This work was supported by an Avenir/ATIP grant to Matteo Bonazzi and a Marie Curie CIG (N&#176; 293731) to Eric Martinez. The authors would like to thank Dr. Robert Heinzen for sharing C. burnetii strains, antibodies and tools, Virginie Georget and Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) for their technical assistance and data analysis.

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial interests.

Die Studie von Wirt / Pathogen-Interaktionen hat sich als bemerkenswert Verfahren, um bakterielle Infektionen zu verstehen und zu entwickeln alternative Strategien zur Infektionskrankheiten entgegenzuwirken. Aufgrund der Vielfalt der Strategien durch verschiedene bakterielle Erreger ausgearbeitet, die Identifizierung und Charakterisierung von bakteriellen Virulenzfaktoren und des Host-Signalwege, die bei Infektionen abzielen stellen jedoch eine echte Herausforderung. Dies erfordert die Entwicklung neuer Konzepte für die Groß Identifizierung von Schlüssel Wirt / Pathogen-Interaktion Hubs. Die jüngste Entwicklung von innovativen, Hochdurchsatz-und High-Content-Screening-Verfahren stellt eine wertvolle Ressource, die sich dem Studium der intrazelluläre bakterielle Erreger 15 angepasst werden kann. Hier haben wir die zoonotische bakteriellen Erreger Coxiella burnetii als Modell verwendet werden, um Screening-Ansätze, die Transposon-Mutagenese und fluoreszenzbasierte Tests zu kombinieren zu entwickeln. Importantly ermöglicht diese Screening-Verfahren die gleichzeitige Überwachung mehrerer Schritte des Coxiella intrazellulären Zyklus und bietet eine globale Übersicht über die durch dieses Bakterium entwickelt zu erobern, zu replizieren und bleiben in infizierten Zellen Strategien. Der hier beschriebene Ansatz basiert auf zwei etablierte Techniken, Transposon-Mutagenese und fluoreszenzbasierte Tests, die erfolgreich auf das Studium der bakteriellen Erreger angewendet wurden basierend. Die Kombination dieser Techniken, die in Zusammenhang mit der Hochdurchsatz / High-Content-Bildschirme ermöglicht es, die Auswirkungen einer Anzahl von Bakterien Mutationen durch die Analyse einer sehr hohen Anzahl von Ereignissen (typischerweise 15.000 infizierten Zellen pro Bakterien Mutationen werden abgebildet und analysiert) auszuwerten. Dies stellt eine wichtige statistische Analyse der Ereignisse, wie bakterielle Invasion von Wirtszellen und die intrazelluläre Replikation, die sind von Natur aus mit hoher Variabilität. Es ist wichtig zu beachten, dass Zelllinien mit Ausnahme epithelial können für diese Art von Screening verwendet werden. Allerdings sind flach und große Epithelzellen optimal für die Bildanalyse als Wirtszellorganellen sind leichter zu erkennen. Da die Mehrzahl der automatisierten Mikroskopen automatisch verarbeiten eine Vielzahl von Platten, gibt es praktisch keine Grenzen für die Anzahl von Mutanten, die gleichzeitig untersucht werden können. Abhängig von dem Pathogen, kann der Benutzer Berechtigung der Verwendung eines Epifluoreszenz oder einem konfokalen Mikroskop. Die Zeit der Bildaufnahme wird überwiegend abhängig von der Empfindlichkeit der Mikroskopkamera, auf die Anzahl der Felder pro Vertiefung und der Anzahl der Kanäle pro Sichtfeld erfasst erworben. Der Benutzer kann entscheiden, wie diese Faktoren anpassen, um die Screening-Protokoll zu optimieren. Als ein Beispiel abgebildet wir eine Platte mit 96 Vertiefungen / h unter Verwendung der in Punkt 5.1 genannten Bedingungen. Bildanalyse hängt weitgehend von der verwendeten Maschine (oder Gruppe von Maschinen). Wir verwenden eine 12-Core (2 x 3.06 GHz 6-Core), 48 GB RAM Workstation. Diese Maschine erfordert Angleirungsweise 40 Minuten, um Bilder von einer Platte erworben zu analysieren. Ein wichtiger Aspekt in Betracht gezogen werden, bei der Entwicklung dieser Assays ist die Menge von neuen (oder die Optimierung von bestehenden) Protokollen, um die Manipulation und Verarbeitung einer großen Anzahl von Proben ermöglicht. Ein typisches Beispiel ist die Entwicklung der einzelnen Primer Kolonie-PCR-Ansatz, der uns schnell verstärken und erlaubt Sequenz Coxiella DNA-Fragmente, die die Stelle der Insertion jedes Transposon, aus sehr kleinen Proben. Basierend auf unserer Erfahrung, hat die High-Fidelity-Polymerase an sorgfältig ausgewählte und um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten getestet werden. Die einzige Begrenzung dieses Ansatzes kann in der Beobachtung, daß in den meisten Fällen etwa 30% der verarbeiteten Proben sind nicht ausnutzbar verbergen, entweder aufgrund der PCR oder Sequenzierungsschritten. Berücksichtigt man jedoch, daß die Isolierung neuer Coxiella Transposon-Mutanten keine geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist, bedeutet dies nicht REPREschickte ein wichtiges Thema. In ähnlicher Weise die Entwicklung eines zuverlässigen Test zur Bestimmung des Bakterienkonzentration von mutierten Bestände quantifizieren war der Schlüssel für diesen Ansatz. Aufgrund der Tendenz von Coxiella zu aggregieren, wenn sie in Suspension, ist die Verwendung von Ablesungen der optischen Dichte nicht anwendbar, um die Konzentration von Coxiella Kulturen und der einzigen Alternative war quantitative PCR (qPCR) zu berechnen. Hierbei ist die Verwendung einer fluoreszenzmarkierten DNA interkalierende Mittel signifikant Bakterioplankton Quantifizierung beschleunigt. Dieser Ansatz kann auch die Vorteile der Verwendung von stabilen Zelllinien, die Fluoreszenzmarker für mehrere intrazelluläre Kompartimente in Abhängigkeit von dem Erreger eingesetzt. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Verwendung von Zellkulturmedien frei von Phenolrot. Wir beobachteten, dass dieser pH-Indikator hat eine natürliche Fluoreszenz überspannt den roten und grünen Spektrum, das die auf der automatisierten Fluoreszenzreader aufgezeichnete Signal sättigt. Ter hier vorgestellte Strategie beruht auf Zufalls Transposon-Mutagenese. Bei den Mutanten von Interesse, empfehlen wir die Validierung einzigartigen Trans (und Klonalität) mit Southern-Blot und PCR-Amplifikationen der Transposoninsertion Website. Neben der im Protokoll beschrieben Ausrüstung, Teams Interesse an der Nutzung der Screening-Ansatz hier präsentiert wird, werden große Vorteil in der Aufbau einer relationalen Datenbank für die Datensammlung, einem Server für die Datenspeicherung und einer Arbeitsstation für die schnelle Bildanalyse zu nehmen. Wichtig ist, dass die hier beschriebene Methode ist für die Untersuchung von anderen intrazellulären bakteriellen Pathogenen geeignet vorgesehen eine zufällige Mutagenese-Verfahren für den Erreger vorhanden ist, können Zelllinien durch das Pathogen infiziert sein und diese zeigt einen spezifischen Phänotyp während der Infektion.

