Wir danken der Max-Planck-Gesellschaft, das Human Frontier Science Program (HFSP) und der Boehringer Ingelheim Fonds für die Finanzierung und Unterstützung.

1. Materialaufbereitung <ol><li> Herstellung von Rohren FEP <ol><li> Reinigen Sie die FEP-Schlauch (2A) durch Spülen Flüssigkeiten (in den folgenden Schritten angegeben) durch das Rohr und mit einer Spritze mit einem stumpfen Ende Kanüle (2B) befestigt Anmerkung 1:.. Benutzen Sie Handschuhe während des gesamten Verfahrens Anmerkung 2: Wir empfehlen Schneiden Sie den Schlauch in Stücken von ca. 1 m in der Länge und die Reinigung dieser parallel. <ol><li> Zuerst spülen Sie das Rohr mit 1 M NaOH wiederholt. Dann übertragen die Röhre in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen mit 0,5 M NaOH gefüllt und ultrasonicate es für 10 min. </li><li> Übertragen Sie die Polymerschlauch zu einem kleinen Becken mit ddH 2 O. Spülen Sie das Rohr zunächst mit ddH2O und dann mit 70% EtOH. </li><li> Die FEP-Schlauch Anschließend Transfer in ein frisches Zentrifugenröhrchen mit 70% EtOH. Wieder ultrasonicate dieses Zentrifugenröhrchen für 10 min. </li></ol></li><li> Schneiden Sie den Schlauch gereinigt FEP in Stückevon ca. 3 cm (eine typische Länge für den Einsatz in Montage-und Zebrafisch-Bildgebung) und richten Sie sie gegebenenfalls. Bewahren Sie die Rohre gereinigt FEP in ein frisches 50 ml-Zentrifugenröhrchen mit ddH2O (2C) gefüllt. </li></ol></li><li> Vorbereitung der Tricaine Stammlösung <ol><li> Bereiten 0,4% Tricaine Stammlösung durch Lösen von 400 mg Tricaine (MS-222) in 97,9 ml ddH 2 O. Nachdem das Pulver vollständig gelöst hat, den pH auf 7,0 unter Verwendung von 2,1 ml 1 M Tris (pH 9,0). Schützen Sie die Lösung aus Licht. Speicher Aliquots bei -20 ° C. </li></ol></li><li> Herstellung von 3% Methylcellulose <ol><li> Vorbereitung 3% Methylcellulose-Lösung für die Innenbeschichtung der Rohre FEP, wie unten beschrieben. Heizen Sie E3 11 in einer Glasflasche auf ca. 60-70 ° C und fügen Sie die entsprechende Menge an Methylcellulose-Pulver. Fügen Sie einen Rührstab und rühren bei 4 ° C Sobald die Lösung auf unter 30 ° C abgekühlt, fügen Tricaine Lösung auf einen endgültigen concentration von 100 mg / L. Halten Sie das Rühren bei 4 ° C über Nacht. </li></ol></li><li> Zubereitung von 1,5% und 0,1% Agarose in E3 <ol><li> Man löst die entsprechende Menge an niedrig schmelzender Agarose-Pulver in einem definierten Volumen von E3 in einem Glaskolben. Erhitzen Sie die Mischung in eine Mikrowelle und schütteln Sie sie einmal in eine Weile, bis die Agarose-Lösung homogen erscheint, ohne verbleibenden Kristalle. </li><li> Bereiten 1 ml Aliquots von 0,1% igen Lösung in 1,5 ml Reaktionsgefäße. Die Aliquots bei 4 ° C gelagert werden </li><li> Verwenden Sie die 1,5%-Lösung zur Beschichtung eines Kunststoff-Petrischale. Die Dicke der Schicht sollte ca. Agarose sein. 2 mm. Nachdem die Agarose verfestigt wird, hinzuzufügen E3 Medium auf der Oberseite der Schicht, um sie vor dem Austrocknen zu verhindern. Die beschichtete Schale kann bei 4 ° C gelagert werden </li></ol></li><li> Vorbereitung der Zebrafisch <ol><li> Halten Zebrafisch (Danio rerio) Erwachsene und Embryonen bei 28,5 ° C und mit ihnen umgehen nach den etablierten Protokollen 11,12. </li><li> Richten Sie männliche und weibliche Fische am Nachmittag und trennen Sie diese durch einen Teiler. Am nächsten Morgen entfernen Sie die Trennlinie, um die Paarung der Fische Timeout. </li><li> Sammeln Sie die Embryonen in einer Schale mit E3 gefüllt und untersuchen sie mit einem Stereomikroskop. </li><li> Bei 24 hpf (oder der Entwicklungsphase Ihres Interesses), wählen Sie die Zebrafisch-Embryo für die Fluoreszenz-Ausdruck und übertragen die positive auf eine neue Schale mit frischen E3. </li><li> Sorgfältig dechorionate die Embryonen mit zwei scharfen Pinzette (Abb. 2D und 2E). Verwenden Sie die erste Zange zu greifen und halten Sie die Chorion und die zweite Zange, um es aufzureißen und abziehen Anmerkung 1:. Führen Sie diesen Schritt mit Hilfe eines Stereomikroskops. </li></ol></li></ol> 2. Multilayer-Montage <ol><li> Beschichten des FEP-Rohrs <ol><li> Bringen Sie ein stumpfes Ende eine Kanüle in eine Spritze. Legen Sie die Kanüle vorsichtig für etwa 3 mm in das eine Ende eines gereinigt und geschnitten Stück. FEP-Schlauch (2F und 2G) Hinweis 1: Handschuhe und vermeiden Sie jegliche Biegen oder Zusammendrücken des Rohres. </li><li> Tauchen Sie das freie Ende des FEP-Schlauch in 3% Methylcellulose und füllen Sie den Schlauch mit der Lösung. </li><li> Langsam den Methylcellulose, indem Sie auf der Spritze. Entsorgen Sie die Lösung. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.1.2 und 2.1.3 mit E3 Hinweis 1:. Die beschichteten Rohre für die Montage sofort verwendet werden müssen. </li></ol></li><li> Übertragen der Zebrafisch zu der Agarose <ol><li> Aufheizen eines Aliquots von 0,1% Agarose auf 70 ° C in einem Heizblock. Vortex das Reaktionsrohr kurz und übertragen sie auf eine auf 38 ° C (2H) gesetzt Wärmeblock. </li><li> Nehmen Sie die Reaktionsröhrchen aus dem Wärmeblock und abkühlen lassen kurz. Hinzufügen Tricaine bis zu einer Endkonzentration von 133 bis 200 mg / L und Wirbel wieder (Fig. 2I). </li><li> Wählen Sie eine der dechorionated Zebrafischembryonen und transfe. r sie in das Reaktionsrohr mit dem vorgewärmten 0,1% Agarose mit einem Glas-Pasteur-Pipette (Abb. 2J und 2K) Hinweis 1: Versuchen Sie, so wenig wie möglich zusätzliche E3 übertragen. </li></ol></li><li> Montage des Zebrafisch <ol><li> Nehmen Sie den Embryo mit der Spritze befestigt FEP-Schlauch (2L). . Das Rohr sollte vollständig mit 0,1% Agarose gefüllt werden, wobei der Embryo nahe an einem Ende der Röhre und mit dem Kopf in Richtung der Öffnung des Rohres Hinweis 1: Stellen Sie sicher, dass Sie vor der Aufnahme die Fische nehmen einige Agarose. Hinweis 2: Ziehen Sie ganz sanft auf die Spritze, um Blasen zu vermeiden Hinweis 3:. Halten Sie das Rohr in einer horizontalen Ausrichtung, um ein Auslaufen der Inhalte (Bilder 2M und 2N) zu vermeiden. </li></ol></li><li> Stecken Sie den Schlauch <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg"src = &quot;/ files/ftp_upload/51119/51119fig2.jpg&quot; /&gt; 2. Multilayer-Halterung für Zebrafisch-Embryonen. A) Fluorierte Ethylen-Propylen (FEP) Röhren auf einer Kabeltrommel vor der Zubereitung. B) Eine Spritze mit einem stumpfen Ende Kanüle befestigt. C) Ein gereinigt und geschnitten FEP-Schlauch. D, E) Dechorionation von 24 hpf Zebrafisch-Embryonen. F) die Röhre in das stumpfe Ende Kanüle. G) Die Spritze mit Kanüle und Schlauch befestigt. H) Eine Teilmenge von 0,1% Agarose in einem Reaktionsgefäß während der Übertragung auf einen Wärmeblock. I) Vortexen des geschmolzenen Agarose. J) Aufnahme eines dechorionated Embryos unter Verwendung einer Glaspipette. K) Übertragung des Embryos in die geschmolzene Agarose. L) Einlass des Embryos mit Umgebung Agarose in die FEP-Röhre. M, N) Der Zebrafisch-Embryos im Inneren des FEP-Rohrs . <strong&gt; O) Schneiden Sie den Schlauch zwischen Probe und Kanüle. P) Stecken Sie den Schlauch durch die Verwendung eines Agarose-beschichteten Gericht. Q) Der Embryo innerhalb der gesteckten Röhre. R) Die endgültige Probenvorbereitung in einem Metallhalter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um größeres Bild zu betrachten.</a> <ol><li> Verwenden Sie eine Rasierklinge, um den Schlauch aus der Kanüle (Abbildung 2 O) geschnitten. </li><li> Langsam kleben Sie das Ende des Rohres den Fisch durch die gesamte Schicht von 1,5% Agarose in der Kunststoffschale, um das Rohr (Abbildung 2P)-Stecker enthält Anmerkung 1:. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen und versuchen, einen geraden Stecker Oberfläche zu erhalten, indem die . Rohr exakt senkrecht zur Oberfläche Agarose Hinweis 2: Drehen Sie den Schlauch schwach, um einen schönen Stecker zu erhalten. </li><li> Halten Sie die Probe montiert in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß mit E3, um das Trocknen zu vermeiden. Die Probe now bereit, abgebildet werden. Vor Bildgebung, zu überprüfen, ob der Fisch sitzt rechts oben auf dem Stecker (2Q Zahlen und 2R). Achten Sie darauf, auch Tricaine auf das Medium innerhalb des Abbildungskammer bei der gleichen Konzentration wie in der Montage Medium hinzufügen. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Erweiterte Mikroskopietechniken wie Lichtblatt Mikroskopie ermöglichen heute Bilddaten mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung im Laufe von mehreren Tagen aufnehmen, aber auch verlangen Probe Montagetechniken zu verbessern. Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll von Mehrschicht Halterung für Lichtmikroskopie Blatt der Zebrafisch-Entwicklung. Das Verfahren ist einfach zu implementieren und wir sie verwenden in unserem Labor auf einer täglichen Basis. Die FEP-Schläuche Schlüsselkomponenten unserer Strategie sind Röhren Montage der Polymer Fluorierte Ethylen-Propylen (FEP) vorgenommen. Wir entschieden uns, FEP vor allem wegen seiner Brechungsindex von 1.338, die ähnlich wie Wasser und daher ideal für die Lichtmikroskopie Blatt mit Wasser-Tauchziele und Probe erfordern wässrigen Medien geeignet ist, zu verwenden. Die Röhrchen mit 0,8 mm Innendurchmesser und 0,4 mm Wandstärke passen die Zebrafisch-Entwicklung sehr gut, kann mit typischen Probenhalter für 1,6 mm geeignet verwendet werdenKapillaren und sind unsere erste Wahl für die Montage vorgestellt Methode. Wir testeten sie gründlich in unserem selbstgebauten Setups sowie im Handelssystem &quot;Lichtschicht Z.1&quot; von Carl Zeiss Mikroskopie und festgestellt, dass FEP Rohre bieten langfristige Stabilität, haben nur minimale Auswirkungen auf die optische Leistung und sind nicht fluoreszierenden 10. Sie sind jedoch nicht für Anwendungen mit Proben, die einen unterschiedlichen Brechungsindex, z. B. gelöscht Probe erfordern. Rohre und Folien aus FEP sind in einer Vielzahl von Durchmessern und Dicken erhältlich. Darüber hinaus können FEP bei 260 ° C aufgeschmolzen werden und bietet praktisch unbegrenzte Möglichkeiten für maßgeschneiderte Probe Halterungen so. Die Polymerrohre sind in der Regel nicht steril geliefert werden, weshalb das Reinigungsprotokoll umfasst mehrere Schritte, um beste optische Qualität sicherzustellen. Die Beschichtung mit Methylcellulose sichergestellt, daß kein Teil der wachsenden Zebrafischembryo klebt auf das Polymer. Die Entscheidung für 0,1% Agarose basiert auf umfangreichen Tests der Wachstumsrate und Unbeweglichkeit in verschiedenen Konzentrationen von Agarose und Methylcellulose 10 basiert. Agarose-Konzentrationen über 0,1% zeigten bereits einen starken Einfluss auf die Wachstumsrate von 24 hpf Zebrafisch. Zusätzlich verwenden wir niedrige Dosen der betäubende Droge Tricaine. Tricaine Blöcke Aktionspotentiale, hemmt dadurch die Signalübertragung zwischen Gehirn und Muskeln und Muskelkontraktionen 16 unterdrückt. Eine Konzentration von 133 bis 200 mg / l gewährleistet eine ausreichende Immobilisierung von Zebrafisch zwischen 24-72 hpf. Allerdings Tricaine und andere Medikamente, die wir getestet Anästhesie zeigen dosisabhängige Nebenwirkungen wie Herz Ödeme. Zusätzlich wird die erforderliche Dosis von Tricaine variiert mit dem Entwicklungsstadium des Embryos. Wir empfehlen daher die Verringerung der Tricaine Konzentration auf die für die Entwicklungsstufen, die abgebildet werden, benötigten Menge. Um beste Performan gewährleistence und verhindern die Bildung von toxischen Nebenprodukten sollte frisch zubereitet oder aufgetaut Tricaine Stammlösung verwendet werden, vor Licht geschützt und nicht über 30 ° C erhitzt Die Einbettung in FEP Rohre ermöglicht auch eine einfache Änderung der Montagemedium für die spezifischen Bedürfnisse zu berücksichtigen. Für Zeitraffer-Bildgebung des Herzens, empfehlen wir die Verwendung von 3% Methylcellulose und 100 mg / L Tricaine anstelle von 0,1% Agarose und 200 mg / L für die Montage. Methylcellulose ist viskoser als 0,1% Agarose wodurch höhere Immobilität auf eigene und weniger Tricaine muss verwendet werden, um eine Begrenzung des Embryos zu gewährleisten. Tricaine empfindlich auf Temperaturen über 30 ° C und kann auch durch das Medium in der Belichtungskammer verdünnt werden, was zu einer verringerten Leistung und mögliche Zucken des Embryos. Stellen Sie daher sicher, dass Sie Tricaine auch in der Abbildungsmedium, in dem die Probe eingetaucht montiert zu verwenden. Wenn Ihre Experimente erfordern die Verwendung von höherenTemperaturen empfehlen wir den Austausch des Mediums in der Abbildungskammer entweder ständig unter Verwendung einer Perfusionssystem oder manuell mit einem Rohr und einer Spritze zwischen zwei Zeitpunkten. Kritische Schritte Die kritischen Schritte im Prozess der Montage sind die Probenaufnahme der Probe in das Rohr und das Einführen des Agarose-Stopfen. Die Einlass definiert die Anfangsposition des Embryos, die umständlich nachträglich ändern ist. Mehrere Proben sollten zu montieren sein und die Montagequalität sollte