This work was supported by the Intramural Research Program of the National Heart, Lung, Blood Institute of the National Institutes of Health. We thank Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germany) for providing the five LeGO vector plasmids; Christian A. Combs and Neal S. Young (NHLBI, NIH) for discussions, support and encouragement throughout this study, and Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) for assistance with tail vein injections.

Alle Mäuse wurden untergebracht und in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health behandelt, und schrieb sich in einer NHLBI Animal Care und Use Committee genehmigten Protokoll. Weiblich B6.SJL-Ptprc (d) Pep3 (b) / BoyJ (B6.SJL) und C57BL / 6 Mäuse, 6-12 Wochen alt, wurden als Spender und Empfänger verwendet sind. Eine Liste der Materialien, Reagenzien und Geräte ist in Tabelle 1 zur Verfügung gestellt. 1. Lego Transduktion von Maus HSPCs und Knochenmarktransplantation Führen Sie unten in einem zertifizierten Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) Gehäuse (Gewebekultur Haube) beschriebenen Verfahren. <ol><li> Produktion von LEGO Vektoren Encoding 5 Bilder pro Sekunde <ol><li> Verwenden Sie die lentiviralen &quot;Gene Ontology&quot; (LEGO) Vektorplasmiden, die jeweils eine andere FP Codierung von einem starken konstitutiven Promotor SFFV, darunter LEGO-Cer2 (Cerulean), Lego-G2 (EGFP), Lego-V2 (Venus), Lego-T2 (tdTomato) und Lego-C2 (mCherry) freundlicherweise von Dr. Boris Fehse (Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Deutschland) zur Verfügung gestellt; nun auch von Addgene 5-7 zur Verfügung. </li><li> LEGO Vektoren, Samen 5 x 10 6 Zellen 293T in 10 cm-Schalen (12 verwenden Gerichte für jeden Vektor) 24 h vor der Transfektion in 8 ml I10 Medien (IMDM mit 10% FCS und Glutamin / Penicillin / Streptomycin) zu erzeugen. </li><li> Transfektion der Zellen mit Calciumphosphat mit leicht modifizierten CAPHOS Kit Empfehlungen: <ol><li> Für jede Platte Mix 15 ug LEGO Vektor, 12 ug pCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE, 4 ug Zurück-TAT und 1 pg pMD2.G-VSV-G-Plasmide in Gegenwart von 50 ul 2,5 M CaCl 2, und Wasser bis zu ergeben ein 500 ul Gesamtvolumen. </li><li> Niederschlag DNA-Plasmide mit 500 ul 2x HeBS (HEPES-gepufferte Salzlösung) und Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur vor der Zugabe zu jeder Platte von 293T-Zellen. </li><li> Zellen inkubieren6 h bei 37 ° C 5% CO 2 Inkubator; entfernen Medien und fügen Sie frisches Kulturmedien 6 Stunden nach der Transfektion. </li></ol></li><li> Sammeln Kulturüberständen enthalten lentivirale Partikel von jeder Platte, täglich, für 3 Tage. Jeder Tag nach Überstand Sammlung frisch I10 Medien zu jeder Platte. <ol><li> Filtriert durch 0,22 um Poren, Pool und konzentrieren Stände durch Ultrazentrifugation auf einem SW28 Rotor für 2 h bei 71.900 xg und 4 ° C. </li><li> Resuspendieren der Überstände in 1 ml StemSpan Medien. Aliquotiert lentiviralen Bestände in 200 ul und bei -80 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Titration von Lentivirale Partikel Bestimmen Sie den Titer von LEGO Vektorpartikel in gesammelten Überstände über die Quantifizierung der Wandlereinheiten / ml mit NIH3T3-Zellen. Titer erlauben die Berechnung des Volumens eines jeden Vektors Stand benötigt, um in der gewünschten relativen Multiplizität der Infektion (MOI) führen zu VersuchszielZellen. <ol><li> Platte 5 x 10 4 NIH3T3 Zellen pro Vertiefung (Platte mit 12 Vertiefungen) in 2 ml Medium I10 einen Tag vor der Titration. </li><li> Bereiten 5-fach serielle Verdünnungen der Überstände in Vektor-I10 Medien mit Protaminsulfat ergänzt (4 mg / ml 1,000x). </li><li> Entfernen Sie die Medien aus den Zellen und ersetzen mit 500 ul Überstand Verdünnungen, die das Äquivalent von 2, 0,8, 0,32 und 0,128 ul konzentrierter Virus. </li><li> Bestimmen Sie die Nummer (No), die pro und zum Zeitpunkt der Transduktion