Die Schwellen, endemische Bakterium Coxiella burnetii ist für große Ausbrüche von Q-Fieber, eine schwächende Grippe-ähnliche Zoonose mit schweren gesundheitlichen und wirtschaftlichen Auswirkungen 1 verantwortlich. Die wichtigsten Lagerstätten von Coxiella sind Haus- und Nutztieren, und es wird geschätzt, dass mehr als 90% der Milchviehhaltung in den USA durchzuführen C. burnetii 2. Der Mensch ist ein versehentliches Hosts, die durch Inhalation kontaminierter Aerosole infiziert sind. Menschen Q-Fieber manifestiert entweder als akute oder chronische Krankheit, die tödlichen Komplikationen mit einer Mortalitätsrate erreichte 65% 1,3 haben. Mit einer infektiösen Dosis von 1 - 10 Organismen ist Coxiella das infektiöse Pathogen bekannt und es hat sich als potentielle biologische Waffe 4 untersucht worden. Die jüngste explosive Ausbruch von Q-Fieber in den Niederlanden (2007 - 2010), mit Fällen Eskalation von 182 auf mehr als 2.000 pro Jahr, steht als Beispiel für die schwere Virulenz des Erregers5. Die bemerkenswerte Effizienz Coxiella Infektionen wird wahrscheinlich mit seiner Resistenz gegen Umweltstress, kombiniert mit seiner einzigartigen Anpassung an Wirtszellen verbunden. Tatsächlich ist Coxiella in der Umgebung, in der Form von metabolisch inaktiven kleinzelligem Varianten (SCV), das bemerkenswert beständig gegenüber mehreren harten Bedingungen (Austrocknung, Temperatur, etc.) vorhanden sind. SCVs werden von Fresszellen via α V β 3 Integrin 6 genommen, während Invasion nicht-Fresszellen wird durch die Coxiella Adhäsion / Invasion OmpA 7 und einer noch nicht identifizierten Rezeptor vermittelt. Im Anschluss an die Aufnahme, wohnt Coxiella in eng anliegenden Vakuolen, positiv für den frühen endosomalen Marker Rab5 und EEA1 8. Bakterien reagieren auf endosomalen Ansäuerung durch die Umstellung auf metabolisch aktiven großen Zellvarianten (leichte Nutzfahrzeuge) und Aktivieren eines Dot / Icm Sekretionssystem vom Typ 4 (T4SS) 9, Hoch homolog zu der Legionella pneumophila 10. Die Sekretion von Dot / Icm Effektoren ermöglichen Coxiella, um eine große, LAMP1-positive sauren Raum mit aktiven lysosomalen Enzymen in denen sich Bakterien gedeihen können und aktiv infizierte Zellen vor Apoptose 11 zu erzeugen. Daher wird die intrazelluläre Zyklus Coxiella vom Dot / Icm vermittelte bakterielle Translokation Effektoren 12 gesteuert werden jedoch die mikrobielle Faktoren in Wirtszellinvasion, bakterielle Replikation und Verbreitung der Infektion beteiligt sind heute noch weitgehend unbekannt. Kombinieren Transposon-Mutagenese und Fluoreszenz-basierte Assays, entwickeln wir unvoreingenommene Ansätze zur gleichzeitigen Identifizierung von bakteriellen Faktoren in den Hauptschritten des Coxiella Infektionen beteiligt: ​​1) Internalisierung in Wirtszellen, 2) die intrazelluläre Replikation, 3) Zelle-zu-Zell-Ausbreitung und 4) Ausdauer. Bis heute haben wir mehr als 1.000 m geschirmtutations in 500 Coxiella kodierenden Sequenzen, die uns mit noch nie da gewesenen Einblick in die Wirt-Pathogen-Interaktionen, die Coxiella Pathogenese 7 zu regulieren. Zu beachten ist, kann dieser Ansatz auf die Untersuchung von anderen intrazellulären Krankheitserreger, die Zellbiologie Funktionen mit Coxiella gemeinsam angewendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td align="left">Citric acid</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C0759-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium citrate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S4641-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Potassium phosphate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>60218-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Magnesium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>M2670-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Calcium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Iron sulfate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>F8633-250G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S9625-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">L-cysteine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C6852-25G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bacto Neopeptone</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>211681</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Casamino acids</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>223050</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Methyl-B-Cyclodextrin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C4555-10G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax, without phenol red</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>32404-014</td>
			<td align="left">For cell culture and infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fetal Bovine Serum</td>
			<td align="left">GE healthcare</td>
			<td>SH30071</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trypsin EDTA (0.25%)</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Saponin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>47036</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Ammonium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bovine Serum Albumine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Electroporation cuvette 0.1 cm</td>
			<td align="left">Eurogentec</td>
			<td>ce0001-50</td>
			<td align="left">For Coxiella transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trackmates screw top tubes with caps&#160;</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td>3741</td>
			<td align="left">2D barcoded screwcap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate with black walls and bottom&#160;</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655076</td>
			<td align="left">Flat dark bottom, for dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate, &#65533;&#65533;clear, black walls</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655090</td>
			<td align="left">Flat transparent bottom, for cell culture and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well PCR microplate</td>
			<td align="left">Biorad</td>
			<td>2239441</td>
			<td align="left">DNAse/RNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well plate, Deepwell</td>
			<td align="left">Labcon</td>
			<td>949481</td>
			<td align="left">For Coxiella mutants infections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">PicoGreen</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>P7581</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Triton X-100&#160;</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Phusion High fidelity DNA Polymerase</td>
			<td align="left">New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td align="left">For single primer colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Celltracker Red CMTPX</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>C34552</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Anti-LAMP1 antibody</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>94403-1ML</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Hoechst 33258</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>L1418</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro</td>
			<td align="left">Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Epifluorescence automated microscope Cellomics</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants

Invasion und Kolonisierung von Wirtszellen, die durch bakterielle Pathogene, hängt von der Aktivität einer Vielzahl von prokaryotischen Proteinen, definiert als Virulenzfaktoren, die unterwandern und zu manipulieren Schlüsselaufnahmefunktionen. Die Studie von Wirt / Pathogen-Interaktionen ist daher äußerst wichtig, um bakterielle Infektionen zu verstehen und zu entwickeln alternative Strategien zur Infektionskrankheiten entgegenzuwirken. Dieser Ansatz erfordert jedoch die Entwicklung neuer Hochdurchsatz-Assays für die unvoreingenommene, automatisierte Identifizierung und Charakterisierung von bakteriellen Virulenzfaktoren. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Erzeugung eines GFP-markierten Mutantenbibliothek durch Transposon-Mutagenese und der Entwicklung von High-Content-Screening-Ansätze für die gleichzeitige Identifizierung mehrerer Transposon-assoziierten Phänotypen. Unser Arbeitsmodell ist die intrazellulären bakteriellen Erreger Coxiella burnetii, der Erreger des Q-Fiebers Zoonose, die mit se verbunden istvere Ausbrüche mit einer daraus resultierenden gesundheitlichen und wirtschaftlichen Belastung. Die obligat intrazelluläre Natur des Erregers hat bis vor kurzem stark behindert die Identifizierung von bakteriellen Faktoren in Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen beteiligt, so dass von Coxiella das ideale Modell für die Umsetzung von Hochdurchsatz / High-Content-Ansätze.

Nach Isolierung der Transposon-Mutanten, ist Einzelprimer-Kolonie-PCR eine robuste, Hochdurchsatzverfahren, um die Website von Transposoninsertion für jede Mutante zu identifizieren. Dieser Ansatz beruht auf einem typischen nested PCR-Protokoll aber hier ein einzelner Primer hybridisiert spezifisch und / oder unspezifisch an der Matrizen-DNA in Abhängigkeit von der Stringenz der Glühtemperatur (1A). Die typischen PCR-Produkte bestehen aus mehreren DNA-Fragmenten, von denen die meisten spezifisch sind (1B). Die Verwendung eines unterschiedlichen Sequenzierungsprimer, die direkt stromaufwärts des Transposons ITR, und stromabwärts des durch den Amplifikationsprimer erkannte Sequenz annealt bietet Spezifität für die Sequenzierungsschritt (Figur 1C). Automatisierte Software für die Sequenzanalyse richtet die erhaltenen Sequenzen an die Coxiella Genom Bereitstellung der genaue Ort der Transposoninsertionen (Abbildung 1c). Alle Transposoninsertionen kann dann annauf der Coxiella Genom (1D) otated. Jedes Coxiella Mutante isoliert und axenisch in ACCM-2-Medium entweder vor der Lagerung oder Screening amplifiziert. 2 zeigt ein Beispiel eines 38-Transposon-Mutanten in 16 Punkten / ICM Coxiella Gene (2A). Um die Lebensfähigkeit von Coxiella Mutanten zu beurteilen, werden axenischen Wachstumskurven durch Abtasten Bakterienkulturen für 7 Tage nach der Inokulation und Anwenden des in 1.5 (Figurie 2B) beschriebenen Bakterienkonzentration Assay erhalten. Amplifizierten Mutanten werden dann mit Epithelzellen für 7 Tage inkubiert, in dreifacher Platten mit 96 Vertiefungen. Alle Coxiella Mutanten erzeugt, die GFP-markierten, intrazellulären Wachstumskurven werden durch Messung der Fluoreszenzintensität der GFP jeden gut, alle 24 Stunden, und Aufzeichnen der Messwerte als Funktion der Zeit (2C) erhalten. Intrazellulären Wachstumskurven stellen die quantitative Analyse der Phänotypen mit jedem Transposoninsertion im Coxiella Genom assoziiert. Um qualitative Informationen zu den gleichen Transposonmutanten hinzuzufügen, haben wir uns für die automatisierte Bildaufnahme und Analyse. Sieben Tage nach der Infektion, Platten befestigt sind, verarbeitet für Immunfluoreszenz, wie in 4 beschrieben und mit Hilfe eines automatisierten, Epifluoreszenzmikroskop wie in 5. Automatisierte Bildanalyse-Software beschrieben, wie CellProfiler (Broad Institute, analysiert <a href="http://www.cellprofiler.com/" target="_blank">www.cellprofiler.com</a> ) verarbeitet die erfassten Kanäle unabhängig und Segmente Objekten für eine vergleichende Analyse (Figur 3) identifiziert. Dies ermöglicht die Identifikation und morphologische Charakterisierung von Wirtszellkerne, Zellen Konturen, Lysosomen und Coxiella Kolonien (Abbildung 3 oberen Felder). Korrelieren Coxiella Kolonien mit Zellen und ermöglicht die Lysosomen Bestandtauf und spezifische morphologische Analyse von Coxiella enthaltenden Vakuolen (die LAMP1 positive, 3 unteren linken Bereich sind). Korrelieren Coxiella Kolonien mit Wirtszelle Konturen ermöglicht die Identifizierung und spezifische morphologische Analyse von infizierten Zellen (Abbildung 3 unten Mitte). Schließlich werden die 4 Kanäle zur Veranschaulichung und Qualitätskontrolle (Abbildung 3 unten rechts) zusammengeführt. Von der automatisierten Bildanalyse erhaltenen Daten können gegeneinander aufgetragen werden, um &quot;Mehr phänotypische Streudiagramme&quot; zu erhalten. Als ein Beispiel in Figur 4A die mittlere Fläche (in &amp; mgr; m 2) von Coxiella Kolonien gegen die Anzahl der Kolonien pro Zelle (4A) aufgetragen wird, um Veränderungen, die die intrazelluläre Replikation des Coxiella (Replikationsphenotyp) und / oder beeinflussen zu identifizieren die Fähigkeit von Bakterien an Wirtszellen eindringen (internasierung Phänotyp). Die statistische Analyse wurde verwendet, um Regionen in der resultierenden Streudiagramm entsprechend mild (-4 &lt;Z-Score ≤ -2) und schwere (Z-Score ≤ -4) Phänotypen zu definieren. Mutanten wurden in 3 Hauptcluster beobachtet: Mutationen, die zu einer fehlerhaften intrazelluläre Wachstum von Coxiella Folge wurden in der äußersten linken Teil der Handlung (4A, rosa und rote Punkte) gruppiert sind; Mutationen, die Coxiella Internalisierung in Zellen betroffen waren im unteren Teil des Grundstücks gruppiert (4A, helle und dunkle blaue Punkte) und schließlich grünen Punkten in der äußersten rechten Bereich des Grundstücks entsprechen Mutationen in nicht-signifikanten Phänotypen ( Z-Score&gt; -2). Wichtig ist, dass Mutanten, die zur Replikation ausfallen, aber noch in der Lage, um Wirtszellen eindringen, werden nach 7 Tagen der Infektion als einzelne Bakterien oder kleinen Kolonien, angrenzend an Zellkernen (4C, zweite Grafik) Wirt erkannt. Daher ist die Größe der Coxiella &quot;Colomen &quot;wird erheblich beeinflusst werden, aber die Anzahl der infizierten Zellen werden nicht im Vergleich zu WT Coxiella infizierten Zellen variieren. Im Gegenteil, Mutationen, die die Fähigkeit von Coxiella, Wirtszellen eindringen beeinflussen zu einer Abnahme in der Anzahl von Kolonien / Zelle. Wenn diese Zahl deutlich unterhalb von 1 ist, zeigt dies, dass, im Durchschnitt, gibt es eine Abnahme in der Gesamtzahl der infizierten Zellen. Alternativ kann die Durchschnittsfläche (in &amp; mgr; m 2) von Coxiella Kolonien gegen die Anzahl der Wirtszellen, die die Infektion (4B), aufgetragen werden, um Mutationen, die Zytotoxizität Coxiella (zytotoxische Phänotyp) verleihen identifizieren. Wie oben wurde die statistische Analyse verwendet, um Bereiche in der resultierenden Streudiagramm entsprechend mild (-4 &lt;Z-Score ≤ -2) und schwere (Z-Score ≤ -4) Phänotypen zu definieren. Die meisten Mutationen gescreent nicht signifikant auf das Überleben der Zelle, unabhängig von bakteriellen Replikations im WirtsZellen (3B grüne Punkte). 37 Mutationen leicht betroffen Wirtszelle Überleben (3B, leicht rote Punkte) und 7 Mutationen waren besonders schädlich für das Überleben der Zellen (3B, dunkle rote Punkte) hosten. Bitte beachten Sie, dass durch die automatisierte Bildanalyseverfahren erhalten zusätzliche Parameter können verwendet werden, um den übrigen Diagrammen abgeleitet werden, je nach experimentellen Anforderungen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" width="700" /> Abb. 1: Die Sequenzierung und Annotation von Coxiella Transposon-Mutanten (A) Einzelprimer Kolonie-PCR wird verwendet, um DNA-Fragmente, die die Stelle der Transposon-Insertion zu verstärken. Amplifikationsprimer (Amp) sowohl als spezifische und unspezifische Primer in Abhängigkeit von der Stringenz der Glühtemperatur verwendet. (B) Typische Ergebnis der Einzelprimer-Kolonie-PCR. Jede Reactiauf produziert eine Anzahl von Fragmenten unterschiedlicher Größe, von denen einige das Transposon Insertionsstelle enthält; einige andere zufällig als Nebenprodukte der PCR-Zyklus niedriger Stringenz amplifiziert. (C) Die Verwendung eines Sequenzierungsprimer (Seq), der auf einem Transposon-Sequenz hybridisiert, kann die Sequenzierung der Fragmente von Interesse. (D) Die Sequenzanalyse-Software ermöglicht die automatische Annotation von Transposoninsertionen auf das bakterielle Genom. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" width="700" /> Abb. 2: Axenic und intrazelluläre Wachstum von Coxiella Transposon-Mutanten (A) In der Pilotschirm haben wir in 16 Kern g isoliert, sequenziert und abgeschirmt 38 Transposon-Mutantenenen der Coxiella dot / icm-Sekretionssystem (rot gekennzeichnet). (B) Um die Rentabilität der einzelnen Transposon-Mutante zu bewerten, das Wachstum je Isolat in axenischen Kulturmedium wird über 8 Tage mit einem fluoreszenzmarkierten DNA-Interkalationsmittel überwacht. (C) jede Mutante wird dann verwendet, um Epithelzellen zu infizieren. Wie