Wir danken allen Mitgliedern der Lenne und Bertrand Labors, insbesondere Olivier Blanc für Software-Entwicklung und Jérémie Capoulade zur Diskussion. Wir danken auch dem PICsL-IBDM Bild Anlage, insbesondere Claude Moretti und Brice Detailleur für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus ATIP CNRS (P.-FL und VB) unterstützt, die Labex INFORM Zuschuss (P.-FL und VB) und einen Zuschuss von Sanofi-Aventis (VB). Wir erkennen France-BioImaging Infrastruktur von der Agence Nationale de la Recherche unterstützt (ANR-10-InSb-04-01, als &quot;Investissements d&#39;Avenir&quot;).

1. Einrichten des Lichtblattes und der Erfassungspfad Abbildung 1 zeigt ein allgemeines Schema der optischen Aufbau. <ol><li> Platzieren und befestigen Sie das Mikroskop und die Laser auf dem optischen Tisch. </li><li> Kombinieren Laser 488 nm, 561 nm und 405 nm mit den entsprechenden dichroitischen Spiegeln. Nach der dichroitischen Spiegel haben die Laser genau miteinander ausgerichtet werden. Man beachte, dass die Auswahl der Laserwellenlängen, dichroitische Spiegel und optische Filter ist aus den Absorptionsspektren der bestimmten Fluoreszenzmarkierungen in den Experimenten verwendet wird, bestimmt. </li><li> Legen Sie die akustisch-optische Filter (AOTF). Verwenden Sie das Testblatt des Lieferanten, die Frequenz und die Macht des AOTF einzustellen. Wenn gut ausgerichtet ist, etwa 90% der Laserleistung bei einer maximalen Abstimmung, wie durch einen Leistungsmesser gemessen übertragen. Beachten Sie, dass einige Laser kann vollständig durch Software gesteuert werden, welche der AOTF unnötig machen könnte. </li><li> Zeigen und fixierendas Teleskop. Beachten Sie, dass das Teleskop aus zwei Linsen, die den Strahl auf eine Breite gleich oder größer als der Durchmesser des hinteren Apertur des Beleuchtungsobjektivlinse zusammen erweitern. Das Objektiv mit der kleinsten Brennweite zuerst kommen sollte. </li><li> Platz, ausrichten und das Sehrohr nach oben bringen den optischen Weg näher an der Rückseite Öffnung der zylindrischen Linse. Beachten Sie, dass die beiden Spiegel des Periskop in einer Weise, dass ihre lange Achse wird mit auf die Neigung des Spiegels, um den vollständig expandierten Strahl zu reflektieren montiert. </li><li> Setzen Sie die Zylinderlinse neben dem Periskop Ausgang. Beachten Sie, dass die Zylinderlinse fokussiert den Strahl in eine Richtung und lässt sie kollimiert in der anderen Richtung, wodurch ein leichtes Blatt bildet. </li><li> Neuausrichtung der resultierende Lichtbogen mit Hilfe der Beleuchtung Objektiv. Beachten Sie, dass der Bildbrennpunkt des Beleuchtungsziel sollte mit dem Gegenstandsbrennpunkt des Erfassungsziel übereinstimmen. Projizieren Sie den Strahlauf einem Bildschirm (beispielsweise einer Mauer) in einem großen Abstand. Bewegen Sie die Beleuchtungsobjektivs entlang der Strahlachse Beleuchtung auf den Bildschirm scharfen Konturen