Zellen, zählen ein Steuer gut. </li><li> 6 Stunden nach der Transduktion mit 2 ml I10 Medien und Inkubation für 3 Tage bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Ernte der Zellen aus jeder Vertiefung unter Verwendung von Trypsin-EDTA und bestimmt den Prozentsatz der fluoreszierenden Zellen (% FP) mittels Durchflusszytometrie. </li><li> Berechnung der Titer wie folgt, Mitteln der für jede Vertiefung (Verdünnung) erhaltenen Titer, was zu einem FP von 1% und 50%: Titer (Vektorpartikel / ml) = Neinx% FP / Volumen von Vektorüberstand (ml). Der Mittelwert der für jede Verdünnung erreicht, wenn der FP-% liegt zwischen 1 und 50% Titer. </li></ol></li><li> Mauszell Collection, Reinigung, Transduktion und Transplantation (in 1A schematisch dargestellt angepasst von Malide et al. 4). <ol><li> Opfern Spendermäusen von einem zugelassenen Verfahren. Ernte Knochenmark von vorderen und hinteren Gliedmaßen: sezieren humeri, Oberschenkelknochen und Schienbeine, alle Muskeln, Bänder und überschüssiges Gewebe von Knochen, über das Ende der einzelnen Knochen so nah wie möglich an der gemeinsamen geschnitten gründlich zu entfernen, und spülen Sie das Knochenmark aus der Knochen mit einem 27-0 G Nadel auf einer Spritze mit I10 Medien. </li><li> Pellet die Gesamtknochenmarkzellen für 10 min bei 500 × g, 4 ° C und Lyse roter Blutkörperchen zweimal mit 50 ml ACK-Puffer. Die Zellen in 10 ml Medium I10. </li><li> Reinige Linie negativ (Lin) Vorläuferzellen mit dem MACS Linie Verarmungs Kit gemäß einem modifizierten Satz Protocol: <ol><li> Verwenden Sie 30 ul Anti-Biotin-Mikrokugeln statt 10 ul / 10 7 Zellen; Führen Sie die Waschschritten mit I2 Medien (IMDM mit 2% FCS) anstelle von Puffer. </li><li> Legen Sie ein Waschschritt zwischen der Inkubation mit Biotin-Antikörper-Cocktail und der Inkubation mit Anti-Biotin-Mikrokugeln; und die Säule ins Gleichgewicht mit I10 anstelle von Puffer. </li></ol></li><li> Kultur Lin-Zellen für 48 h bei einer Ausgangsdichte von 5 x 10 5 Zellen / ml in StemSpan Medium mit 10 ng / ml Maus-IL-3, 100 ng / ml Maus-IL-11, 100 ng / ml humanem Flt-3 ergänzt Liganden, und 50 ng / ml Maus-Stammzellfaktor. </li><li> Übertragungs 1 bis 4 × 10 5 Zellen auf 12-Well-Platten mit RetroNectin beschichtet und Transduktion mit LEGO Überstände, die jeweils bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 6-7 bis 50% der Expressionseffizienz für jedes FP zu erzielen, in Gegenwart StemSpan Medien und Zytokine oben beschrieben und 4 g / ml Protaminsulfat. </li><li> Transduzieren Zellenmit jedem LEGO Vektor einzeln, wie in Schritt 1.3.5 beschrieben und mischen Zellen nach Transduktion (genannt Mix) oder Co-Zellen transduzieren mit allen 5 LEGO Vektor Stände gleichzeitig (als Co). Zellen zu entfernen, 24 Stunden später, einmal mit StemSpan Medien waschen ohne Zytokine und resuspendieren sie in StemSpan Medien ohne Zytokine für die Transplantation, oder übertragen Sie sie auf frisches Medium mit Zytokinen und Kultur für zusätzliche 96 h vor der konfokalen Mikroskopie und Durchflusszytometrie. <ol><li> Führen Knochenmarktransplantation durch Infusion transduziert Lin HSPCs via Schwanzveneninjektion mit 11 Gy Einzeldosis bestrahlt Empfänger (6-18 Stunden vor der Transplantation) Empfänger, in einem Volumen von 100 ul bei einer Zelldosis pro Maus entspricht 1 -4 x 10 5 Lin Zellen, die ursprünglich für die Transduktion plattiert. In jedem Experiment verpflanzen eine ganze Kohorte von Tieren, die mit der gleichen Population von transduzierten Spender BM-Zellen. </li><li> Für in-vitro-Charakterisierung der transduzierten HSPCs, Kultur werden die Zellen für weitere 4-5 Tage in StemSpan ergänzt mit Zytokinen und durch Durchflusszytometrie analysiert für Transduktionseffizienz und durch Mikroskopie für Farbvielfalt. <ol><li> Opfern einzelnen Mäusen und Abrufen von Geweben und Organen für die Bildgebung, zu verschiedenen Zeitpunkten bis zu 120 Tage nach der