL-1β), zusammen mit reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), 16-24. Obwohl integral an der angeborenen Immunantwort des ZNS haben diese Moleküle sezerniert wurde auch gefunden, neuronale oxidativen Stress zu erhöhen, wodurch induzieren und verschlimmern Neurodegeneration bei Krankheitszuständen, wie Parkinson-und Alzheimer-Krankheit 25-29. Jedoch sind die Mechanismen der Mikroglia-Aktivierung in pathologischen Zuständen nicht vollständig verstanden. Daher Isolierung der Mikroglia ist ein leistungsfähiges Werkzeug in Untersuchungs dieser biologischen Prozesse, wie viele in-vivo-Funktionen von Mikroglia-Aktivierung in Kultur rekapituliert werden. Es sind mehrere Verfahren zur Isolierung von Mikroglia, einschließlich Isolierung über einen Percoll-Gradienten folgende enzymatische Verdauung von ZNS-Gewebe 30,31 erhältlich. Allerdings enzymatische Verdauung verändern könnender Immunphänotyp der Zellen, indem Zelloberflächenantigen-Expression 32 und führt zu einer geringeren Zellausbeute pro Tier als dem hier beschriebenen Verfahren. Insbesondere weisen wir einen durchschnittlichen Ertrag pro Welpe Mikroglia Kortex von 7,5 x 10 5 Zellen, während zuvor berichtet Isolierungsverfahren aus ganzen ZNS über einen Percoll-Gradienten Ausbeute 5.3 x 10 5 Zellen 30,33,34. Das vorliegende Verfahren umgeht die Verwendung von Verdauungsenzymen durch Isolierung Mikroglia auf der Grundlage ihrer niedrigen Hafteigenschaften, wodurch die Mikro Immunophänotyp und Funktionalität erhalten bleibt. In der vorliegenden Studie beschreiben wir die Isolierung von Mikroglia-Zellen aus gemischten Glia-Kulturen aus Neugeborenen-heterozygoten CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + / -) abgeleitet und C57BL / 6 Mäuse Kortex über mechanische Bewegung auf einem Rotationsschüttler, eine Erweiterung der zuvor publizierten Methode 24,35. Wir nutzen die ehemaligen Mausstamm für die einfache Visualisierung von Mikrogliazellen, alsDiese Mäuse exprimieren GFP unter der Kontrolle des endogenen Locus CX3CR1 - ein Monozyten-spezifische Promotor 36-38. Dieses Verfahren erzeugt sehr reine Mikrokulturen mit dem erhaltenen Immunphänotyps ex vivo, wie durch morphologische Veränderungen, die nukleäre Translokation von p65 und Sekretion von TNF-α nachgewiesen, wenn mit bakteriellem Lipopolysaccharid (LPS) oder Pam 3 CSK 4 gefordert, TLR4 und TLR1 / 2-Agonisten sind.