des Lichtblattes erhalten. </li><li> Legen Sie die Quad-Linie (405/488/561/638) Emissionsfilter in dem Ort, an dem Mikroskop (Würfel) reserviert. </li><li> Legen Sie die EMCCD Kamera am Mikroskop Ausgang. </li><li> Befestigen Sie die erste manuelle Übersetzung der Bühne auf dem Mikroskoptisch durch Schrauben in Löchern in den Mikroskoptisch gebohrt. Beachten Sie, dass der Rand der Übersetzungsstufe bei etwa 2 cm von der Mitte des Mikroskoptisches positioniert werden, so daß die Küvette unter der Nachweisobjektivlinse zentriert. </li><li> Befestigen Sie die zweite manuelle Übersetzung Bühne, auf der ersten. Die Richtungen der beiden Stufen müssen senkrecht (X-und Y-Übersetzungen) sein. </li><li> Befestigen Sie den Z-Piezotisch an der Spitze der beiden vorherigen Stufen. Beachten Sie, dass eine motorisierte Stufe kann anstelle des piezoelektrischen Bühne verwendet werden. </li><li> Befestigen Sie die Küvette holder (siehe Abbildung 2) an der Spitze der Stufen. Die Küvette wird somit an der Kreuzung der Beleuchtungspfad und dem Erfassungspfad, die senkrecht zueinander sind, platziert werden. </li></ol> 2. Überprüfung des Lichtblattes <ol><li> Füllen einer Glasküvette mit Fluoreszenzlösung, und auf dem Probenhalter an dem Schnittpunkt der beiden optischen Wege. Der Lichtbogen ist somit sichtbar. Es hat horizontal ist, und symmetrisch / zentriert in Bezug auf die Detektionsobjektivlinse. </li><li> Entfernen Sie die Zylinderlinse und erwerben Sie ein Bild, um die Dicke des Lichtblattes messen. Beachten Sie, dass die Dicke der Lichttafel hängt von der numerischen Apertur (NA) der Beleuchtungsobjektivlinse (etwa 3-4 &amp;mgr; m für NA = 0,3). Beachten Sie, dass für eine gegebene Linse kann die Dicke der Licht-Folie durch die Verringerung der Größe des Strahls in die hintere Apertur mit einem Schlitz erhöht werden. Beachten Sie, dass fluoreszierende Mikrosphären können verwendet werden, um die Axt zu messenial und lateralen Auflösung des Mikroskops. </li><li> Setzen Sie die Zylinderlinse vor dem Start des Experiments. </li></ol> 3. Die Montage C. elegans Embryonen Die folgenden Schritte sind in Fig. 3 dargestellt. <ol><li> Verwenden eines diamantMarkierungsStift, um ein Stück einer Glasplatte von 10 x 20 x 1 mm geschnitten. </li><li> Bereiten Sie 5% Bacto-Agar in Wasser kochen und pflegen sie in einem Heizblock bei 60 ° C </li><li> Dann werden 50 &amp;mgr; l Poly-L-Lysin auf einer Seite des Zuschnittes von Folie trocknen lassen. </li><li> Legen Sie ein Mikroskop-Objektträger auf der Bank und zu beheben. </li><li> Juxtapose den Schnitt Stück Folie mit dem festen Rutsche und einen Tropfen geschmolzenen Agar auf der Oberseite. Drücken Sie die Agar mit einem anderen sauberen Objektträger, um eine dünne Agar-Pad erhalten. </li><li> Lassen Sie die Agar-Pad, um vor dem Entfernen der Oberschlitten trocknen. </li><li> Schneiden Sie die Agar-Pad auf der Seite der festen