Transplantation. <ol><li> Spray mit Ethanol das Fell der Maus und die Haut einzuschneiden auf der Bauchseite zu vermeiden Haare Verbreitung. </li><li> Sezieren und Verbrauch nach Standardverfahren der Milz, poplitealen Lymphknoten, Lunge, Herz, Haut, Fettgewebe, Skelettmuskel, Niere, Leber, sowie der Kopf, den Zugang zu Schädeldecke. </li><li> Alternativ können Sie Schädeldecke oder ein Knochenfenster für die Live-Darstellung mehrfach im Laufe der Zeit 2,8,9 oder Bild oberflächlichen Organe gesetzt, wie die Haut und Lymphknoten im lebenden Tier. </li></ol></li><li> Zeigen einzelnen Organe in 35 mm-Nummer 0 Deckglas Kulturschalen in 50-10056; l PBS zur Abbildung sie intakt, ohne Schneiden, Fixierung oder Weiterverarbeitung wie in Schritt 2.5 beschrieben. </li><li> Für die volumetrische Bildgebung, halten die Organe in kaltem PBS bis zur Verwendung. Für Zeitraffer-Imaging gehen sofort auf die Abbildung Organe in DMEM, 10% FBS mit 20 mM HEPES bei 37 ° C </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 2. Konfokale und Zwei-Photonen-Mikroskopie und Bildanalyse <ol><li> Führen Mikroskopie mit einem Leica SP5 fünf Kanäle konfokale und Multiphotonen-System mit mehreren Leitungen Argon, Diode 561 nm, 594 nm HeNe und He-Ne-Laser mit 633 nm sichtbar ausgestattet. Verwenden Sie in 2-Photonen-Modus, einem gepulsten Femtosekunden-Ti: Saphir (Ti-Sa)-Laser, abstimmbaren zur Anregung von 680 bis 1.080 nm mit Dispersionskorrektur. Verwendung in Experimenten mit rotverschoben fps (tdTomato und mCherry-), einen optischen parametrischen Oszillator (OPO), um die Laserausgangswellenlängenbereich soweit 1,030-1,300 nm nacheinander oder gleichzeitig mit t erstrecken,er Ti-Sa-Lasers. </li><li> Bild verschiedenen Geweben mit einem HCX-IRAPO 25X-L / 0,95 NA Wassertauchziel (WD = 2,5 mm), ein HC-PLAPO-CS 20x / 0,70 NA Trockenobjektiv (WD = 0,6 mm) oder HC-PL-40X IRAPO /1.1 NA Wasserimmersionsobjektiv (WD = 0,6 mm). </li><li> Erhalten konfokalen Fluoreszenzspektren Sammeln Lambda Stacks (xyλ) des emittierten Lichts in 5 nm-Bandbreiten des sichtbaren Spektrums von KM-Zellen mit einem einzigen FP LEGO Vektor transduziert sowie der Kontrolle, nicht-transplantierten BM. <ol><li> Prozessbilder mit dem Leica LAS AF-Software v2.4.1 Referenzspektren aller 5 RP sowie der Autofluoreszenz (2A) zu erstellen. Verwendung der einzelnen FP-Spektren und den Unterschied in der Fluoreszenzhelligkeit (ausgedrückt als% der EGFP) von Cerulean (79%), Venus (156%), tdTomato (283%) und mCherry (47%) gesetzt 5 sequentielle Bildgebung Kanäle wie folgt: Cerulean (458/468 bis 482 nm), EGFP (488/496 bis 514 nm), Venus (514/523 bis 558 nm), tdTomato (561/579 bis 597 nm) und mCherry (594/618 bis 670 nm) ( <strong&gt; 2B). </li><li> Validieren genaue RP-Trennung, wie Zellen, die mit jedem einzelnen FP transduziert nur in dem entsprechenden Kanal von dem Rest (2C) sichtbar und vorhanden sind. Darüber hinaus schafft diese definierte Multi-Channel-Ansatz eine einzigartige 5-Kanäle &quot;Colorprint&quot;, die spätere Farbanalyse und klonalen Tracking ermöglicht und hat den Vorteil der Reduzierung Akquisitionszeiten im Vergleich zu spektralen Bildgebung. </li></ol></li><li> Getrennte Fluoreszenzemission, in der 2-Photonen-Modus, durch hocheffiziente individuelle dichroitische Spiegel und sammeln mit vier Kanälen nichtdescannten Detektor (NDD) wie folgt: ein dichroitischer Spiegel 568 nm, gefolgt von einem dichroitischen Spiegel bei 465 nm, gefolgt von 452/45 nm ein Emissionsfilter für SHG oder Autofluoreszenz und Cerulean, einem 525/40 nm Emissionsfilter für EGFP oder Venus, und einem 648 nm dichroitischen Spiegel und 620/60 nm Emissionsfilter für tdTomato oder mCherry. <ol><li> Strukturinformationen zu offenbaren durch Zwei-Photonen-Mikroskopie intrinsic Kontrastbildgebung von Gewebeautofluoreszenz von Elastin, NADH, (aufgeregt bei 780 nm) (wie oben beschrieben) und der zweiten Harmonischen erzeugte Signal (SHG) aus Knochen und fibrillärem Kollagen (aufgeregt bei 920 nm oder 860 nm in einem rückgestreuten gesammelt Richtung) 10,11. </li></ol></li><li> Für 3D-Volumendarstellung, sammeln Reihe von xyz Bilder (typischerweise 1 x 1 x 4 um 3 Voxel-Größe) entlang der z-Achse bei 5 um Intervallen über einen Bereich von Tiefen (150-300 um) der gesamten Knochenmark und anderen Geweben, über große Regionen mit der Kachel-Funktion der Software automatisch generiert abgesteppten Bände umfasst eine ganze Brustbein Fossa, ca. 2,5 x 1,2 mm 2 (xy) und 300 um (z) (den 2D-2E) und Movie-1. <ol><li> Bild Schädel direkt durch den Schädel Mark ohne Schneiden 2, 8. </li><li> § Brustbein entlang der Sagittalebene (Halbierung) und dannquer an der Verbindung zwischen 2 Brustbein Fosse und Bild durch die Schnittfläche 3,4,12 (Übersicht in Abbildung 1B aus Takaku angepasst et al 3). </li></ol></li><li> 4D für Zeitraffer-Bildgebung, legen Sie frisch ausgeschnittenen Kniekehle Lymphknoten, Milz, Lunge oder Schädelknochenproben uncut auf 35 mm Deckglas Nummer 0 Kulturschalen, in 50-100 ul DMEM, 10% FBS mit 20 mM HEPES bei 37 ° C und mit 2-Photonen-Ti-Sa-Anregung (860 nm) in Kombination mit konfokaler Anregung (458 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm, 594 nm) und Leica Resonanzscanner (8000 Hz / sec), wobei Z-Stapel (~ 80 um) in 20 Sekunden-Intervallen für bis zu 1 Stunde. <ol><li> Für den gleichzeitigen Drei-Farben-2P Bildgebung Ti-Sa bei 860 nm abgestimmt gleichzeitig mit dem OPO-Laser (1.130 nm auf für tdTomato abgestimmt, oder 1.140 nm mCherry) (Film 2). </li></ol></li><li> Rekonstruktion und Analyse von 3D-und 4D-Volumes Zeitabläufe <ol><li> Verwenden Imaris x64 SoftwVersion 7.6 sind, oder alternative Software-Pakete, die gefliest-Stapel von RAW-Bildern in Volumen-gemacht (3D) zu transformieren Daten von fluoreszierenden Zellen im Knochenmark und verschiedenen Geweben und sie als 3D-Rotation Filme zu exportieren, wie zuvor beschrieben, 3,4 (Movie 1) Schritt-für-Schritt-Beispiel: <ol><li> In Imaris, Bild öffnen Sie die Z-Stapel; Wählen Sie &quot;übertreffen&quot;, um das 3D-Volumen-Visualisierung angezeigt werden. </li><li> Verwenden Sie &quot;navigieren&quot;, um die Lautstärke um 360 ° zu drehen. </li><li> Wählen Sie &quot;Animation&quot;, um eine Animation zu erstellen; Schlüsselbilder verwenden, um ausgewählte Ansichten, Zoom, Rotation des Volumens hinzuzufügen; Vorschau des Films, bearbeiten, wie notwendig und speichern Sie die Datei in einem gewünschten Filmformat (zB: avi, mov). </li></ol></li><li> Zur quantitativen Bewertung der 3D-Zell und Klon Frequenz, Positionen, Größen und Verteilung, Weiterverarbeitung der Z-Stapel mit den Imaris XT Module, die MATLAB-Anwendungen Führen Abstand meas integrierensungen (mit einem Abstand Transformationsalgorithmus) und Cluster-Analyse, wie zuvor beschrieben, 3,4. Verwandeln die Sequenzen von Bildstapeln im Laufe der Zeit in die Serien gerendert vierdimensionalen (4D)-Filme mit Imaris x64-Software, und verwenden Sie vor Ort und Oberflächenanalytik für halbautomatische Verfolgung von Zellbewegung in drei Dimensionen mit autoregressiven Bewegungsalgorithmen. </li><li> Führen multispektrale Analyse von Zellen wie folgt: Entpacken Sie die Multi-Color-markierten Flecken, indem alle 5 Kanäle durch den Kanal Arithmetik der Imaris XT in einen neuen Kanal; bestimmen, für alle Spots (Zellen) die mittlere Intensität Fluoreszenz in jeder der 5 Kanäle Komponente. Exportieren Sie die Werte in Excel-Software, um die Anzeige der Grafiken einzigartigen &quot;Colorprint&quot;, dh die relative% jeder FP in einzelnen Zelle (2E Grafik) zu zeichnen. Korrigieren Sie die Daten für die Gewebe Drift eingestellt, und berechnen Zellgeschwindigkeit und Verschiebung über die Zeit, Streckenlängen, Pfade und Wege; Exportwerte in Excel software um Graphen zu zeichnen. Montieren Verbund Figuren mit Adobe Photoshop CSS-5-Software. </li></ol></li></ol>

