Unser Protokoll stellt ein optimiertes Werkzeug zur Untersuchung des Zebrafischherzens in vivo dar und beschreibt einbettende Immobilisierungstechniken zusammen mit der Datenerfassungs- und Analysepipeline für die kardiale Bildgebung. Zebrafish ist ein kardiales Modellsystem mit einem großen Potenzial für Anwendungen wie Drug Screen. Protokolle, die eine schonende Bildgebung unter physiologischen Bedingungen ermöglichen, sind bei der Untersuchung von Herzerkrankungen von entscheidender Bedeutung.
Der hier vorgestellte Workflow konzentriert sich auf die embryonale Herzbildgebung von Zebrafischen, aber eine modifizierte Version kann auf verschiedene andere Proben und Experimente angewendet werden, einschließlich Tintenfisch, Wurm und Hydra. Beginnen Sie mit der Sammlung der Embryonen, die aus der Züchtung der gewünschten transgenen Linien gewonnen wurden. Bewahren Sie die Embryonen bei 28 Grad Celsius in einer mit E3-Fischmedium gefüllten Petrischale auf.
Verwenden Sie eine Bohrungsglasnadel, die auf einem Mikromanipulator montiert und mit einem Pico-Injektor verbunden ist, um 30 Pikogramm Alpha-Bungarotoxin-mRNA in das Eigelb von einem oder zwei Zellstadiumsembryonen zu injizieren, um den Fisch zu immobilisieren. Bewahren Sie die Eier bei 28 Grad Celsius in einer mit E3-Medium gefüllten Petrischale auf und geben Sie die Eier alle 24 Stunden in eine neue Schale mit frischem E3-Medium, bis die Bildgebung erfolgt. Um die Pigmentbildung zu verhindern, wenn der Zebrafischhintergrund kein Albino ist, übertragen Sie die Fische 25 Stunden nach der Befruchtung in eine neue Schale, die E3-Medium mit 0,2 Millimol Tyrosinase-Inhibitor 1-Phenyl-2-Thioharnstoff, auch bekannt als PTU, enthält.
Um das fluorierte Ethylen-Propylen-Röhrchen zu begradigen, legen Sie das Rohr in einen sicheren Glas- oder Stahl-Autoklavenschlauch mit dem richtigen Innendurchmesser, um die Polymerröhrchen und den Autoklaven bei 180 Grad Celsius für zwei Stunden zu passen. Sobald die Rohre Raumtemperatur erreicht haben, entfernen Sie das begradigte Polymerrohr. Verwenden Sie zur Reinigung des Röhrchens eine 50-Millimeter-Spritze, um das Röhrchen zweimal mit einem Backenhals Natriumhydroxid zu spülen.
Schneiden Sie das Röhrchen auf die Größe eines 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchens, legen Sie es für 10 Minuten in ein Zentrifugenröhrchen, das mit 0,5 Mol Natriumhydroxid und Ultraschall gefüllt ist. Spülen Sie das fluorierte Ethylenpropylenröhrchen mit doppelt destilliertem Wasser, gefolgt von 70% Ethanol. Transferröhrchen, ein frisches Zentrifugenröhrchen, enthielt 70% Ethanol und Ultraschall für 10 Minuten.
Nach dem Ultraschall spülen Sie das Röhrchen zum letzten Mal mit doppelt destilliertem Wasser und lagern Sie es in einem Zentrifugenröhrchen, das doppelt destilliertes Wasser enthält. Nach dem Auflösen von Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in E3-Medium die geschmolzene Agarose in eine Glas- oder Kunststoff-Petrischale gießen, um eine ein bis zwei Millimeter große Schicht herzustellen. Sobald die Agarose erstarrt ist, gießen Sie das E3-Medium vorsichtig auf das Agar, um ein Austrocknen zu verhindern.
Die Platte mit Paraffinfolie verschließen und bei vier Grad Celsius lagern. Tauen Sie die Stammlösung von Tricain auf und geben Sie 0,02% Tricain in das E3-Medium ohne Methylblau, um es als Einbettungsmedium zu verwenden. Verwenden Sie eine Einweg-Glaspipette, um Fische in das Einbettungsmedium zu geben.
Stellen Sie sicher, dass sich der Fisch nicht mehr bewegt und das Herz mit einer ähnlichen Geschwindigkeit wie die Kontrolle schlägt. Schneiden Sie das fluorierte Ethylenpropylenrohr mit einer Rasierklinge auf die ideale Länge. Bereiten Sie eine Spritze mit einer stumpfen Endkanüle vor.
