Dieses Protokoll ermöglicht es uns, Mikroglia unter Bedingungen zu kultivieren, die die In-vivo-Eigenschaften genau nachahmen. Mit Hilfe der Magnetzellensortiertechnologie ermöglicht uns unser Protokoll, Mikroglia nur zwei Tage in vitro zu stimulieren, ohne Serum im Kulturmedium zu verwenden. Verwenden Sie zunächst eine kleine Schere, um die Haut vom Hals bis zur Nase zu schneiden, indem Sie der sagittalen Naht von 15 bis 20 Millimetern folgen.
Führen Sie die Spitzen mit dem Foramen magnum parallel zum Schädel ein. Von jeder Seite zu den Augen schneiden. Mit einer kleinen Schere zwischen die Augen schneiden, um den Schädel und das Gehirn vom Kopf zu lösen.
Greifen Sie den Schädel mit zwei Pinzetten in der Nähe der Riechkolben und reißen Sie vorsichtig den Schädel auf. Entfernen Sie mit einer Rasierklinge das Kleinhirn und die olfaktorische Birne und schneiden Sie das Gehirn in zwei Stücke. Legen Sie die Gehirnstücke in eine Petrischale mit 40 Milliliter HBSS ohne Kalzium und Magnesium.
Dissoziationsmischung gemäß dieser Tabelle vorbereiten. Übertragen Sie 12 Gehirnstücke in ein C-Röhrchen für ein Gesamtgewicht von 1,2 Gramm pro Dissoziationsröhrchen. Legen Sie dann C-Rohre auf den Dissoziator mit Erwärmung.
Starten Sie das optimierte NTDK-Programm im Dissoziator. Zentrifugieren für 20 Sekunden. Schließen Sie die mechanische Dissoziation durch dreimaliges Pipettieren ab.
Die Zellen werden in vier 15-Milliliter-Röhrchen mit angebrachten Sieben überführt. Spülen Sie die Siebe mit 10 Milliliter HBSS mit Kalzium und Magnesium ab. 10 Minuten zentrifugieren und den Überstand mit einer 10-Milliliter-Pipette entfernen.
Fügen Sie vorsichtig 10 Milliliter HBSS mit Kalzium und Magnesium hinzu und suspendieren Sie das Pellet erneut. Wieder zentrifugieren und den Überstand entfernen. Suspendieren Sie das Pellet mit sechs Milliliter Sortierpuffer.
Wiederholen Sie die Zentrifugation und verwerfen Sie den Überstand. Dann fügen Sie 200 Mikroliter CD11b-Mikroperlenlösung hinzu und inkubieren Sie die Röhrchen für 15 bis 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Inkubation suspendieren Sie das Pellet mit sechs Milliliter Sortierpuffer.
Wiederholen Sie die Zentrifugation und suspendieren Sie das Pellet mit acht Milliliter Sortierpuffer. Folgen Sie als Nächstes dem Possel-Programm auf dem Trennzeichen, um acht Spalten vorzubereiten. Führen Sie die Zellen durch die Säule, indem Sie jeweils einen Milliliter Zellsuspension hinzufügen.
Mit einem Milliliter Sortierpuffer CD11b-positive Zellen auf einer sterilen Elutionsplatte eluieren. Bündeln Sie die Zellen in einem 50-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren und suspendieren Sie das Pellet mit 10 Milliliter kaltem Mikrogliamedium.
Zählen Sie die CD11b-positiven Zellen. Resuspendieren Sie die Zellen in kaltem Mikrogliamedium, um eine Endkonzentration von 650.000 bis 700.000 Zellen pro Milliliter zu erhalten. Die Suspension wird in Zellkulturplatten abgegeben.
Die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid inkubieren. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium durch ein vorgewärmtes Mikrogliamedium und wiederholen Sie die Inkubation über Nacht. Stimulieren Sie die Zellen vor diesem Schritt und führen Sie während der letzten drei Stunden der Stimulation einen phagozytischen Assay durch.
Berechnen Sie die Anzahl der Perlen gemäß dieser Tabelle im Verhältnis 50 Perlen pro Zelle. Bereiten Sie die Perlenmischung vor. Inkubieren Sie das Röhrchen für eine Stunde in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius.
Wirbel alle 10 Minuten. Zu jeder Vertiefung das berechnete Volumen der Perlenlösung hinzufügen und drei Stunden lang inkubieren. Mit diesem Ansatz wurde die phagozytische Aktivität von Mikroglia nach Stimulation durch entzündungsfördernde Faktoren wie Interleukin-1 beta plus Interferon gamma oder Lipopolysaccharide bewertet.
Nach sechs- bis 24-stündiger Stimulation wurden fluoreszierende Cy3-Mikroglia-Beads konfokalmikroskopisch analysiert. Nach sechs Stunden beginnen Mikroglia, Cy3-Perlen nur unter Interleukin-1 beta plus Interferon-gamma-Bedingung zu phagozyten. Nach 24 Stunden gab es einen Anstieg der Cy3-Fluoreszenz für beide Arten der Stimulation, was eine erhöhte phagozytische Aktivität hervorhob.
Die Reinheit der Mikrogliakultur wurde durch Durchflusszytometrie erhöht, was eine Erhöhung der Zelllebensfähigkeit nach der Sortierung zeigte. Mit Hilfe von Durchflusszytometrie und RT-qPCR wurden Zellpopulationsmarker vor und nach dem Sortieren von CD11b-positiven Zellen aus Mäusegehirnen am postnatalen achten Tag analysiert. Diese Analysen unterschieden verschiedene Gehirnzellpopulationen, wie CX3CR135 für Mikroglia, O4 oder OLIG2 für Oligodendrozyten, NeuN oder Synaptophysin für Neuronen und ACSA-2 oder GFAP für Astrozyten.
Nach der Zellsortierung mit CD11b-Antikörpern wurden nur Mikroglia erhalten. Es ist wichtig, sehr vorsichtig zu pipettieren, während die Suspension in die Säule gegeben wird, um Verstopfungen zu vermeiden und den mechanischen Zelltod zu vermeiden. Nach dieser Methode kann transkriptomische Proteomik wie westliches Blut oder Luminex und sogar Immunchemie durchgeführt werden, um die Wirkung der Mikrogliastimulation zu sehen.