mit einem Stereomikroskop beobachtet werden. Wenn die Probe Orientierung nicht zufriedenstellend ist, die Änderung der Geschwindigkeit von der Erstellung der Probe und die Vermeidung von Folgebewegungen der Kolben kann helfen, wie dies oft verdreht den Embryo. Die 1,5%-Agarose-Stopfen erforderlich ist, um eine Leckage des 0,1%-igen Agarose vermeiden. Die Oberfläche des Stopfens im Inneren des Rohres sollte flach auf den Probenorientierung während der Entwicklung nicht zu beeinflussen. Um eine gute Surf erreichenace, unterschiedliche Dicken der Schichten Agarose müssen getestet werden und das Rohr muss in der Agarose normal zu der Oberfläche gebracht werden. Drehen der Röhre ein wenig und ziehen den Schlauch heraus sorgfältig frei den Stecker aus der Schüssel. Die Qualität der Befestigung sollte mit einem Stereomikroskop geprüft werden vor der Bilderzeugung. Multiview-Bild Ein großer Vorteil der Lichtbogen-Mikroskopie ist Multiview-Bildgebung, die Fähigkeit, um die Probe zu drehen, zu erwerben z-Stapel aus verschiedenen Blickwinkeln und in der Folge zu registrieren und verschmelzen sie. Eine etablierte Methode, um die z-Stacks im 3D-Raum zu registrieren ist Wulst-basierte Registrierung unter Verwendung von fluoreszierenden Kügelchen die Probe umgebenden als Treuhänder 17 Marker. Dieses Verfahren beruht jedoch auf einem festen Einbettungsmedium, wie 1,5% Agarose und scheint daher mit der mehrschichtige Montage hier vorge unvereinbar. Aber mehrere alternative Lösungen zu arbeiten, je nach Anwendung. Erstens kann die fluoreszierende Kügelchenin der Agarose-Stecker, der in das Sichtfeld während der Erfassung werden muss aufgenommen werden. Zweitens können die Tischpositionen vor den eigentlichen Versuche unter Verwendung eines 1,5% Agarose-Säule, die mit fluoreszierenden Kügelchen kalibriert werden. Drittens können alternative Marker, wie Fluoreszenz Kerne verwendet, um die Position der Z-Stapel relativ zueinander zu identifizieren. Verdunstung Typische Lichtschnittmikroskopie Setups einen offenen Probenkammer, die unvermeidlich führt zur Verdampfung des Mediums. Da das Medium ist essentiell für das Überleben der Probe, um die Verdampfung des Montagemedium zu beschränken und für die richtige Brechungsindex zwischen der Optik und der Probe, empfehlen wir unter einer oder mehreren der folgenden Maßnahmen, um Verdunstung zu verhindern. Erstens kann das Medium in der Kammer ständig ein Perfusionssystem ausgetauscht werden. Zweitens kann das Medium manuell nachgefüllt werden. Drittens kann die Kammer mit einem Deckel oder einer flexiblen Folie abgedeckt werden. <pclass = &quot;jove_step&quot;&gt; Sauerstoffversorgung Das Polymer FEP wurde entwickelt, um eine große Vielzahl von Chemikalien zu widerstehen und ist daher robust, chemisch inert und undurchlässig für Gas. Im Fall von mehrschichtigen Montage Sauerstoff kann nur durch die Agarose-Stopfen und dem Agarose-Luft-Grenzfläche zu durchdringen, aber es bleibt zu zeigen, wenn die Sauerstoffzufuhr in mehrschichtigen Montage ist erheblich niedriger im Vergleich zu den Einbau in 1,5% Agarose-Polymer ohne Stützrohr. Da die Montage in 1,5% Agarose kann nur für etwa zwei Stunden verwendet werden, bevor der Zebrafisch Morphologie mehrschichtigen Montage betroffen sein scheint, die überlegene Gesamtlösung für die Langzeitabbildungs ​​sein. Abbilden früheren Entwicklungsstufen Multilayer-Montage ist nun unsere Standard-Einbettungstechnik für Zeitraffer-Mikroskopie von Lichtbogen Zebrafisch älter als 24 hpf zu werden. Außer, dass wir auch die Polymerrohren für die Bildgebung von früher Embryonen zu verwenden. Die Embryos bleiben in ihrer Chorion und in einer FEP-Röhre mit einem Innendurchmesser von 1 mm angeordnet und mit E3 gefüllt. Der Zebrafisch kann frei innerhalb des Chorion entwickelt und kann immer noch gut mit Hilfe von Licht-Mikroskopie Blatt abgebildet werden. Ausblick Die vorgestellte Mehrschichtprobe Montage entfesselt das volle Potential der Lichtblatt-Mikroskopie für Echtzeit-Entwicklungsbiologie mit Zebrafisch. Es kann leicht für andere Mikroskopietechniken wie optischen Projektionstomographie (OPT) und andere Organismen angenommen werden. Wir glauben, dass die Standard-Größe FEP Schläuche sind nur die ersten Schritte in Richtung Probe Montagetechniken für die spezifischen Bedürfnisse zugeschnitten sind.