Folie, um einen Überschuss von etwa 3 mm o verlassenf-Agar und entfernen sanft die feste Folie. </li><li> In 50 ul von Poly-L-Lysin auf dem Agar und lassen Sie es vollständig trocknen. </li><li> Setzen trächtige Würmer in M9-Medium in einem Uhrglas. </li><li> Schneiden die Würmer auf der Ebene der Vulva mit einem Skalpell, um die Embryonen zu lösen. </li><li> Unter einem Fernglas erkennen Sie die Embryonen im Stadium von Interesse und sammeln Sie sie mit Hilfe eines Mikrokapillar Pipette. </li><li> Zeigen die Embryonen auf dem Teil des Agars mit Poly-L-Lysin, das von dem Schnittstück des Schiebers ragt beschichtet. Legen Sie die Embryonen nur an der Grenze der Folie. Die Embryonen auf dem Rand des Agar positionieren nicht, weil sie nicht stabil genug. Entfernen Sie vorsichtig die Flüssigkeit, so dass die Embryonen werden auf der Poly-L-Lysin-Schicht-Stick. </li><li> Schnell richten Sie die Embryonen, um ein Austrocknen zu vermeiden. </li><li> Setzen Sie den Schnitt Folie in einer Petrischale aus Kunststoff und sanft hinzufügen M9-Medium, um die Folie zu bedecken. </li><li> Überprüfen unter einem Binokular, dass die Eier noch auf den Agar fest. </li&gt; </ol> 4. Aufnahme von C. elegans Entwicklung <ol><li> Befestigen Sie die vorherige Vorbereitung (Schnitt Rutsche, Agar-Agar und Embryonen) in den Probenhalter und legen Sie sie in eine Küvette. Abbildung 4 beschreibt die hausgemachten Halter und Abbildung 5 zeigt eine Ansicht der Küvette in Beobachtung Kontext. </li><li> Befestigen Sie die Küvette auf dem piezoelektrischen Bühne. </li><li> Ermitteln Sie die Position der Embryonen mit Hellfeldbeleuchtung. </li><li> Starten Sie das hausgemachte Software-Steuerung der AOTF, die Kamera und den piezoelektrischen Bühne. Beachten Sie, dass eine freie Software, wie z. B. Mikromanager, können ebenfalls verwendet werden. </li><li> Wählen Sie die Laserlinie und Leistung (AOTF). </li><li> Stellen Sie die Position des Lichtblattes mit der Stufe 3 Richtungen Unterstützung der Zylinderlinse und der Beleuchtungslinse. Bewegen der Plattform entlang der seitlichen Richtung (X), um die hellste Signal zu erhalten. Stellen Sie dann die Z-Position des Lichtblattes und die Längsposition (Y), um th erhaltene beste Signal-Rausch-Verhältnis. Beachten Sie, dass die Position des Lichtblattes Fokus muss möglicherweise von einem Embryo zu einem anderen eingestellt werden, um Unterschiede in der Lichtpfadlängen zu korrigieren. </li><li> Zeitraffer-Bilder zu erwerben, wählen Sie die Belichtungszeit, zu gewinnen, Zeit zwischen zwei Bildern, als auch die Anzahl der Bilder, die erworben werden sollen, und die Laserleistung. Für zwei Farberfassung, wählen Sie eine zweite Laserlinie. Zwei Farbbilder werden nacheinander erworben. </li><li> Um az-Stack zu erwerben, wählen Sie auch den Abstand zwischen den zwei Scheiben, und die Anfangs-und Endposition des piezoelektrischen. </li></ol>

<ol>
	<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136, 1963-1975 (2009).</li><li>Reynaud, E. G., Krzic, U., Greger, K., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet-based+fluorescence+microscopy:+more+dimensions,+more+photons,+and+less+photodamage.">Light sheet-based fluorescence microscopy: more dimensions, more photons, and less photodamage.</a> HFSP J. 2, 266-275 (2008).</li><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 100, 64-119 (1983).</li><li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans.">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods Cell Biol. 106, 377-412 (2011).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverted+selective+plane+illumination+microscopy+(iSPIM)+enables+coupled+cell+identity+lineaging+and+neurodevelopmental+imaging+in+Caenorhabditis+elegans.">Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17708-17713 (2011).</li><li>Giurumescu, C. A., Kang, S., Planchon, T. A., Betzig, E., Bloomekatz, J., Yelon, D., Cosman, P., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+semi-automated+analysis+of+morphogenesis+with+single-cell+resolution+in+complex+embryos.">Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos.</a> Development. 139, 4271-4279 (2012).</li><li>Gao, L., Shao, L., Higgins, C. D., Poulton, J. S., Peifer, M., Davidson, M. W., Wu, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+Imaging+beyond+the+Diffraction+Limit+of+3D+Dynamics+in+Thickly+Fluorescent+Specimens.">Noninvasive Imaging beyond the Diffraction Limit of 3D Dynamics in Thickly Fluorescent Specimens.</a> Cell. 151, 1370-1385 (2012).</li><li>Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiview+light-sheet+microscope+for+rapid+in+toto+imaging.">Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging.</a> Nat Methods. 9, 730-733 (2012).</li><li>Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-speed+imaging+of+entire+developing+embryos+with+simultaneous+multiview+light-sheet+microscopy.">Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy.</a> Nat Methods. 9, 755-763 (2012).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even+fluorescence+excitation+by+multidirectional+selective+plane+illumination+microscopy+(mSPIM).">Even fluorescence excitation by multidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM).</a> Opt Lett. 32, 2608-2610 (2007).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Einstellung der Lichtbogen-Mikroskopie in vivo-Bildgebung von C. elegans Embryonen. Die optischen Elemente, die zum Erstellen und richten Sie den Lichtbogen, darunter Laser, Strahlaufweitung, Bündelung und Fokussierung Linsen, kann leicht auf einer optischen Bank montiert werden. In Kombination mit einem aufrechten Mikroskop für die Detektionspfad und der Kamera bietet dies eine einfache Lösung für das Einrichten eines Lichtschnittmikroskop. Diese Geometrie macht die Probenumgebung einfach. Die lebende Probe wird in eine Glasküvette, die gehalten wird, angeordnet und durch eine begrenzte Anzahl von mechanischen Teilen verschoben angeordnet ist. Als Blattbeleuchtung Mikroskopie ist ein weites Feld Technik mit Auftrennung wird nur ein einziges motorisierte Achsen-Bewegung für die 3D-Bildgebung erforderlich. Dies begrenzt das Erfordernis der Synchronisation auf einen einzigen Scanelement und erleichtert die Software-Entwicklung. Im Vergleich zu unseren ISPIM 6 aufrecht geory ermöglicht die Verwendung von hohen NA Objektiv für die Erkennung. Im Vergleich zu SPIM Aufbauten mit Objektivlinsen in der horizontalen Ebene die Befestigung der Probe und der Abbildungs ​​einer Reihe von Embryonen zu erleichtern. Insgesamt ist die Implementierung dieser Technik einfach und kann mit wenig Erfahrung in der Optik erreicht werden. Dies ist eine günstige Alternative zum konfokalen Mikroskopen mit den Vorteilen einer höheren Geschwindigkeit und geringere Phototoxizität, aber Nachteil einer geringeren axialen Auflösung. Wir haben auch eine einfache und reproduzierbare Weise, C. Halterung entwickelt elegans Embryonen für die in vivo-Bildgebung unter Verwendung dieses Systems. Der Montagevorgang ist schnell (15 min) und ist geeignet für den täglichen Experimenten. Für C. elegans-Bildgebung, die Vorteile dieser einfachen Aufbau sind mindestens zwei Falten (i) in toto Abbildungs ​​möglich ist, ohne Drehung und damit die 3D-Rekonstruktion ist einfach; (Ii) Probe Montage ist einfach und mehrere Embryonen nacheinander abgebildet werdenauf derselben Folie. Wir zeigten Beispiele von Zeitraffer-Filmen mit ausreichender zeitlicher Auflösung zu Zellteilungen und Zellformänderungen zu beobachten. Die Macht der Lichtbogen-Mikroskopie zu untersuchen C. elegans Entwicklung wurde auch kürzlich von anderen 6, 7, 8 dargestellt. Daher wird diese Technik sehr nützlich, um die Morphogenese und Strukturieren der Studie C. elegans Embryo. Kann dieses System auch verwendet werden, um die Entwicklung von anderen Modellorganismen analysieren? Es ist wichtig zu erkennen, dass die Umsetzung der Blattbeleuchtung Mikroskopie für kleine und transparent Organismus wie C. elegans ist weniger streng als für größere Organismen wie Drosophila-Embryonen. In toto Bildgebung von Drosophila erfordert in der Regel Rotation und Multi-View-Rekonstruktionen 9, 10. Anregung von zwei Seiten mit kollineare Anregung Objektive können auch reduzierte die Schatteneffekte durch die Dämpfungs verursachtIon des Lichts 11. Dennoch ist das Setup hier vorge noch Bild einer Seite der Drosophila-Embryonen angepasst, mit geringem Bleichen und niedrigen photoxicity. Diese Einrichtung könnte auch hilfreich, wenn Bilder klein und transparent Embryonen wie Seescheiden oder Zebrafisch sein.

Die Ausbildung und Formgebung des Organismus beinhaltet Zellbewegungen, Änderungen der Zellform, der Zellteilung und Zelldifferenzierung. Das Verständnis der Progression und Koordination dieser Prozesse erfordern schnelle Imaging-Tools mit drei Dimensionen Fähigkeit und subzellulärer Auflösung. Zu den Techniken, mit diesen in-vivo-Imaging-Funktionen, Lichtblatt-Beleuchtung Mikroskopie auch als Einzel / selektiven Plane Illumination Mikroskopie hat den einzigartigen Vorteil der Herstellung von Low-phototoxische Effekte und Low-Photobleaching 1,2. In Blatt Beleuchtung Mikroskopie wird die Probe von der Seite durch einen Lichtbogen, der die optische Schnitte führt beleuchtet. Der Beleuchtungspfad und der Detektionspfad sind senkrecht zueinander und der Lichtbogen wird ausgerichtet, um mit der Objektbrennebene der Objektivlinse Detektion zusammenfallen. Die Probe wird an dem Schnittpunkt der beiden Pfade angeordnet ist, einnd entlang der Erfassungsachse bewegt werden, um 3D-Bildgebung zu ermöglichen. Nur die interessierende Ebene beleuchtet wird und alle Punkte dieser Fläche werden gleichzeitig erfasst. Dies erhöht die Aufnahmegeschwindigkeit und verringert Photobleichen sowie Phototoxizität im Vergleich zur konfokalen Mikroskopie 3. Praktisch ist Blatt Beleuchtung Mikroskopie einfach zu installieren und align: für zweidimensionale Bildgebung notwendig weder für den Erfassungsteil, noch für die Beleuchtungsteil ist kein Scannen; als Weitfeldtechnik mit Auftrennung kann die dreidimensionale Bildgebung durch eine einzige Achse der Bewegung des Bühnen Halten der Probe erhalten werden. Hier präsentieren wir die Einrichtung eines einfachen Lichtmikroskop Blatt und seine Umsetzung in toto Bildgebung von C. elegans Embryonen. C elegans Embryonen sind gut geeignet, um in vivo ima lebenGing aufgrund ihrer Transparenz, invariant Abstammung und stereotype Zelle positioniert 4,5. Das entwickelte Lichtblatt-Setup basiert auf einem Standard aufrechten Mikroskop zur Erkennung basiert. Die nachstehende Protokoll beschreibt, wie zu bauen und richten Sie die Anregung Modul / Pfad, zu testen und zu charakterisieren den Lichtbogen und montieren Sie die Probe für die 3D-Bildgebung. Es bietet auch Beispiele für mit dem Setup auf verschiedenen Stämmen, fluoreszierende Marker erworben Zeitraffer-Filme.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td>SPIM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Detection</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>upright microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axiophot 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>100xW objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm)&#160;</td>
			<td>NIKON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>EMCCD back illuminated</td>
			<td>ANDOR</td>
			<td>DU-885K-CS0-#VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Illumination</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>LASER 488nm / 60mW</td>
			<td>TOPTICA</td>
			<td>iBeam smart</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>LASER 405nm / 120mW</td>
			<td>TOPTICA</td>
			<td>iBeam smart</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td>LASER 561nm / 500mW</td>
			<td>COBOLT</td>
			<td>JIVE 500</td>
			<td>&#160;for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638</td>
			<td>AHF</td>
			<td>F57-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Dichroic 405</td>
			<td>AHF</td>
			<td>F38-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Dichroic 488</td>
			<td>SEMROCK</td>
			<td>Di01-R488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>AOTF</td>
			<td>AA</td>
			<td>AOTFnC-400.650-TN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>mirror</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>lens 50mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td></td>
			<td>telescope 5X</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>lens 200mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td></td>
			<td>telescope 5X</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>periscope</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>RS99/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cylindrical lens f=100mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>ACY254-100-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>10X NA 0,3</td>
			<td>NIKON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>xyz stage</td>
			<td>NEWPORT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sample</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Bectkton Dickinson</td>
			<td>214010</td>
			<td>5% in water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Poly-L-Lysine solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L</td>
			<td>Havard Appartus</td>
			<td>30-0019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Aspiration tube (mouth pipette)</td>
			<td>Dutsher</td>
			<td>55005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>M9 medium:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>KH2PO4 (3g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Na2HPO4 (6g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>NaCL (5g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>MgSO4 (1mM final)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cuvette holder</td>
			<td>HOME MADE</td>
			<td></td>
			<td>made by Brice Detailleur&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>sample holder</td>
			<td>HOME MADE</td>
			<td></td>
			<td>made by Claude Moretti&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>x stage</td>
			<td>NEWPORT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>coverslip 50x20x1mm</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td></td>
			<td>cut then in 10x20x1mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>piezo electric stage with amplifier/controller</td>
			<td>PI</td>
			<td>P-622.ZCD / E-625.CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cuvette 40mmx40mmx10mm</td>
			<td>HELLMA</td>
			<td>704.002-OG.40 mm- 10mm high</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Diamond Point Glass Marking Pencil</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td>C++ (Qt) home made software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>developed by Olivier Blanc and Claire Chard&#232;s, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