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	<li>Lo Celso, ., C, D. T., Scadden, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+haematopoietic+stem+cell+niche+at+a+glance.">The haematopoietic stem cell niche at a glance.</a> J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).</li><li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem/progenitor+cells+in+their+niche.">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457, 92-96 (2009).</li><li>Takaku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoiesis+in+3+dimensions+human+and+murine+bone+marrow+architecture+visualized+by+confocal+microscopy.">Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy.</a> Blood. 116, e41-e55 (2010).</li><li>Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+high-resolution+second-harmonic+generation+imaging+of+endogenous+structural+proteins+in+biological+tissues.">Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues.</a> Biophys J. 82, 493-508 (2002).</li><li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+a+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals.">Intravital microscopy a novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+MYH9-related+disease+mutations+in+nonmuscle+myosin+II-A.">Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A.</a> Blood. 119, 238-250 (2012).</li></ol>

Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Wir beschreiben hier die Details eines leistungsfähigen Methodik vor kurzem für klonalen Zellverfolgung entwickelt und kombiniert die große Vielfalt, die durch kombinatorische Markierung mit 5FP-kodierenden LEGO Vektoren und Bildgebung mit Tandem-konfokale und 2-Photonen-Mikroskopie, um volumetrische und dynamische Bildgebung in lebenden Geweben zu erreichen erzeugt. Dies erweitert den Einsatz von FP-basierte Farbmarkierung durch Aufnahme konfokalen Spektral-Identität in 5 &quot;deutliche&quot; 8-Bit-Kanäle. Damit ...