<table><tbody><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 &amp;deg;C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM.</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate 100 mM (100x)</td><td>Hyclone</td><td>SH30239.01</td><td>Store at 4 &amp;deg;C. Used to make MCM and MGM.</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Store at -20 &amp;deg;C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM.</td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>Store at -20 &amp;deg;C. Used to make MCM and MGM.</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (Defined)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td>Filter sterilize; store at -20 &amp;deg;C. Used to make MCM and MGM.</td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Earle&#039;s (MEM)</td><td>Cellgro</td><td>15-010-CV</td><td>Without L-glutamine. Contains Earle&#039;s salts. Used to make MCM, MGM, and DM.</td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>Gibco</td><td>16050</td><td>Filter sterilize; store at -20 &amp;deg;C. Used to make MCM and MGM.</td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Cellgro</td><td>21-021-CV</td><td>Without calcium and magnesium. Store at 4 &amp;deg;C. Used to make MM.</td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630-031</td><td>Store at 4 &amp;deg;C. Used to make MM.</td></tr><tr><td>T-75 Flask</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>4&#039;,6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td>Used to stain cell nucleus.</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Iba1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Rabbit anti-NF&amp;kappa;B (p65)</td><td>Abcam</td><td>7970</td><td>Used at 1/1,250 dilution for ICC staining for p65.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td>Used at 1/1,000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC.</td></tr><tr><td>10 ml Disposable Serological Pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Disposable Centrifuge Tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-8</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Disposible Centrifuge Tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Polystyrene Petri Dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>875713</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1)</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-6010</td><td>1; 5 in; used for removing head</td></tr><tr><td>Scissor: Vannas&lt;br/&gt; (scissor #2)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td>1; nonangled; 2.5 mm cutting edge; used to open scalp</td></tr><tr><td>Scissor: Student Vannas (scissor #3)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91501-09</td><td>1; curved; used to mince brain tissue</td></tr><tr><td>Forcep: Dumont #7&lt;br/&gt; (forcep #1)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91197-00</td><td>2; used to secure nose and remove cortices&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Forcep: Dumont #2&lt;br/&gt; (forcep #2)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td>1; used to remove scalp</td></tr><tr><td>Forcep: Dumont #3&lt;br/&gt; (forcep #3)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-30</td><td>1; used to remove skull</td></tr><tr><td>Forcep: Dumont #5a&lt;br/&gt; (forcep #4)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-21</td><td>1; used to remove meninges</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Table of Specific Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zoom Stereo Dissection Microscope&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>SZ4060</td><td>Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet</td></tr><tr><td>Laminar-Horizontal Flow Cabinet</td><td>Nuaire</td><td>NU-201-330</td><td></td></tr><tr><td>Biological Safety Cabinet</td><td>Labconco</td><td>3440001</td><td>Class II</td></tr><tr><td>Water-Jacketed CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubator</td><td>VWR</td><td>97025-836</td><td>Set to 37 &amp;deg;C, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Swing-out buckets</td><td>Fisher Scientific</td><td>75006441</td><td>To be used with Swing-out rotor</td></tr><tr><td>Swing-out Rotor</td><td>Fisher Scientific</td><td>75006445</td><td>Max Radius: 19.2 (cm)</td></tr><tr><td>Sorvall Legend RT+ Centrifuge&lt;br/&gt; (clinical centrifuge)</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-004-377</td><td>With swing-out rotor</td></tr><tr><td>AccuSpin Micro 17 microcentrifuge&lt;br/&gt; (tabletop microcentrifuge)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S98645</td><td>With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; Cat #: 75003524)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

isolation of cortical microglia with preserved immunophenotype and functionality from murine neonates

Die Isolierung der Mikroglia von ZNS-Gewebe ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um investigative Mikroglia Biologie studieren ex vivo. Das vorliegende Verfahren Details ein Verfahren zur Isolierung von murinen Mikroglia von neonatalen Kortex durch mechanische Bewegung mit einem Rotationsschüttler. Diese Methode liefert Mikroglia Isolierung hochreiner kortikalen Mikrogliazellen, die morphologischen und funktionellen Eigenschaften in normalen, nicht pathologischen Bedingungen in vivo bezeichnend für Ruhe Mikroglia aufweisen. Dieses Verfahren bewahrt auch die Mikro Immunphänotyps und biochemischen Funktionen, wie durch die Induktion der morphologischen Veränderungen, die nukleäre Translokation der p65-Untereinheit von NF-kB (p65), und Sekretion des proinflammatorischen Zytokins Markenzeichen, Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α nachgewiesen ), auf Lipopolysaccharide (LPS) und Pam 3 4 CSK (Pam) Herausforderungen. Daher erhält das vorliegende Verfahren die Isolierung Immunophänotyp sowohl Ruhe und aktivierenviert Mikroglia und bietet eine experimentelle Methode zur Untersuchung der Biologie in Mikroglia ex vivo-Bedingungen.

Beibehaltung der Immunphänotyp und Funktionalität der Mikroglia ex vivo während der Isolierung ist entscheidend, um in der Lage, diese Zellen als Untersuchungsmodell für Mikro Biologie zu nutzen. Um die erfolgreiche Konservierung von Mikroglia immunofunctionality Verwendung des vorliegenden Verfahrens zu demonstrieren, isolierten wir kortikalen Mikrogliazellen von P3 Neugeborenen (CX3CR1-GFP + / - und C57BL / 6) und behandelten Kulturen entweder mit LPS oder Pam. Wie ...