Füllen Sie die Spritze mit Luft, montieren Sie dann das Röhrchen auf die Nadel und spülen Sie das verbleibende Wasser vorsichtig aus, indem Sie die Spritze entleeren. Als nächstes füllen Sie das fluorierte Ethylenpropylenröhrchen, das auf einer Spritze montiert ist, mit Medien. Führen Sie einen Embryo in die Röhre ein, halten Sie den Fischkopf nahe am Röhrenende und vermeiden Sie die Bildung von Blasen.
Schneiden Sie mit einer Rasierklinge vorsichtig den Schlauch am Rand der stumpfen Endkanüle oder Nadel ab. Nachdem Sie die Flüssigkeit auf der Oberseite der mit Agar überzogenen Schüssel entsorgt haben, tauchen Sie das Röhrchen direkt in das Agar. Drehen Sie das Rohr und nehmen Sie es heraus, um den Stecker aus dem Agarosebett zu lösen.
Überprüfen Sie das Vorhandensein des Agarstopfens am Ende des Röhrchens. Für die Langzeitbildgebung schneiden Sie drei bis fünf Löcher in das Rohr in jeder Himmelsrichtung, mindestens fünf Millimeter über dem Ende des Fisches, indem Sie eine Rasierklinge senkrecht zur Achse des Rohres platzieren und einen Schnitt in das Rohr bei 30 Grad machen, bis das Montagemedium erreicht ist. Machen Sie dann einen zweiten Schnitt bei 180 Grad, um ein Loch zu erzeugen, und rollen Sie das Rohr, um die Schnitte klar zu visualisieren.
Übertragen Sie den montierten Embryo in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen mit Einbettungsmedien, bis es zum Abbild bereit ist. Montieren Sie das Röhrchen in den Probenhalter und füllen Sie die Bildgebungskammer mit Einbettungsmedien. Legen Sie den Probenhalter auf die Bühne, wobei die Probe in die Kammer eintaucht.
Überprüfen Sie die Gesundheit der eingebetteten Fische, indem Sie die Herzfrequenz visuell beurteilen, und wenn der Herzschlag zu langsam ist, entsorgen Sie die Probe. Verwenden Sie für eine reproduzierbare Bildgebung immer die gleiche Probenposition und drehen Sie den Fisch so, dass sich beide Augen in der Fokusebene befinden. Drehen Sie den Fisch dann 48 Stunden nach der Befruchtung um etwa 20 bis 30 Grad gegen den Uhrzeigersinn.
Wenn sich der Fisch an die Laserleistung angepasst hat, wählen Sie die Beleuchtungsseite, die die beste Bildqualität bietet. Zeichnen Sie auf jeder Z-Ebene vier bis fünf Herzschläge mit 300 Bildern pro Sekunde oder mehr auf. Um das schlagende Herz aufzuzeichnen, bewegen Sie die Probe schrittweise durch das Lichtblatt und verwenden Sie einen Z-Abstand von ein bis zwei Mikrometern, um die gesamte Tiefe des Herzens abzudecken.
Laden Sie die 4D-Datei in eine 3D-Rendering-Software, um die Daten zu untersuchen und Filme des gerenderten Zebrafischherzens zu generieren. 48 Stunden nach der Befruchtung hat sich das Herz gerade einer Schleife unterzogen und verfügt über zwei Kammern, den Ventrikel und den Vorhof, muss aber die Klappen noch entwickeln. Die verschiedenen Herzstrukturen wie Ventrikel, atrioventrikulärer Kanal, Atrium, Zuflusstrakt und Abflusstrakt sind leicht unterscheidbar.
Die Daten zeigten präzises Schlagen und zeigten komplexe Wechselwirkungen zwischen den beiden Zellschichten des Herzens, dem Myokard, einer einzelligen Muskelschicht, die sich zusammenzieht und Kraft erzeugt, und dem Endokard, einer einzelnen Zellschicht, die das Herz mit dem Gefäßsystem verbindet. Das Wichtigste ist, den Probenzustand und den konsistenten Herzschlag unter einem Stereoskop immer zu überprüfen. Während herkömmliche Techniken oft die Form oder Funktion des Herzens beeinflussen, liefern uns unsere Methoden dynamische, unbeirrte Daten des schlagenden Herzens, die uns helfen, das Wesentliche des frühen embryonalen Herzens zu verstehen.