A correction was made to <a href="/video/51669">In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy</a>. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.
This was corrected in the discussion from:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 30 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.
to:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 300 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

A correction was made to <a href="/video/51669">In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy</a>. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.

Erratum: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Die Produktion von Blutzellen, genannt Hämatopoese durch eine kleine Population von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen (HSPCs) gehalten. Diese Zellen befinden sich im Knochenmark (BM) in einer komplexen Mikroumgebungs Nische, bestehend aus Osteoblasten, Stromazellen, Fettgewebe und Gefäßstrukturen, die alle in der Steuerung der Selbsterneuerung und Differenzierung 1,2 gebracht. Als intakte BM traditionell unzugänglich direkte Beobachtungen wurde, bleibt die Wechselwirkungen zwischen HSPC und ihre Mikroumgebung in vivo weitgehend charakterisiertes. Bisher haben wir eine Methodik, um die 3D-Architektur von intakten BM mit Hilfe der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie und Reflexion 3 zu visualisieren. Wir gekennzeichnet Ausbau der EGFP-markierte HSPCs in der BM, aber die Verwendung von nur einer einzigen FP ausgeschlossen Analyse der Regeneration bei einer klonalen Ebene. Erst vor kurzem haben wir den Vorteil des lentiviralen Gene Ontology (Lego)-Vektoren, die konstitutiv fluorescent Proteine ​​(RP), um effizient zu markieren Zellen 4,5. Co-Transduktion HSPC mit 3 oder 5-Vektoren erzeugt eine vielfältige Palette von kombinatorischen Farben, so dass Tracking von mehreren Einzel HSPC Klonen. Markiert HSPC mit neuen Imaging-Technologie erlaubt, einzelne HSPC Homing und Transplantation in der BM von bestrahlten Mäusen Spuren kombiniert. Lego-Vektoren wurden verwendet, um HSPC mit 3 oder 5 verschiedene Rahmenprogramme (von Cerulean, eGFP, Venus, tdTomato und mCherry) markieren und folgen ihrer Transplantation im Laufe der Zeit in der BM durch konfokale und 2-Photonen-Mikroskopie, so dass klare Visualisierung von Knochen und anderem Matrixstrukturen und das Verhältnis von HSPC Klone Komponenten ihrer Mikroumgebung. HSPC wurden als die Linie negative Zellen aus C57BL / 6 Mäusen BM, der mit Lego-Vektoren transduziert gereinigt und durch Schwanzveneninjektion in Myelo-abgetragen kongenen Mäuse reinfundiert. Durch die Überwachung der große Mengen des Brustbeins BM Gewebe visualisiert wir endostalen Transplantation früh auftretendenBM Regeneration. Zellcluster mit verschiedenen Farbspektren erschien zunächst in der Nähe der Knochen und voran zentral über die Zeit. Interessant ist, dass nach mehr als 3 Wochen das Knochenmark bestand aus makroskopischen klonalen Clustern, was darauf hindeutet Ausbreitung der Blutbildung aus einzelnen HSPCs abgeleitet zusammenhängend im Knochenmark, sondern als umfassende Verbreitung HSPCs über die Blutbahn. Es war weniger Farbvielfalt am späten Zeitpunkten, was auf Schwierigkeiten bei der Wandlerlangfristige Bestandsauffüllung Zellen mit mehreren Vektoren. Zusätzlich gebildet HSPCs Cluster in der Milz, ein Organ auch die Hämatopoese bei Mäusen verantwortlich ist. HPSC abgeleiteten einzelnen Zellen konnten in Thymus als auch gelöst werden, Lymphknoten, Milz, Leber, Lunge, Herz, Haut, Skelettmuskel, Fettgewebe und Niere. Die 3D-Bilder können qualitativ und quantitativ bewertet werden, um die Verteilung der Zellen mit minimalen Störungen der Gewebe zu schätzen. Schließlich zeigen wird die Machbarkeit der Live-dynamische Untersuchungen in 4D durch die Kombination von Resonanz Scannen Multi und konfokaler Zeitraffer-Bildgebung. Diese Methodik ermöglicht nicht-invasive hohe Auflösung, mehrdimensionale Zell-Schicksal Rückverfolgung von spektral markierten Zellen Populationen in ihrer intakten 3D-Architektur und bietet ein leistungsfähiges Werkzeug in der Erforschung der Geweberegeneration und Pathologie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Production of viruses</td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">LeGO-Cer2</td>
			<td style="width:493px;">Addgene</td>
			<td style="width:216px;">27338</td>
			<td>Expression of Cerulean</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">LeGO-G2</td>
			<td style="width:493px;">Addgene</td>
			<td style="width:216px;">25917</td>
			<td>Expression of eGFP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">LeGO-V2</td>
			<td style="width:493px;">Addgene</td>
			<td style="width:216px;">27340</td>
			<td>Expression of Venus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">LeGO-T2</td>
			<td style="width:493px;">Addgene</td>
			<td style="width:216px;">27342</td>
			<td>Expression of tdTomato</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">LeGO-C2</td>
			<td style="width:493px;">Addgene</td>
			<td style="width:216px;">27339</td>
			<td>Expression of mCherry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Calciumm Phosphate Transfection Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CAPHOS-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Tissue culture dish</td>
			<td style="width:493px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:216px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">IMDM</td>
			<td style="width:493px;">Gibco, Life Technology</td>
			<td style="width:216px;">12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Fetal Bovine Serum Heat Inactivated</td>
			<td style="width:493px;">Sigma</td>
			<td style="width:216px;">F4135-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Pen Strep Glutamine</td>
			<td style="width:493px;">Gibco, Life Technology</td>
			<td style="width:216px;">10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:493px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:216px;">326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">SW28 Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:493px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:216px;">L60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Millex Syringe Driven Filter Unite (0.22um)</td>
			<td style="width:493px;">Millipore</td>
			<td style="width:216px;">SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;"></td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse cell collection, purification, transduction and transplantation</td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">ACK lysing buffer</td>
			<td style="width:493px;">Quality Biologicals Inc.</td>
			<td style="width:216px;">118-156-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Lineage Cell Depletion Kit (mouse)</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td>
			<td>130-090-858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">LS columns + tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td>
			<td>130-041-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Pre-Separation Filters (30um)</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:493px;">StemSpan SFEM serum-free medium for culture and expansion of hematopoietic cells (500mL)</td>
			<td>StemCell Technologies Inc&#160;</td>
			<td>9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">murine IL-11 CF</td>
			<td>R &#38; D Systems Inc</td>
			<td>418-ML-025/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">recombinant murine SCF</td>
			<td style="width:493px;">RDI Division of Fitzgerald Industries Intl&#160;</td>
			<td>RDI-2503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">recombinant murine IL-3</td>
			<td>R &#38; D Systems Inc</td>
			<td>403-ML-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">FLT-3 Ligand</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td>
			<td>130-096-480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">12-well plates, Costar</td>
			<td style="width:493px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:216px;">3527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Retronectin</td>
			<td style="width:493px;">Takara Bio Inc</td>
			<td style="width:216px;">T100A/B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Protamine Sulfate</td>
			<td style="width:493px;">Sigma</td>
			<td style="width:216px;">P-4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;"></td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Confocal and two-photon microscopy</td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">DMEM</td>
			<td style="width:493px;">Lonza</td>
			<td style="width:216px;">12-614F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">1M Hepes</td>
			<td style="width:493px;">Cellgro, Mediatech Inc.</td>
			<td style="width:216px;">25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Glass bottom culture dish P35G-0-20-C</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-0-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Glass bottom culture dish P35G-0-14-C</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Borosilicate coverglass; 4-well</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>155383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;"></td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Leica TCS SP5 AOBS five channels confocal and multi-photon microscope</td>
			<td style="width:493px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Chameleon Vision II -TiSaph laser range 680-1080nm</td>
			<td style="width:493px;">Coherent</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Chameleon Compact OPO laser range 1030-1350nm</td>
			<td style="width:493px;">Coherent</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCX-IRAPO-L 25x/0.95 NA water dipping objective (WD=2.5 mm)</td>
			<td style="width:493px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HC-PLAPO-CS 20x/0.70 NA dry objective (WD=0.6 mm)</td>
			<td style="width:493px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HC-PL-IRAPO 40x/1.1NA water immersion objective (WD=0.6 mm)</td>
			<td style="width:493px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;"></td>
			<td style="width:493px;"></td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:493px;">Imaris software version 7.6</td>
			<td style="width:493px;">Bitplane</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells marked by five fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy

Wir entwickelt und validiert eine Fluoreszenzmarkierung Methode zur Verfolgung von klonalen hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen (HSPCs) mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in vivo Blutbildung zu studieren mit der Maus-Knochenmark-Transplantation experimentellen Modell. Genetische kombinatorische Markierung mit lentiviralen Vektoren fluoreszierende Proteine ​​(RP) kodiert, aktiviert das Zellschicksal Mapping durch moderne Mikroskopie. Vektoren fünf verschiedenen Rahmenprogrammen codiert Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato und mCherry wurden verwendet, um gleichzeitig zu transduzieren HSPCs, Schaffung einer vielfältigen Farbpalette markierten Zellen. Imaging mittels konfokaler / Zwei-Photonen-Mikroskopie Hybrid ermöglicht die gleichzeitige hochauflösende Beurteilung der eindeutig gekennzeichneten Zellen und deren Nachkommen in Verbindung mit strukturellen Komponenten der Gewebe. Volumenanalysen über große Flächen zeigen, dass spektral kodierten HSPC-abgeleiteten Zellen nicht-invasiv in verschiedenen intakten Geweben, einschließlich Knochenmark nachgewiesen werden (BM) Für ausgedehnte Zeiträume nach der Transplantation. Live-Studien die Kombination von Video-Multirate und konfokaler Zeitraffer-Bildgebung in 4D zeigen die Möglichkeit der dynamischen zellulären und klonalen Tracking in quantitativer Weise.

Whole-Mount-3D-konfokale / 2-Photonen-Mikroskopie Rekonstruktionen der sternalen Knochenmark Zeitverlauf zeigte die Transplantation und die Expansion von transplantierten Co-5 Bilder pro Sekunde in einem Muster mit bemerkenswerten Eigenschaften: Klone erschienen klar abgegrenzt, homogen mit breiten Palette von Farben und Fortschritt zunächst markiert über die Zeit, um vorzugsweise Zellen enthalten meist eine Farbe. Konfokalen Mikroskopie-Setup und repräsentative Beispiele der bildgebenden 5 Bilder pro Sekunde markier...

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In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Kombinatorische 5 fluoreszierenden Proteinen markiert von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen in vivo ermöglicht klonalen Tracking über die konfokale und Zwei-Photonen-Mikroskopie, die einen Einblick in die Knochenmark blutbild Architektur während der Regeneration. Dieses Verfahren ermöglicht nicht-invasive Abbildung von Schicksal spektral kodierten HSPCs abgeleiteten Zellen in intaktem Gewebe für ausgedehnte Zeiträume nach der Transplantation.

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

in-vivo-clonal-tracking-hematopoietic-stem-progenitor-cells-marked

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

13.1K Aufrufe.  NHLBI/NIH.  Kombinatorische 5 fluoreszierenden Proteinen markiert von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen in vivo ermöglicht klonalen Tracking über die konfokale und Zwei-Photonen-Mikroskopie, die einen Einblick in die Knochenmark blutbild Architektur während der Regeneration. Dieses Verfahren ermöglicht nicht-invasive Abbildung von Schicksal spektral kodierten HSPCs abgeleiteten Zellen in intaktem Gewebe für ausgedehnte Zeiträume nach der Transplantation. 

Serie: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolierung und Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen (HSZ)

Forschung

Biologie

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

Tracking-Dynamics of Muscle Engraftment bei Kleintieren durch In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentivirale-vermittelte Knockdown Während Ex Vivo Erythropoese von humanen hämatopoetischen Stammzellen

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Eine grafische Benutzeroberfläche für die softwaregestützte Verfolgung der Proteinkonzentration in dynamischen zellulären Vorsprüngen

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic homeostasis have been extensively studied by HSC researchers. Mitochondrial activity levels are reflected in their membrane potentials (&#916;&#936;m), which can be measured by cell-permeant cationic dyes such as TMRM (tetramethylrhodamine, methyl ester). The ability of efflux pumps to extrude these dyes from cells can limit their usefulness, however. The resulting measurement bias is particularly critical when assessing HSCs, as xenobiotic transporters exhibit higher levels of expression and activity in HSCs than in differentiated cells. Here, we describe a protocol utilizing Verapamil, an efflux pump inhibitor, to accurately measure &#916;&#936;m across multiple bone marrow populations. The resulting inhibition of pump activity is shown to increase TMRM intensity in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), while leaving it relatively unchanged in mature fractions. This highlights the close attention to dye-efflux activity that is required when &#916;&#936;m-dependent dyes are used, and as written and visualized, this protocol can be used to accurately compare either different populations within the bone marrow, or the same population across different experimental models.