setting up a simple light sheet microscope for in toto imaging of c. elegans development

Schnelle und phototoxische bildgebenden Verfahren sind Voraussetzung, um die Entwicklung von Organismen in toto zu studieren. Lichtbogen basiert Mikroskopie reduziert Fotobleichen und phototoxische Effekte im Vergleich zu der konfokalen Mikroskopie und bietet 3D-Bilder mit subzellulärer Auflösung. Hier stellen wir den Aufbau einer Lichtschnittmikroskop basiert, die von einem aufrechten Mikroskop und einen kleinen Satz von opto-mechanischen Elementen für die Erzeugung des Lichtblattes zusammengesetzt ist. Das Protokoll beschreibt, wie zu bauen, richten Sie das Mikroskop und prägen das Lichtblatt. Außerdem enthält es, wie die Methode in toto Abbildung C zu implementieren elegans Embryonen mit Hilfe eines einfachen Beobachtungskammer. Das Verfahren ermöglicht die Erfassung von 3D-Zwei-Farben Zeitraffer-Filme über einige Stunden der Entwicklung. Dies sollte die Verfolgung der Zellform, Zellbereiche und markierte Proteine ​​über lange Zeiträume zu erleichtern.

Drei 3D Zeitrafferaufnahme aus drei verschiedenen Experimenten C. elegans-Stämmen veranschaulichen die Art von Daten, die unter Verwendung des oben beschriebenen Lichtschnittmikroskopaufbau erhalten werden können. Wir überprüften, dass unter diesen Bedingungen die Embryonen entwickeln, mit normaler Geschwindigkeit und überleben die Bildgebung, im Einklang mit früheren Berichten darauf hinweist, dass SPIM Bildgebung verursacht nur geringe Phototoxizität Ebenen in C. elegans Embryonen 6,7. Der erste Stamm drückt eine Histon-GFP (zuIs178; stIs10024) fusioniert. Aufzeichnung wurde während 2 Stunden unter einem Stapel von Scheiben 20 (Abstand zwischen den Schichten 1 um) genommen jede 37 s durchgeführt. Fig. 6 veranschaulicht eine Ebene des Stapels zu verschiedenen Zeitpunkten. Beide interphasic Kerne (Pfeil) und kondensierte mitotischen Chromatin (Pfeilspitze) sind deutlich sichtbar. Der zweite Stamm drückt eine Tubulin-GFP (ruIs57) fusioniert und ein Histonzu mCherry (; stIs10226 itIs37) fusioniert. Aufzeichnung wurde während 16 min mit einem Stapel von Scheiben 20 (Abstand zwischen den Schichten 1 um) genommen jede 105 sec durchgeführt. Fig. 7 zeigt verschiedene Ebenen des Stapels und zu verschiedenen Zeitpunkten. Der zugehörige Film 1 zeigt 3D-Rekonstruktionen in 3 aufeinander folgenden Zeitpunkten. Während der Teilung der mitotischen Spindel (grün) und kondensierte Chromosomen (rot) sind deutlich sichtbar so dass die Verfolgung der Zellteilung Orientierungen während der Entwicklung. Der dritte Stamm drückt die Apolipoprotein VIT-2 bis GFP (pwIs23) fusioniert und eine Membran gebunden mCherry (ltIs44). Aufzeichnung wurde während 25 min mit einem Stapel von Scheiben 10 (Abstand zwischen den Schichten 1 um) genommen alle 30 Sekunden durchgeführt. Fig. 8 zeigt verschiedene Ebenen des Stapels und zu verschiedenen Zeitpunkten. Die schnellen Bewegungen der Eigelb-Lipoprotein-Partikel (grün) innerhalb der Zellen können leichtgefolgt. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1: SPIM optische Einrichtung der Beleuchtungs-und Detektionseinheiten, Vorder-und Unteransichten zusammen. In der Beleuchtungseinheit, die Laser kombiniert durch die dichroitischen Spiegel in das AOTF, die die Leistung jedes Lasers unabhängig steuert. Dann erhöht das Teleskop die Größe des Strahls durch 4-fach und das Periskop bringt es auf die Höhe des Mikroskops. Die Zylinderlinse bildet den Lichtbogen, die durch die Beleuchtung Ziel neu ausgerichtet wird. Die Erfassungseinheit in der aufrechten Mikroskop integriert und wird hauptsächlich durch die Erfassungslinse, die Filter, die Tubuslinse und EMCCD besteht. Die Probe wird an dem Schnittpunkt zwischen der Beleuchtungs-und Detektionswegen angeordnet. Ein piezoelektrischer Phase ermöglicht vertikale (Z) Verschiebungen der Probefür 3D-Akquisition. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig2highres.jpg" width="500" /> Figur 2:. Küvettenhalter Der Halter besteht aus 3 Aluminium-Platten und auf dem piezoelektrischen Stufe eingeschraubt. Die Glasküvette wird durch eine Feder (in rot) gehalten. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3: Montage der C-Protokoll elegans Embryonen für SPIM Experimenten. Ein Schnittstück aus Glas mit Poly-L-Lysin beschichtet ist. Ein Kissen aus Agar auf der beschichteten Oberfläche positioniert. Poly-L-Lysin wird dann auf die Agar-Pad aufgenommen. Schließlich C. elegans Embryonen werden auf der Poly-L-Lysin beschichteten Agar Kissen ausgerichtet sind. Abbildung 4: Probenhalter. Die Halterung passt in die Innenmaße der Glasküvette. Zwei Federn (in rot) halten den Glasobjektträger (in Abbildung 3 beschrieben). Diese Halterung wird dann im Inneren des Glas Küvette setzen. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig5highres.jpg" width="500" /> Figur 5:... Probenhalter in der Beobachtungs Zusammenhang Embryonen werden auf dem Objektträger nach dem Protokoll fasste in Fig. 3 immobilisiert wird der Schieber durch die in Fig. 4 beschriebenen Probenhalter gehaltenen Probenhalter in der Glasküvette eingesetzt, durch die in Fig. 2 beschriebene Halter gehalten. Lichtblattes horizontal und illuminates die Embryonen von der Seite. Die Detektionsobjektivlinse vertikal über der Probe. <img alt="Fig. 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig6highres.jpg" width="500" /> Abbildung 6: Aufnahme eines C. elegans Embryo eine Histon :: GFP-Fusionsebene ausdrückt Einzelbilder eines transgenen Embryos Expression eines Histon :: GFP-Fusions (zuIs178; stIs10024) zu verschiedenen Zeitpunkten aus einem 3D-Bilder Zeitraffer-Aufnahme extrahiert:.. Stapel von 20 Scheiben (gemacht Abstand zwischen den Schichten 1 m); Belichtungszeit pro Stück: 30 ms; Zeitintervall zwischen den Stapeln: 37 sec; Gesamterfassungszeit: 2 Stunden. Pfeil: interphasic Kern, Pfeilspitze: mitotischen Chromatin kondensiert. Bei t = 0 min der Embryo im 2-Zellen-Stadium und bei t = 120 min der Embryo wie unter normalen Entwicklungs s erwartet enthält etwa 70 Zellengepinkelt (beachten Sie, dass nur die in einer einzigen Ebene enthaltenen Zellen sichtbar sind in den Bildern und nicht alle Zellen des Embryos). Die Macht der Beleuchtung war 30 uW bei 488 nm (gemessen am Ausgang des Beleuchtungsziel). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure6.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video zu sehen.</a> <img alt="Fig. 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig7highres.jpg" width="500" /> Abbildung 7: Aufnahme eines C. elegans Embryo eine Tubulin :: GFP-Fusions ausdrücken und ein Histon :: mCherry Fusion. Bilder aus einem 3D Zeitrafferaufnahme eines C extrahiert elegans Embryo eine Tubulin :: GFP-Fusions (ruIs57) und einen Histone :: mCherry Fusion (itIs37; stIs10226) ausdrückt. Aufnahmebedingungen: Übernahme von einem Stapel von 20 Scheiben (Abstand zwischen Scheiben einum) alle 105 sec; Gesamtaufnahmezeit: 16 min; Belichtungszeit: 200 ms für jeden Kanal. Feld A zeigt die 10 Scheiben des gleichen Stapels. Panel B zeigt die gleichen Scheibe alle 210 Sekunden. Die Macht der Beleuchtung war 30 uW und 300 uW, für 488 und 561 nm Laser, bzw. (gemessen am Ausgang des Beleuchtungsziel). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure7.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video zu sehen.</a> <img alt="Fig. 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig8highres.jpg" width="500" /> Abbildung 8: Aufnahme eines C. elegans Embryo ein VIT-2 :: GFP-Fusions ausdrücken und ein Membran-bezogene mCherry. Bilder aus einem 3D Zeitrafferaufnahme eines C extrahiert elegans Embryo Ausdruck einer VIT-2 :: GFP-Fusions (PWIs23) und ein Membran-bezogene mCherry (ltIs44). Aufnahmebedingungen: Übernahme von einem Stapel von 10 Scheiben (Abstand zwischen Scheiben 1 m) alle 30 sec; Gesamtaufnahmezeit: 25 min; Belichtungszeit pro Kanal: 200 msec. Tafel A zeigt die ersten 5 Schnitte des gleichen Stapels. Panel B zeigt die gleichen Scheibe jede 30sec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure8.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video zu sehen.</a>