Um die komplexen Ereignisse und Interaktionen während der Embryogenese zu verstehen, ist die Forschung in der Entwicklungsbiologie mehr und mehr Bewegung von Mikroskopie von einzelnen Zellen und Organe in vivo Bildgebung von ganzen Organismen. Traditionelle Mikroskopie-Techniken in der Regel nicht die räumliche und zeitliche Auflösung, um eine schnelle Ereignisse über einen längeren Zeitraum verfolgen und bieten oft dazu führen, Bleichen oder phototoxische Effekte in der Probe ein. Wir und andere gefunden, Lichtbogen-Mikroskopie (Abbildung 1), um die ideale Technik für die in-vivo-Bildgebung der Zebrafisch-4.2 sein. Die Beleuchtung der Probe mit einer dünnen Schicht von Laserlicht, die orthogonal zur Erkennung Achse, bietet eine schnelle optische Schnitte mit hoher räumlicher Auflösung sowie Foto-Toxizität minimiert 5. Zugleich wird durch diese einzigartige optische Anordnung herkömmlichen Probenbefestigungstechniken unter Verwendung von Petrischalen oder Kulturkammern sind nicht geeignet. In einer typischen LichtBlatt Mikroskop drei translatorischen Motoren und Motordreh Halten der Probe, so dass sie präzise positioniert werden kann, gedreht und aus einer beliebigen Richtung betrachtet wird. In den letzten Proben für die Lichtmikroskopie Blatt oft in 2.1% Agarose in einer Glaskapillare 6,7 eingebettet. In diesem Fall wird die erstarrte Agarose Zylinder mit der eingebetteten Probe wird aus der Glaskapillare in die Probenkammer mit wasserartigen Mediums zur Bildgebung gefüllt extrudiert. Agarose hat einen Brechungsindex nahe Wasser und ist daher für die in vivo Mikroskopie Lichtblatt, die Wasser-korrigierten Belichtungs-und Detektionsoptik erleichtert geeignet. Die Probe wird in der starren Agarose beschränkt und kann auch für eine kurze Zeit abgebildet werden, aber morphogenetische Veränderungen und Wachstum des Embryos stark beeinträchtigt, wenn die Abbildung für mehrere Stunden 7,8. Obwohl Lösungen für andere Anwendungen entwickelt worden, 9, die nicht-invasive Langzeit Zeitraffer-Zebrafisch<html> Bildpotential der Lichtmikroskopie Blatt kann mit dem herkömmlichen 1,5% Agarose-Einbettung nicht ausgenutzt werden. Wir haben deshalb eine neue Strategie für die Montage in vivo Mikroskopie Lichtblatt der Zebrafisch-Embryonen 10. Die Probe wird in 0,1% Agarose mit 200 mg / L Tricaine in einem Rohr des optisch klare Polymer fluorierten Ethylen-Propylen-(FEP) montiert. Der eingebettete Embryo entwickelt normalerweise aufgrund der niedrigen Viskosität des Mediums. Zur gleichen Zeit, beschränkt die FEP-Röhre des Mediums und der Probe für die Dauer des Experiments. Hier bieten wir ein ausführliches Protokoll der neuen Montagetechnik und Darstellung von Daten reflektieren ihre Vorteile gegenüber dem herkömmlichen Protokoll. Wir zeigen, dass unsere Verfahren Zebrabärblingentwicklung kontinuierlich mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung über einen Zeitraum von mehr als zwei Tage abgebildet werden. 5in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Das Prinzip der Lichtbogen-Mikroskopie. Ein Zebrafisch in einem Rohr von fluorierten Ethylen-Propylen (FEP) vorgenommen montiert übersetzt werden kann und durch die Brennebene des Detektionsobjektiv gedreht. Eine dünne Schicht von Laserlicht (Lichtbogen) wird durch die Beleuchtung Ziel in die Fokusebene des Detektionsobjektiv projiziert und beleuchtet nur eine dünne optische Schnitt der Probe. Das emittierte Fluoreszenzsignal wird von der Detektionsobjektiv gesammelt und auf einem Kamera-Chip aufgezeichnet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1097">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:268px;">Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes</td>
			<td style="width:143px;">Bola</td>
			<td style="width:113px;">S 1815-04</td>
			<td style="width:573px;">0.8 / 1.6 mm inner / outer diameter, other sizes available</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Omnifix-F Solo 1 ml Syringe</td>
			<td style="width:143px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:113px;">9161406 V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sterican Single-Use Cannula, blunt</td>
			<td style="width:143px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:113px;">9180109</td>
			<td style="width:573px;">0.8 x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:143px;">Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M NaOH</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M NaOH&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70% EtOH</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Methylcellulose</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td>M0387</td>
			<td>supplied as powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">E3 medium (for zebrafish embryos)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">1.5 ml Reaction Tube</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:113px;">3810X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Agarose, low gelling temperature</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td>supplied as powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:143px;">Greiner</td>
			<td>633180</td>
			<td>plastic, 94 x 16 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">Tricaine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td style="width:573px;">synonyms:&#160; Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">10x/0.3 W Microscope Objective Lens</td>
			<td style="width:143px;">Leica</td>
			<td style="width:113px;">HCX APO L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">EMCCD Camera</td>
			<td style="width:143px;">Andor Technology</td>
			<td style="width:113px;">iXon 885 EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish

Lichtbogen-Mikroskopie ist das ideale bildgebendes Verfahren zur Zebrafisch embryonalen Entwicklung zu studieren. Aufgrund des geringen Phototoxizität und Bleichen, ist es besonders für die Langzeit Zeitraffer-Bildgebung über mehrere Stunden bis zu mehreren Tagen geeignet. Es wird jedoch ein entsprechender Proben Montage Strategie benötigt, die sowohl Haft und normale Entwicklung der Probe bietet. Multilayer-Montage ist eine neue Einbettungstechnik mit niedriger Konzentration Agarose in optisch klaren Rohre, überwindet nun diese Einschränkung und entfesselt das volle Potential der Lichtmikroskopie Blatt für Echtzeit-Entwicklungsbiologie.

Multiday Imaging der Zebrafisch-Entwicklung Gefäßsystem Wir verwenden ein dpf Tg (kdrl: GFP) 13 Zebrafisch, um die Vorteile der Mehrschicht-Montage-Strategie für langfristige Lichtblatt-Mikroskopie zeigen. Ziel ist es, die Bildentwicklung des Gefäßsystems im gesamten Zebrafisch über einen Zeitraum von 2 Tagen. Der Zebrafisch Embryo wurde in 0,1% igen Methylcellulose in einer beschichteten Polymerrohr montiert. Hier wird der Zebrafisch nicht von der Montagemedium beschränkt und kann normal entwickeln. Sein Kopf wirft, der Schwanz erstreckt und Gefäß Austrieb erscheint ungehindert (Abbildung 3). <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3.jpg" /> 3. Multiday Bildgebung Zebrafisch Gefäßentwicklung. Das Gefäßsystem eines multilayer montiert 1 dpf Tg (kdrl: GFP) 13 Zebrafisch entwickelt ungehindert in einem Lichtblatt-Mikroskop im Laufe der zwei Tage. Ein 488-nm-Laserlichtschnitt der Fluoreszenz angeregt und das Signal wurde mit 10X/0.3 W objektive und eine EM-CCD-Kamera detektiert. Z-Stapel wurden auf vier benachbarten Positionen alle 10 Minuten erfasst und anschließend mit Fiji 15 genäht. Maximum Intensity Projections einer Teilmenge von Zeitpunkten dargestellt. Maßstab:. 500 um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> Imaging der frühen Embryogenese Zebrafisch Hier zeigen wir die Fähigkeit von FEP Rohre als Halterung für die Lichtmikroskopie Blatt der frühen Zebrafischembryogenese während des ersten Tages nach der Befruchtung. Die 8 hpf Tg (H2A: GFP) 14 Zebrafischembryo mit seiner intakten Chorion innerhalb eines E3-gefüllte Röhre mit einem i montiertMänner Durchmesser von 1 mm. Dadurch ergibt sich eine leichte Klemmung der Chorion. Alle Entwicklungsprozesse während der Embryogenese sind unabhängig von der Montage und optimal visualisiert mit Hilfe von Licht-Mikroskopie Blatt werden. In diesem Beispiel wir die abzubildende Probe über einen Zeitraum von 12 h (Fig. 4). Typische Formänderungen während der frühen Embryogenese, wie die zunehmende Dehnung des Eigelbs und Verdickung des Gewebes entlang der Mittellinie, würde bei Verwendung der herkömmlichen Montage ohne Chorion in 1,5% igen unterdrückt werden. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4.jpg" /> . Abbildung 4 Imaging der frühen Embryogenese Zebrafisch Ein Tg (H2A: GFP). Zebrafisch-14 durchläuft der frühen Embryogenese. Ein 488-nm-Laserlicht Blatt aufgeregt GFP und das Fluoreszenzsignal erkannt wurdemit einem 10X/0.3 W objektiven und einer EMCCD Kamera. Z-Stapel aus zwei Blickwinkeln wurden alle 3 min über einen Zeitraum von 12 Stunden erworben. Normalisierte maximale Intensität Projektionen einer Teilmenge der Zeitraffer gezeigt. Sichtbare Bewegungsunschärfe bei 19 hpf Ergebnisse aus dem Embryo Zucken während der Akquisition, da keine Betäubung verwendet. Maßstab:. 150 um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a>