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Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Ein Schlüssel zur erfolgreichen Untersuchung der Mikroglia-Biologie ist die Erhaltung der Immunfunktion Mikroglia ex vivo bei der Isolierung von ZNS-Gewebe. Trenn Mikroglia über Dreh Schütteln Ergebnisse in hochreiner und immunofunctional Zellkulturen durch Fluoreszenz-Bildgebung, Immunzytochemie, und ELISA folgenden Mikroglia-Aktivierung mit der proinflammatorische Stimuli Lipopolysaccharide (LPS) und Pam 3 4 CSK (Pam) bewertet.

Isolation kortikaler Mikroglia mit bewahrten Immunophänotyp und Funktionalität aus Murine Neugeborene

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

isolation-cortical-microglia-with-preserved-immunophenotype

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.7K Aufrufe.  Georgetown University Medical Center.  Ein Schlüssel zur erfolgreichen Untersuchung der Mikroglia-Biologie ist die Erhaltung der Immunfunktion Mikroglia ex vivo bei der Isolierung von ZNS-Gewebe. Trenn Mikroglia über Dreh Schütteln Ergebnisse in hochreiner und immunofunctional Zellkulturen durch Fluoreszenz-Bildgebung, Immunzytochemie, und ELISA folgenden Mikroglia-Aktivierung mit der proinflammatorische Stimuli Lipopolysaccharide (LPS) und Pam 3 4 CSK (Pam) bewertet. 

Serie: Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Microglia account for approximately 12% of the total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered the major cell types of the nervous system, microglia play a significant role in normal brain physiology by monitoring tissue for debris and pathogens and maintaining homeostasis in the parenchyma via phagocytic activity 1,2. Microglia are activated during a number of injury and disease conditions, including neurodegenerative disease, traumatic brain injury, and nervous system infection 3. Under these activating conditions, microglia increase their phagocytic activity, undergo morpohological and proliferative change, and actively secrete reactive oxygen and nitrogen species, pro-inflammatory chemokines and cytokines, often activating a paracrine or autocrine loop 4-6. As these microglial responses contribute to disease pathogenesis in neurological conditions, research focused on microglia is warranted.
	Due to the cellular heterogeneity of the brain, it is technically difficult to obtain sufficient microglial sample material with high purity during in vivo experiments. Current research on the neuroprotective and neurotoxic functions of microglia require a routine technical method to consistently generate pure and healthy microglia with sufficient yield for study. We present, in text and video, a protocol to isolate pure primary microglia from mixed glia cultures for a variety of downstream applications. Briefly, this technique utilizes dissociated brain tissue from neonatal rat pups to produce mixed glial cell cultures. After the mixed glial cultures reach confluency, primary microglia are mechanically isolated from the culture by a brief duration of shaking. The microglia are then plated at high purity for experimental study.
	The principle and protocol of this methodology have been described in the literature 7,8. Additionally, alternate methodologies to isolate primary microglia are well described 9-12. Homogenized brain tissue may be separated by density gradient centrifugation to yield primary microglia 12. However, the centrifugation is of moderate length (45 min) and may cause cellular damage and activation, as well as, cause enriched microglia and other cellular populations. Another protocol has been utilized to isolate primary microglia in a variety of organisms by prolonged (16 hr) shaking while in culture 9-11. After shaking, the media supernatant is centrifuged to isolate microglia. This longer two-step isolation method may also perturb microglial function and activation. We chiefly utilize the following microglia isolation protocol in our laboratory for a number of reasons: (1) primary microglia simulate in vivo biology more faithfully than immortalized rodent microglia cell lines, (2) nominal mechanical disruption minimizes potential cellular dysfunction or activation, and (3) sufficient yield can be obtained without passage of the mixed glial cell cultures.
	It is important to note that this protocol uses brain tissue from neonatal rat pups to isolate microglia and that using older rats to isolate microglia can significantly impact the yield, activation status, and functional properties of isolated microglia. There is evidence that aging is linked with microglia dysfunction, increased neuroinflammation and neurodegenerative pathologies, so previous studies have used ex vivo adult microglia to better understand the role of microglia in neurodegenerative diseases where aging is important parameter. However, ex vivo microglia cannot be kept in culture for prolonged periods of time. Therefore, while this protocol extends the life of primary microglia in culture, it should be noted that the microglia behave differently from adult microglia and in vitro studies should be carefully considered when translated to an in vivo setting.

Isolating primary microglia from the cellular heterogeneity of the brain is essential to investigate their role in both physiological and pathological conditions. This protocol describes a mechanical isolation and mixed cell culture technique that provides high yield and high purity, viable primary microglial cells for in vitro study and downstream applications.

Primäre Mikroglia Isolation vom gemischten Zellkulturen von Gliazellen Neonatal Rattenhirngewebe

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Kultivierung Mikroglia aus dem Neugeborenen und Erwachsenen Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. Microglia are mesodermal cells that function similarly to macrophages in surveying inflammatory stress. The classical (M1-type) and alternative (M2-type) activations of macrophages have also been extended to microglia in an effort to better understand the underlying interplay these phenotypes have in neuroinflammatory conditions such as Parkinson&#39;s, Alzheimer&#39;s, and Huntington&#39;s Diseases. In vitro experimentation utilizing primary microglia offers rapid and reliable results that may be extended to the in vivo environment. Although this is a clear advantage over in vivo experimentation, isolating microglia while achieving adequate yields of optimal purity has been a challenge. Common methods currently in use either suffer from low recovery, low purity, or both. Herein, we demonstrate a refinement of the column-free CD11b magnetic separation method that achieves a high cell recovery and enhanced purity in half the amount of time. We propose this optimized method as a highly useful model of primary microglial isolation for the purposes of studying neuroinflammation and neurodegeneration.

Here, we present a protocol to isolate microglia from postnatal mouse pups (day 1) for in vitro experimentation. This improvised method of isolation generates both high yield and purity, a significant advantage over alternate methods that allows broad range experimentation for the purposes of elucidating microglial biology.

Schnelle und Refined CD11b Magnetic Isolierung von primären Mikroglia mit erhöhter Reinheit und Vielseitigkeit

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Neurowissenschaften

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during development, homeostasis, and disease. Although macrophages have been studied in detail for decades, specialized features of microglia, the tissue-resident macrophages of the CNS, have remained largely mysterious, in part due to limitations in the ability to recapitulate mature microglial properties in culture. Here, we illustrate a straightforward procedure for the rapid isolation of pure microglia from the mature rodent brain. We also describe serum-free culture conditions that support high levels of microglial viability over time. Microglia cultured under these defined-medium conditions exhibit elaborate ramified processes and dynamic surveillance behavior. We illustrate some effects of serum exposure on cultured microglia and discuss how these serum-free cultures compare to both serum-exposed cultures as well as microglia in vivo.

Efforts to understand microglial function in detail have been hindered by the lack of microglial culture models that recapitulate the properties of mature in vivo microglia. This protocol describes an isolation and culture approach designed to maintain robust survival of highly ramified mature rat microglia under defined-medium conditions.

Isolation und Kultur von Nagetier Microglia zur Förderung einer dynamisches verzweigt Morphologie in serumfreien Medium

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive human diseases. Considerable advances have been made to uncover the molecular signatures of homeostatic microglia as well as alterations of their gene expression in response to environmental stimuli. With the advent and maturation of single-cell genomic methodologies, it is increasingly recognized that heterogenous microglia may underlie the diverse roles they play in different developmental and pathological conditions. Further dissection of such heterogeneity can be achieved through efficient isolation of microglia from a given region of interest, followed by sensitive profiling of individual cells. Here, we provide a detailed protocol for the rapid isolation of microglia from different brain regions in a single adult mouse brain hemisphere. We also demonstrate how to use these sorted microglia for plate-based deep single-cell RNA sequencing. We discuss the adaptability of this method to other scenarios and provide guidelines for improving the system to accommodate large-scale studies.

We provide a protocol for isolation of microglia from different dissected regions of an adult mouse brain hemisphere, followed by semi-automated library preparation for deep single-cell RNA sequencing of full-length transcriptomes. This method will help to elucidate functional heterogeneity of microglia in health and disease.

Isolierung von regionsspezifischer Mikroglia von einer Erwachsenenmaus Gehirnhälfte für tiefe einzellige RNA-Sequenzierung

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

Dissektion und Isolierung von murinen Glia aus mehreren Regionen des zentralen Nervensystems

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Primary Microglia Isolation from Postnatal Mouse Brains

Microglia are the mononuclear phagocytes in the central nervous system (CNS), which play key roles in maintaining homeostasis and regulating the inflammatory process in the CNS. To study the microglial biology in vitro, primary microglia show great advantages compared to immortalized microglial cell lines. However, microglia isolation from the postnatal mouse brain is relatively less efficient and time-consuming. In this protocol, we provide a quick and easy-to-follow method to isolate primary microglia from the neonatal mouse brain. The overall steps of this protocol include brain dissection, primary brain cell culture, and microglia isolation. Using this approach, researchers can obtain primary microglia with high purity. In addition, the harvested primary microglia were able to respond to the lipopolysaccharides challenge, indicating they retained their immune function. Collectively, we developed a simplified approach to efficiently isolate primary microglia with high purity, which facilitates a wide range of microglial biology investigations&#160;in vitro.

Primary cell culture is one of the primarily used approaches for studying microglial biology in vitro. Here, we developed a method for simple and rapid microglia isolation from the mouse postnatal day 1 (P1) to P4.

Microglia are the mononuclear phagocytes in the central nervous system (CNS), which play key roles in maintaining homeostasis and regulating the ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. Microglia can adopt a large spectrum of activation phenotypes. Moreover, microglia that endorse pro-inflammatory phenotype is associated with both neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. In vitro studies are widely used in research to evaluate potential therapeutic strategies in specific cell types. In this context studying microglial activation and neuroinflammation in vitro using primary microglial cultures is more relevant than microglial cell lines or stem-cell-derived microglia. However, the use of some primary cultures might suffer from a lack of reproducibility. This protocol proposes a reproducible and relevant method of magnetically isolating microglia from neonate pups. Microglial activation using several stimuli after 4 h and 24 h by mRNA expression quantification and a Cy3-bead phagocytic assay is demonstrated here. The current work is expected to provide an easily reproducible technique for isolating physiologically relevant microglia from juvenile developmental stages.

Primary microglia cultures are commonly used to evaluate new anti-inflammatory molecules. The present protocol describes a reproducible and relevant method to magnetically isolate microglia from neonate pups.

Magnetische Isolierung von Mikrogliazellen aus neugeborener Maus für primäre Zellkulturen

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Isolation of Microglia from the Cortex of an Adult Mouse Brain

Source: Zhou, L., et al., <a href="https://app.jove.com/v/60347">Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing.</a> J. Vis. Exp. (2019)
The video demonstrates a technique for isolating microglia from the cortex of an adult mouse brain. First, the cortex undergoes segmentation and homogenization to remove neurons and other glial cells, preserving microglia. Following that, the cell suspension is exposed to anti-myelin magnetic microbeads and a magnetic field, effectively separating microglia and myeloid cells from myelin debris and cells containing myelin.

Isolierung von Mikroglia aus der Hirnrinde eines adulten Mausgehirns

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Mechanical Tissue Dissociation
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JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

Neuronal Culture Techniques

Primary Neuronal Culture

Magnetic Isolation of Microglia from Mouse Pup Brains

Source: Bokobza, C. et al., <a href="https://app.jove.com/v/62964">Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures.</a> J. Vis. Exp. (2022)
In this video, we describe a protocol for isolating CD11b cells, including microglia, from mouse pup brains using magnetic-activated cell sorting. The brain tissues are homogenized to obtain single-cell suspensions, which are incubated with anti-CD11b antibody-coated microbeads, followed by a magnetic column-based separation to purify the CD11b+ cell population.

Magnetische Isolierung von Mikroglia aus dem Gehirn von Maus-Welpen

Source: Bokobza, C. et al., Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures. J. Vis. Exp. (2022)
In this video, we ...