das Transposon besitzt eine GFP Kassette wird intrazellulären Bakterienwachstum mehr als 7 Tage nach der Infektion, indem Sie die Variationen der GFP-Fluoreszenz mit Coxiella Replikation verbunden ist, unter Verwendung eines Mikroplatten-Reader überwacht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" width="700" /> Abbildung 3: Automatisierte Bildanalyse von Coxiella Infektionen Ein Auto.Zusammengesetzte Epifluoreszenzmikroskop wird zur Abbildung 21 Positionen pro Loch von dreifachen 96-Well-Platten. Die Bildanalyse-Software Segmente Objekten in jeder erworbenen Kanäle für die Quantifizierung und Analyse. In allen Fällen werden die Gegenstände berühren den Rand der Bilder ausgeschlossen. (A) Die Hoechst-Kanal wird verwendet, um Wirtszellkerne zu identifizieren (in grün markiert). (B) Diese werden als Keime verwendet werden, um Wirtszellkonturen im Cy3-Kanal zu identifizieren (die Position der Kerne blau eingekreist sind Zellkonturen in grün). (C) Das Cy5-Kanal wird verwendet, um LAMP1-positive Fächer zu identifizieren (in grün eingekreist); nur die in den zuvor identifizierten Zellkonturen (in rot) enthalten Objekte für die Bildanalyse erhalten. (D) Die GFP-Kanal wird verwendet, um Coxiella Kolonien zu identifizieren (in grün markiert). (E) Korrelieren Coxiella Kolonien mit LAMP1 positive Abteilen ermöglicht die Identifizierung von Coxiella </em&gt; Enthaltenden Vakuolen (CCV); nur die in den zuvor identifizierten Zellkonturen enthalten Objekte (in grün) für die Bildanalyse erhalten. (F) Korrelieren Coxiella Kolonien mit Zellkonturen ermöglicht die Identifizierung von infizierten Zellen (pseudocolored). (G) in den 4 Fluoreszenzkanälen erworbene Bilder (entsprechend Coxiella Kolonien (grün), Wirtszellkerne (blau), Wirtszellplasmamembran (grau), LAMP1-positive Fächer (rot)) werden zusammengeführt und für die Darstellung und Qualität verwendet Kontrolle. Maßstabsbalken 10 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" width="700" /> Abbildung 4: Groß Identifizierung von Coxiella Faktoren in Wirts Mitmachen / Pathogen interagierenIonen. (A) Die durchschnittliche Fläche (in &amp; mgr; m 2) von Coxiella Kolonien gegen die relative Anzahl der Kolonien pro Zelle aufgetragen ist, um die Replikation und Internalisierung Phänotypen von Interesse zu identifizieren. Grüne Punkte stehen für Phänotypen, die von WT Coxiella durch einen Z-Score&gt; -2 (nicht signifikant) abweichen. Rosa und Hellblau Punkte stehen für die Replikation und Internalisierung Phänotypen jeweils mit einem Z-Score zwischen -2 und -4 (mild Phänotypen). Rot und dunkelblau Punkte stellen Phänotypen mit einem Z-Score ≤ 4 (starke Phänotypen). (B) Die mittlere Fläche (in &amp; mgr; m 2) von Coxiella Kolonien wurde an der Gesamtzahl von Zellen (infiziert und nicht infiziert), dass 7 Tage nach der Infektion auf die zytotoxische Wirkung von Transposoninsertionen resultierende Schätzung lebten aufgetragen. Grüne Punkte stehen für Phänotypen, die von WT Coxiella durch einen Z-Score&gt; -2 (nicht signifikant) abweichen. Rosa Punkte stellen zytotoxische phenotypes mit einem Z-Score zwischen -2 und -4 (mild Phänotypen). Rote Punkte stehen für zytotoxische Phänotypen mit einem Z-Score ≤ 4 (starke Phänotypen). Die Pfeile zeigen die Mutanten durch den entsprechenden Kleinbuchstaben in C (C) veranschaulicht repräsentative Bilder der Replikation, Internalisierung und zytotoxische Phänotypen. In allen Fällen sind Wirtszellkerne in rot, sind Coxiella Kolonien in grün. Maßstabsbalken 50 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii ist ein obligat intrazelluläre Gram-negative Bakterium für die Zoonose Q-Fieber verantwortlich. Hier beschreiben wir Verfahren zur Erzeugung von Coxiella Fluoreszenz Transposon-Mutanten als auch die automatisierte Identifizierung und Analyse der resultierenden Internalisierung, Replikation und zytotoxische Phänotypen.

Generation und Multi-phänotypischen High-Content-Screening<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon-Mutanten

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

9.7K Aufrufe.  Université Montpellier.  Coxiella burnetii ist ein obligat intrazelluläre Gram-negative Bakterium für die Zoonose Q-Fieber verantwortlich. Hier beschreiben wir Verfahren zur Erzeugung von Coxiella Fluoreszenz Transposon-Mutanten als auch die automatisierte Identifizierung und Analyse der resultierenden Internalisierung, Replikation und zytotoxische Phänotypen. 

Serie: Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

Ein genetischer Screen zu isolieren Toxoplasma gondii Host-Zelle Egress Mutanten

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

Die Erleichterung Drug Discovery: Eine automatisierte High-Content-Assay Entzündung im Zebrafisch

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Ein mikroskopischer phänotypischer Assay zur Quantifizierung intrazellulärer Mykobakterien angepasst für High-Throughput/High-Content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial pathogen which establishes chronic pulmonary infections in patients with cystic fibrosis (CF). The overproduction of a capsular polysaccharide called alginate, also known as mucoidy, promotes the formation of mucoid biofilms which are more resistant than planktonic cells to antibiotic chemotherapy and host defenses. Additionally, the conversion from the nonmucoid to mucoid phenotype is a clinical marker for the onset of chronic infection in CF. Alginate overproduction by P. aeruginosa is an endergonic process which heavily taxes cellular energy. Therefore, alginate production is highly regulated in P. aeruginosa. To better understand alginate regulation, we describe a protocol using the mini-himar1 transposon mutagenesis for the identification of novel alginate regulators in a prototypic strain PAO1. The procedure consists of two basic steps. First, we transferred the mini-himar1 transposon (pFAC) from host E. coli SM10/&#955;pir into recipient P. aeruginosa PAO1 via biparental conjugation to create a high-density insertion mutant library, which were selected on Pseudomonas isolation agar plates supplemented with gentamycin. Secondly, we screened and isolated the mucoid colonies to map the insertion site through inverse PCR using DNA primers pointing outward from the gentamycin cassette and DNA sequencing. Using this protocol, we have identified two novel alginate regulators, mucE (PA4033) and kinB (PA5484), in strain PAO1 with a wild-type mucA encoding the anti-sigma factor MucA for the master alginate regulator AlgU (AlgT, &#963;22). This high-throughput mutagenesis protocol can be modified for the identification of other virulence-related genes causing change in colony morphology.

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Here we describe a protocol using the mini-himar1 mariner transposon-mediated mutagenesis for generating a high-density insertion mutant library to screen, isolate and identify novel alginate regulators in the prototypic Pseudomonas aeruginosa strain PAO1.

Identifizierung neuer Gene, die mit Alginat-Produktion verbunden in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Mit Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner Transposon-vermittelte Mutagenese

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Die Entwicklung der Lyophilisierte Loop-mediated Isothermal Amplification Reagenzien zum Nachweis von<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

Anwenden von Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) zu untersuchen Effektor Translokation Effizienz durch<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Während siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness during infection of Golden Syrian hamsters. Tn-Seq combines random transposon mutagenesis with the power of high-throughput sequencing technology. Animals are challenged with a pool of transposon mutants (input pool), followed by harvesting of blood and tissues a few days later to identify and quantify the number of mutants in each organ (output pools). The output pools are compared to the input pool to evaluate the in vivo fitness of each mutant. This approach enables screening of a large pool of mutants in a limited number of animals. With minor modifications, this protocol can be performed with any animal model of leptospirosis, reservoir host models such as rats and acute infection models such as hamsters, as well as in vitro studies. Tn-Seq provides a powerful tool to screen for mutants with in vivo and in vitro fitness defects.

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

We describe here a technique that combines transposon mutagenesis with high-throughput sequencing to identify and quantify transposon leptospiral mutants in tissues after a challenge of hamsters. This protocol can be used to screen mutants for survival and dissemination in animals and can also be applied to in vitro studies.

Hochdurchsatz-parallele Sequenzierung Maßnahme Fitness Leptospira Interrogans Transposon Insertion Mutanten während Golden syrischen Hamster Infektion

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

Replikation von bestellt, Nonredundant Bibliothek von Pseudomonas Aeruginosa Stamm PA14 Transposon Insertion Mutanten

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of antibiotics and other secondary metabolites. Streptomyces coelicolor is a well-characterized, non-pathogenic species that is amenable to a variety of analyses in the lab. The phenotyping methods described here use S. coelicolor as a model streptomycete; however, the methods are applicable to all members of this large genus as well as some closely related actinomycetes. Phenotyping is necessary to characterize new species of Streptomyces identified in the environment, and it is also a vital first step in characterizing newly isolated mutant strains of Streptomyces. Proficiency in phenotyping is important for the many new researchers who are entering the field of Streptomyces research, which includes the study of bacterial development, cell division, chromosome segregation, and second messenger signaling. The recent crowdsourcing of antibiotic discovery through the isolation of new soil microbes has resulted in an increased need for training in phenotyping for instructors new to the field of Streptomyces research and their college or high school students. This manuscript describes methods for bacterial strain propagation, storage, and characterization through visual and microscopic examination. After reading this article, new researchers (microbiology education laboratories and citizen scientists) should be able to manipulate Streptomyces strains and begin visual characterization experiments.

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Here we present protocols for novice researchers to initiate phenotyping for the pharmacologically important bacterial genus Streptomyces.

Visuelle und Mikroskopische Auswertung von Streptomyces Entwicklungsstörungen Mutanten

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...