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Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Die Entwicklung von Zebrafisch kann über Tage mit Licht-Mikroskopie Blatt, wenn Embryonen werden in optisch klare Polymerrohren mit niedriger Konzentration Agarose eingebettet folgen.

Multilayer-Halterung für Langzeit-Licht-Mikroskopie Blatt der Zebrafisch

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

multilayer-mounting-for-long-term-light-sheet-microscopy-of-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

18.7K Aufrufe.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics.  Die Entwicklung von Zebrafisch kann über Tage mit Licht-Mikroskopie Blatt, wenn Embryonen werden in optisch klare Polymerrohren mit niedriger Konzentration Agarose eingebettet folgen. 

Serie: Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Actually what I'm gonna do, mount it in here first and then swap out You. So now I'm gonna aspirate try and be as gentle as possible.Okay. A few seconds just holding.Okay.Alright.So the important features of our lifestyle imaging grid are that, so it's an inverted scope, which means the objective, the samples here in the objective is underneath. So the objective is pointing up and the whole scope, or practically the whole, practically the whole scope, including the objectives and the sample are at 37 degrees. So everything in this plastic box is at 37 degrees.And right on top of the stage we have an air and CO2 mix. That is 5%CO2. So the idea is that the sample is actually in a cell, it's like a cell incubator.And so we have, this is our mixer for the air and the CO2 and, and it gets humidified and heated and then piped onto the, the sample on the stage.Okay. And today we're just gonna be doing fluorescence one channel GFP fluorescence. This is the hose that the CO2 and 5%CO2 goes in and it just fits into the stage holder.That's important. And then we can close these, take these down, and then we go to our first position. And what I'm gonna do is go to the first field, which is my control sample, and I'll pick positions based on what I see on the screen.So I just make sure I actually look into the microscope in each new, well, because the focal plane for each of the wells is different, the, the dish is not perfectly flat on the bottom. So you will need to make fine adjustments when you move from well to the well. So right now I'm on the first, well, what I'll do is I'll focus, so I just hit, I just told, I just turned on the light, the transmitted light for the microscope.And I have make sure all the light is going to the eye pieces. And so I just look in, make sure I get a nice clean field. And then what I'll do is turn that light off, turn the fluorescence light on, make sure the cells that I'm looking at look healthy and they're not apoptotic.And, and I turn that off. And what I do next is send, so now I'm gonna start picking positions, which means I have to te send the light path to the camera. This is the camera right here.So I tell the microscope to send all the camera, they don't see anything in the eye pieces. What I'll do is in the software controlling the microscope, I'll choose the right filter set, which for our purposes is psy. And then set an exposure time.And I know these cells very well and I know that they take a 0.2 second exposure time. So I tell, that's what I tell the software to do. And what I'll do is hit focus.This is, and it's basically just alive. The, A light will turn on and you can, oh, I don't know if you can see cells, but the reason this is a good field is because there's, all the cells are, even in terms of their fluorescence, There are no apoptotic cells. Apoptotic cells tend to be very bright and there's no dirt or schmutz in the field.And you can see that they're actually, this is a metaphase cell and that's a metaphase cell, that's a cell that's probably just exited mitosis. And I can just tell that because it looks like those are, those two sets of chromatin are very nicely oriented to each other. Like they just exited an face.So that's a good field. So, and now that I know that the exposure time and the filter set is correct, and this is gonna be software specific, I'll go and I'll take positions and now the software has memorized the X, Y, Z position of that field. And then when I do pick another field, it's, and I'll, so when I'm picking, when I'm picking new fields, but in the same, well, I'll use the, I'll move the i'll, I'll turn the shutter, I'll open the shutter and I'll look to see what I see on the screen and I'll pick fields based on that versus looking in the field.So I don't see any of my tonics in there. But again, even nicely centered, these cells will go through my PS I continue, here's a good example. Here's a good example of what I would avoid that, see how bright that is?That's very bright. That's probably remnants of an apoptotic cell. And the reason I would avoid that is because since it's so bright, when the software auto focuses, it will autofocus just on that and it won't be in the same plane as all these other cells.And so I won't get any information from that field. That looks nice. There's a, this is a pro metaphase right here, That's A metaphase.So, and I'm gonna take three positions per well. So that was three positions and now I'm going to go to my next Well, so you can, so what I will probably do is take images every 10 minutes. So it's a compromise.Lifestyle imaging is always a compromise, right? You have to image, you have to keep the cells healthy, especially if you're interested in mitosis. So you have to minimize their exposure to the fluorescent line.And, but you wanna get information. So you have to take images, you have to, so you have to compromise, you have to make a choice about what you want to capture, what kind of information you wanna capture. For our purposes, mitosis tends to take about an hour.So if we're taking 10 minute intervals, that's pretty good. We see prophase, we see metaphase, we see anaphase, and we can, we can see when there are, there are treatments or drugs or siRNAs that affect those specific cell cycle stages. So for our purposes, that's enough, but we always want more.We always want more positions or finer time and interval or something like that. So it's a compromise. So, and then I'll hit start.And so our software, it does an autofocusing pass on the first pass. So once I hit start, it should start auto autofocusing and you'll see the shutter open, open and close between auto focusing. So I'll hit start.So that's the shutter opening and closing. The Z motor is engaging and it's actually trying to find the plane with the most contrast, which will be the most in focus. You can actually see on the screen going in and out of finding the best plane of focus that might be worrisome.So what it does is it, it drives the Z motor to find the best, the most in focus plane focus, well the most in image. And then it acquires picture there and then it learns that Z position. And then we'll use that Z position for the next 12 passes.And then we'll do the auto focusing pass again. What Kind of experiments do they do? Okay, so our lab is mostly interested in understanding what regulates mitic progression, or at least I'm most interested in understanding that.So with live cell imaging and especially our multi position, long-term imaging scope, you can take, you can film cells for two or three days entering anding mitosis, and you can image multiple rounds of mitosis so you can understand. And then you can put drugs or RNAs or any kind of perturbations on the cells that you would like to study. So you can understand how, how those drugs or, or genes are, are important in regulating mitotic progression.Because it's not fixed cell work and live cell work, you can understand what, when you need to have a perturbation to affect mitosis or what stage of mitosis is affected. So it's really powerful in that respect. What, what are the main technical elements of this experiments?What are the possible problems? Well, the biggest problem besides getting the rig set up, getting the rig set up is not trivial. A lot of people have the rig, but just making sure it works well for your application.The financial element is not, you know, is not small. So there's the setting up of the apparatus and then, and then once you gather the data, there's a real data analysis issue. It takes these movie, if, so, if you're gathering 40 movies each with 30 cells, so you have 40 in 40 fields that you just filmed and each of those fields has 30 cells, then you have to sit down with each one of those movies and look at each one of those cells in that movie.So it takes a really long time to do data analysis. And that's, so it takes a week to analyze data that it took you two days to collect. So there's a, that's a very big obstacle in terms of gathering lots of data.So it's not, while it's high throughput data collection, it's not high throughput analysis. So what would you make to make this experiment really high throughput? So our lab is in the process of developing a program that does the data analysis automatically.And it's a pretty decent program. It's not perfect. The human eye is always better, but it's getting there.So What are the interesting application of this experiment? Maybe other fields you can mention? Besides cell division?You mean for the, oh, for the live cell imaging? Yes.Well, you can do cell motility assays. You can, depending on the, the microscopy that's involved, you can, you know, look at how cells, you could look at tumor development if you really wanted to.But there, you, you're, if as long as you have the right imaging set up, you can, you're pretty much not limited in terms of anything. Our scope happens to be just a wide field and we use 20 by 20 x objective. So it's a pretty low resolution set up, but that's sufficient for what we need to see.So there are, but there definitely aren't, you wouldn't be limited. Anything that has any dynamic kind of experiment, which is biology, it would be, would really benefit from lifestyle imaging. So calcium imaging, although you couldn't do it on our apparatus, that's a live cell.You definitely need live cell imaging for that. Like I said, patient assays, motility assays, those kinds of things would really benefit from live cell imaging. Would you like to tell a few words about your previous experience?How long do you work on these techniques? What do you you work on before? Wow.So in my PhD I didn't work.I did a lot of confocal microscopy, but no lifestyle imaging. And so during my postdoc I was, I helped Dr.King get this apparatus that, that we just used to set up these fragment, get that up and running. And, and so during my postdoc, I had a lot of experience with both widefield with TimeLapse imaging on our scope, which is the widefield and also TimeLapse imaging with confocal microscopy.And I would say that it's really powerful. You get a lot of information, but it's not easy to get working perfectly. So it really requires a lot of attention and a lot of attention to details at every little step of the process.And, and then you still have problems. So it's a tough application, but you can really get, if, if it's what you need to have to, to study your problem, your scientific problem, then it, it's invaluable in that respect, but it's tough. So find someone who knows what they're doing and use them.That's my advice. So good.

Langfristige Imaging Säugetierzellen mit Wide-Field-Mikroskopie

Forschung

Biologie

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

Anwendung von Licht-gehärteten Dental Adhesive Resin für Montage-Elektroden oder Mikrodialysesonden in Chronic Experimente

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

Langfristige letale Toxizität Test mit dem Krustentier Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces photo-bleaching and phototoxic effects compared to confocal microscopy, while providing 3D images with subcellular resolution. Here we present the setup of a light sheet based microscope, which is composed of an upright microscope and a small set of opto-mechanical elements for the generation of the light sheet. The protocol describes how to build, align the microscope and characterize the light sheet. In addition, it details how to implement the method for in toto imaging of C. elegans embryos using a simple observation chamber. The method allows the capture of 3D two-colors time-lapse movies over few hours of development. This should ease the tracking of cell shape, cell divisions and tagged proteins over long periods of time.

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

This protocol describes the setup of a light sheet microscope and its implementation for in vivo imaging of C. elegans embryos.

Einrichten eines Simple Light Noten Mikroskop für<em&gt; In Toto</em&gt; Imaging von<em&gt; C. elegans</em&gt; Entwicklung

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie von Pflanzenwurzeln wachsen auf der Oberfläche eines Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

LarvaSPA, Eine Methode zur Montage von Drosophila Larva für Langzeit-Zeitraffer-Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...

Simultaneous Live Imaging of Multiple Insect Embryos in Sample Chamber-Based Light Sheet Fluorescence Microscopes

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample chamber-based setups, which are specifically designed to preserve the three-dimensional integrity of the specimen and usually feature sample rotation, are the best choice in developmental biology. For instance, they have been used to document the entire embryonic morphogenesis of the fruit fly Drosophila melanogaster and the red flour beetle Tribolium castaneum. However, many available live imaging protocols provide only experimental frameworks for single embryos. Especially for comparative studies, such approaches are inconvenient, since sequentially imaged specimens are affected by ambient variance. Further, this limits the number of specimens that can be assayed within a given time. We provide an experimental framework for simultaneous live imaging that increases the throughput in sample chamber-based setups and thus ensures&#160;similar ambient conditions for all specimens. Firstly, we provide a calibration guideline for light sheet fluorescence microscopes. Secondly, we propose a mounting method for multiple embryos that is compatible with sample rotation. Thirdly, we provide exemplary three-dimensional live imaging datasets of Drosophila, for which we juxtapose three transgenic lines with fluorescently labeled nuclei, as well as of Tribolium, for which we compare the performance of three transgenic sublines that carry the same transgene, but at different genomic locations. Our protocol is specifically designed for comparative studies as it pro-actively addresses ambient variance, which is always present in sequential live imaging. This is especially important for quantitative analyses and characterization of aberrational phenotypes, which result e.g., from knockout experiments. Further, it increases the overall throughput, which is highly convenient when access to light sheet&#160;fluorescence microscopes is limited. Finally, the proposed mounting method can be adapted for other insect species and further model organisms, e.g., zebrafish, with basically no optimization effort.

Light sheet-based fluorescence microscopy is the most valuable tool in developmental biology. A major issue in comparative studies is ambient variance. Our protocol describes an experimental framework for simultaneous live imaging of multiple specimens and, therefore, addresses this issue pro-actively.

Gleichzeitige Live-Bildgebung mehrerer Insektenembryonen in probenkammerbasierten Lichtbogenfluoreszenzmikroskopen

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample ...

Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid external development, tractable genetics, and translucency of the zebrafish, Danio rerio, LSFM has delivered insights into cardiac form and function at high spatial and temporal resolution without significant phototoxicity or photobleaching. Imaging of beating hearts challenges existing sample preparation and microscopy techniques. One needs to maintain a healthy sample in a constricted field of view and acquire ultrafast images to resolve the heartbeat. Here we describe optimized tools and solutions to study the zebrafish heart in vivo. We demonstrate the applications of bright transgenic lines for labeling the cardiac constituents and present novel gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental defects and changes in heart rate. We also propose a data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging. The entire workflow presented here focuses on zebrafish embryonic heart imaging but can also be applied to various other samples and experiments.

We describe optimized tools to study the zebrafish heart in vivo with light sheet fluorescence microscopy. Specifically, we suggest bright cardiac transgenic lines and present new gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental and heart defects. A possible data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging is also provided.