Xenobiotic efflux pumps are highly active in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and cause extrusion of TMRM, a mitochondrial membrane potential fluorescent dye. Here, we present a protocol to accurately measure mitochondrial membrane potential in HSPCs by TMRM in the presence of Verapamil, an efflux pump inhibitor.

Verbesserung der Genauigkeit der zytometrischen Bewertung des mitochondrialen Membranpotenzials in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen durch die Hemmung von Efflux-Pumpen

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production of all mature blood cells. In recent years cellular metabolism has emerged as a crucial regulator of HSC function and fate. We have previously demonstrated that modulation of mitochondrial metabolism influences HSC fate. Specifically, by chemically uncoupling the electron transport chain we were able to maintain HSC function in culture conditions that normally induce rapid differentiation. However, limiting HSC numbers often precludes the use of standard assays to measure HSC metabolism and therefore predict their function. Here, we report a simple flow cytometry assay that allows reliable measurement of mitochondrial membrane potential and mitochondrial mass in scarce cells such as HSCs. We discuss the isolation of HSCs from mouse bone marrow and measurement of mitochondrial mass and membrane potential post ex vivo culture. As an example, we show the modulation of these parameters in HSCs via treatment with a metabolic modulator. Moreover, we extend the application of this methodology on human peripheral blood-derived T cells and human tumor infiltrating lymphocytes (TILs), showing dramatic differences in their mitochondrial profiles, possibly reflecting different T cell functionality. We believe this assay can be employed in screenings to identify modulators of mitochondrial metabolism in various cell types in different contexts.

Here we describe a reliable method to measure mitochondrial mass and membrane potential in ex vivo cultured hematopoietic stem cells and T cells.

Messung des mitochondrialen Masse- und Membranpotenzials in hämatopoetischen Stammzellen und T-Zellen durch Durchflusszytometrie

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their energetic needs. However, under stress conditions such as infection or blood loss, HSCs become proliferative and rapidly produce downstream progenitor cells, which in turn further differentiate, ultimately producing mature blood cells. During this transition and differentiation process, HSCs exit from quiescence and rapidly undergo a metabolic switch from glycolysis to oxidative phosphorylation (OxPHOS). Various stress conditions, such as aging, cancer, diabetes, and obesity, can negatively impact mitochondrial function and thus can alter the metabolic reprogramming and differentiation of HSCs and progenitors during hematopoiesis. Valuable insights into glycolytic and mitochondrial functions of HSCs and progenitors under normal and stress conditions can be gained through the assessment of their extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which are indicators of cellular glycolysis and mitochondrial respiration, respectively. 
Here, a detailed protocol is provided to measure ECAR and OCR in mouse bone marrow-derived lineage-negative cell populations, which include both hematopoietic stem and primitive progenitor cells (HSPCs), using the extracellular flux analyzer. This protocol describes approaches to isolate lineage-negative cells from mouse bone marrow, explains optimization of cell seeding density and concentrations of 2-deoxy-D-glucose (2-DG, a glucose analog that inhibits glycolysis) and various OxPHOS-targeted drugs (oligomycin, FCCP, rotenone, and antimycin A) used in these assays, and describes drug treatment strategies. Key parameters of glycolytic flux, such as glycolysis, glycolytic capacity, and glycolytic reserve, and OxPHOS parameters, such as basal respiration, maximal respiration, proton leak, ATP production, spare respiratory capacity, and coupling efficiency, can be measured in these assays. This protocol allows ECAR and OCR measurements on non-adherent HSPCs and can be generalized to optimize analysis conditions for any type of suspension cells.

The method presented here summarizes optimized protocols for assessing cellular bioenergetics in non-adherent mouse hematopoietic stem and primitive progenitor cells (HSPCs) using the extracellular flux analyzer to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR) of HSPCs in real time.

Bewertung der zellulären Bioenergetik in hämatopoetischen Stamm- und primitiven Vorläuferzellen der Maus mit dem extrazellulären Flussanalysator

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Gene Therapy Applications

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene manipulation of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) in vitro makes HSPCs an ideal target cell for gene therapy. However, HSPCs moderately lose their engraftment and multilineage repopulation potential in ex vivo culture. In the present study, ideal culture conditions are described that improves HSPC engraftment and generate an increased number of gene-modified cells in vivo. The current report displays optimized in vitro culture conditions, including the type of culture media, unique small molecule cocktail supplementation, cytokine concentration, cell culture plates, and culture density. In addition to that, an optimized HSPC gene-editing procedure, along with the validation of the gene-editing events, are provided. For in vivo validation, the gene-edited HSPCs infusion and post-engraftment analysis in mouse recipients are displayed. The results demonstrated that the culture system increased the frequency of functional HSCs in vitro, resulting in robust engraftment of gene-edited cells in vivo.

The present protocol describes an optimized hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) culture procedure for the robust engraftment of gene-edited cells in vivo.

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte