Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es weniger arbeitsintensiv und zeitaufwendig ist als die traditionelle Methode zur Zählung koloniebildender Einheiten, um das intrazelluläre Wachstum von Mycobacterium tuberculosis abzuschätzen. Diese Technik erleichtert es Forschern, von der FDA zugelassene Medikamente schnell zu untersuchen, um sie als wirtsgerichtete Therapien zur Behandlung von Tuberkulose wiederzuverwenden. Die Methode ist sehr einfach und unkompliziert.
Grundkenntnisse über mykobakterielle und EO-Träger-T-Zell-Kulturtechniken würden ausreichen, um dem Protokoll Schritt für Schritt zu folgen. Zunächst werden sechs bis acht Milliliter abgeschwächte mykobakterielle Kultur H37Ra aus dem T25-Kolben in ein 15-Milliliter-Polypropylenrohr überführt. Zentrifugieren Sie das Röhrchen in einer Tischzentrifuge.
Nachdem Sie das Röhrchen vorsichtig entfernt haben, geben Sie das Röhrchen in den biologischen Sicherheitsschrank und warten Sie eine Minute, bis sich die Bakterien abgesetzt haben. Gießen Sie den Überstand in den Desinfektionsmittel-Entsorgungsbehälter. Verschließen Sie dann die Röhre und suspendieren Sie die Bakterien im verbleibenden Medium, indem Sie vorsichtig auf die Seite der Röhre klopfen und die Bakterien für eine Minute absetzen lassen.
Fügen Sie zwei Milliliter vorgewärmtes komplettes RPMI hinzu, mischen Sie es und geben Sie es in ein 50-Milliliter-konisches Röhrchen. Um die Mykobakterien zu resuspendieren, ziehen Sie die Suspension in eine Fünf-Milliliter-Spritze, die mit einer 25-Gauge-Nadel ausgestattet ist. Werfen Sie dann sehr vorsichtig die Seitenwand des Röhrchens hinunter, um die Aerosolproduktion zu minimieren, und wiederholen Sie den Vorgang sechs bis acht Mal.
Entsorgen Sie die Nadel und die Spritze in einem scharfen Behälter im Biosicherheitswerkbänke. Die Suspension in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen geben und zentrifugieren, um verbleibende Klumpen abzuspritzen. Bringen Sie das Röhrchen in den Sicherheitsschrank zurück und lassen Sie die Bakterien eine Minute lang absetzen.
Die oberen 1 bis 1,5 Milliliter des Überstands in ein neues Röhrchen überführen. Entsorgen Sie das Originalrohr im Abfalleimer mit dem Desinfektionsmittel. Gut mischen und verschiedene Mengen der mykobakteriellen Suspension zu den beiden Brunnenglaskammerobjektträgern geben und die Objektträger drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Nachdem Sie dreimal auf und ab pipettiert haben, um nicht-phagozytierte Bakterien zu entfernen, entfernen Sie das Medium aus dem Glaskammerobjektträger. Einmal mit zwei Milliliter PBS waschen. Die Aliquots von 4% PFA in PBS, die bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden, auftauen.
Verdünnen Sie das Aliquot auf 2% PFA und fügen Sie zwei Milliliter zu jeder Vertiefung hinzu. Nach 10 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur den Objektträger zur Färbung aus dem Sicherheitsschrank entfernen. Entsorgen Sie PFA im PFA-Chemikalienabfallbehälter und waschen Sie den Objektträger unter einem sanften Leitungswasserstrahl.
Geben Sie mit einer Kunststofftransferpipette genügend Auramin ab, um die Zellen auf dem Objektträger zu bedecken, und inkubieren Sie den Objektträger eine Minute lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Waschen Sie überschüssigen Farbstoff mit Leitungswasser vom Objektträger ab und fügen Sie den Quencher für eine Minute im Dunkeln hinzu. Nach dem Abwaschen des überschüssigen Quenchers 15 Minuten bei Raumtemperatur mit Hoechst-Färbung im Dunkeln inkubieren.
Dann den Hoechst-Fleck abwaschen. Und nachdem Sie überschüssiges Wasser abgelassen haben, fügen Sie einen Tropfen Antifade und einen Deckschein hinzu. Untersuchen Sie den luftgetrockneten Objektträger unter dem Fluoreszenzmikroskop mit dem 100x Ölobjektiv.
Mykobakterien fluoreszieren grün unter Fitz-Filter und Kerne fluoreszieren blau unter DAPI-Filter. Zählen Sie die Anzahl der pro Zelle phagozytierten Mykobakterien und den Prozentsatz der infizierten Zellen, um MOI zu bestimmen. Berechnen Sie das Volumen der Mykobakteriensuspension, die benötigt wird, um den erforderlichen MOI basierend auf der Oberfläche einer Vertiefung in der Platte zu erreichen.
Nach dem Mischen der Mykobakteriensuspension das berechnete Volumen den Zellen auf 12 Well-Platten hinzufügen, um den gewünschten MOI zu erreichen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für drei Stunden, damit Mykobakterien phagozytiert werden können. Entfernen Sie dann die extrazellulären Bakterien, indem Sie die Vertiefungen mehrmals mit warmem RPMI waschen.
Fügen Sie 500 Mikroliter Lysepuffer für 10 Minuten hinzu, um die Makrophagen in einer Vertiefung der dreistündigen Probe zu lysieren, und sammeln Sie das Lysat, um die Ausgangsinfektionsrate zu bestimmen. Fügen Sie dann frisches vollständiges RPMI und erforderliche Medikamentendosen oder Fahrzeugkontrolle zu den verbleibenden Bohrlöchern hinzu. Inkubieren Sie die Platten im Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius für ein bis acht Tage, je nach Versuchsplan.
Um die prozentuale Zeit bis zur Positivität oder TTP des anfänglichen Inokulums der dreistündigen Probe zu bestimmen, erwärmen Sie Middlebrook-Brühe und Instrumentenkulturflaschen auf Raumtemperatur. Übertragen Sie das Medium von der 12-Well-Platte in die entsprechenden beschrifteten konischen Röhrchen und fügen Sie jedem Well 500 Mikroliter sterilen Lysepuffer hinzu. Nach 10 Minuten kratzen Sie die Zellen vorsichtig mit einem sterilen Schaber aus dem Brunnen und kombinieren Sie sie mit dem Medium im entsprechenden konischen Röhrchen.
Sobald die Vertiefung mit 0,5 Milliliter sterilem PBS gewaschen und mit dem Medium und dem Lysat kombiniert wurde, brechen Sie die Klumpen, indem Sie jede Probe sechs bis acht Mal vorsichtig durch eine 25-Gauge-Nadelspritze führen. Verdünnen Sie die Probe in MB-Brühe, indem Sie 900 Mikroliter MB-Brühe zu 100 Mikrolitern Probe hinzufügen und den Erntevorgang zu den erforderlichen Zeitpunkten während der Inkubation wiederholen. Bereiten Sie die Kombiinstrumentflaschen vor, indem Sie die Gummikappe mit 70% Alkohol sterilisieren.
Füllen Sie genügend Nahrungsergänzungsmittel für alle Proben in ein konisches Röhrchen und injizieren Sie mit Nadel und Spritze 0,5 Milliliter Nährstoffergänzung in die Instrumentenkulturflasche. Dann pipettieren Sie 500 Mikroliter der eins zu 10 verdünnten Probe in einem Ein-Milliliter-V-Bodenrohr. Verwenden Sie eine Nadel und eine Spritze, um die 500 Mikroliter Probe in die zugewiesenen Instrumentenkulturflaschen zu injizieren.
Nachdem Sie die Flaschen vorsichtig von der Biosicherheitswerkbank zum Beladungsinstrument transportiert haben, drücken Sie die Ladetaste am automatisierten mikrobiellen Nachweissystem. Scannen Sie die Barcodes auf Instrumentenkulturflaschen und legen Sie die Flaschen bis zu 42 Tage lang bei 37 Grad Celsius in den Inkubator des Detektionssystems. Lesen und notieren Sie die Zeit, die benötigt wird, um eine Positivität vom Instrumentenbildschirm zu erreichen, und berechnen Sie den prozentualen TTP.
Ein positiver TTP zeigt ein mykobakterielles Wachstum an. Das automatisierte Flüssigkulturinstrument überwachte alle 10 Minuten den Kohlendioxidgehalt und berechnete die TTP, d. h. die Anzahl der Tage von der Impfung, bis die Kulturen als positiv gekennzeichnet wurden. Eine inverse Beziehung zwischen TTP- und log(10)-Werten der KBE im initialen Inokulum wurde veranschaulicht.
Wenn das intrazelluläre Wachstum von Mycobacterium tuberculosis in Makrophagen, das durch Zählung von CFU bestimmt wurde, mit der beschriebenen automatisierten Kulturmethode verglichen wurde, wurde eine signifikante Korrelation zwischen den Ergebnissen erzielt. Das Wachstum von Mycobacterium tuberculosis wurde grafisch dargestellt, indem die TTB-Werte für bis zu acht Tage nach der Infektion von Makrophagen mit dem ursprünglichen TTP-Wert verglichen wurden. Ein ähnlicher Trend zwischen KBE und Flüssigkultur zeigte eine signifikante Hemmung des Wachstums von Mycobacterium tuberculosis in Makrophagen in Gegenwart von all-trans-Retinsäure oder AtRA in Lösung oder der Äquivalentdosis von AtRA, die in PLGA-Mikropartikeln verkapselt ist.
Ein Dosis-Wirkungs-Experiment wurde in infizierten THP-1-Zellen durchgeführt, um die Wirksamkeit des Antibiotikums Linezolid allein oder der Kombination von Linezolid und Interferon gamma zu bestimmen. Es wurde keine signifikante Wechselwirkung zwischen den Arzneimitteln beobachtet. Die AFP-Färbung ermöglicht es uns, einen niedrigen MOI zu verwenden, um den Zelltod bei der Infektion von Makrophagen zu minimieren und sicherzustellen, dass unabhängig von der verwendeten Behandlung dasselbe MOI verwendet wird.
Nach diesem Protokoll können führende Anti-TB-Medikamente identifiziert und weiter untersucht werden, um ihre In-vivo-Wirksamkeit zu untersuchen.