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Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau eines Lichtschnittmikroskop und dessen Umsetzung zur in vivo Bildgebung von C. elegans Embryonen.

Einrichten eines Simple Light Noten Mikroskop für<em&gt; In Toto</em&gt; Imaging von<em&gt; C. elegans</em&gt; Entwicklung

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

setting-up-simple-light-sheet-microscope-for-toto-imaging-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

23.1K Aufrufe.  UMR7288 CNRS, Aix-Marseille Université.  Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau eines Lichtschnittmikroskop und dessen Umsetzung zur in vivo Bildgebung von C. elegans Embryonen. 

Serie: Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generierung von stabilen transgenen C. elegans mit Mikroinjektion

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Forschung

Biologie

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

Wesentliche Komponenten des Lichtmikroskops

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Erzeugung von transgenen C. elegans Nach Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imaging C. elegans Embryos mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop und Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi-Screening auf postembryonalen Phänotypen in Identifizieren C elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Ein Verfahren zur Kultivierung von embryonalen<em&gt; C. elegans</em&gt; Zellen

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

Messung physiologischer Stressreaktionen in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Huntington&#8217;s disease. Recently, repeat expansion-containing RNA was shown to be the substrate for a novel type of protein translation called repeat-associated non-AUG-dependent (RAN) translation. Unlike canonical translation, RAN translation does not require a start codon and only occurs when repeats exceed a threshold length. Because there is no start codon to determine the reading frame, RAN translation occurs in all reading frames from both sense and antisense RNA templates that contain a repeat expansion sequence. Therefore, RAN translation expands the number of possible disease-associated toxic peptides from one to six. Thus far, RAN translation has been documented in eight different repeat expansion-based neurodegenerative and neuromuscular diseases. In each case, deciphering which RAN products are toxic, as well as their mechanisms of toxicity, is a critical step towards understanding how these peptides contribute to disease pathophysiology. In this paper, we present strategies to measure the toxicity of RAN peptides in the model system C. elegans. First, we describe procedures for measuring RAN peptide toxicity on the growth and motility of developing C. elegans. Second, we detail an assay for measuring postdevelopmental, age-dependent effects of RAN peptides on motility. Finally, we describe a neurotoxicity assay for evaluating the effects of RAN peptides on neuron morphology. These assays provide a broad assessment of RAN peptide toxicity and may be useful for performing large-scale genetic or small molecule screens to identify disease mechanisms or therapies.

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Repeat-associated non-ATG-dependent translational products are emerging pathogenic features of several repeat expansion-based diseases. The goal of the protocol described is to evaluate toxicity caused by these peptides using behavioral and cellular assays in the model system C. elegans.

Messung der RAN-Peptidtoxizität in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

Simultaneous Live Imaging of Multiple Insect Embryos in Sample Chamber-Based Light Sheet Fluorescence Microscopes

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample chamber-based setups, which are specifically designed to preserve the three-dimensional integrity of the specimen and usually feature sample rotation, are the best choice in developmental biology. For instance, they have been used to document the entire embryonic morphogenesis of the fruit fly Drosophila melanogaster and the red flour beetle Tribolium castaneum. However, many available live imaging protocols provide only experimental frameworks for single embryos. Especially for comparative studies, such approaches are inconvenient, since sequentially imaged specimens are affected by ambient variance. Further, this limits the number of specimens that can be assayed within a given time. We provide an experimental framework for simultaneous live imaging that increases the throughput in sample chamber-based setups and thus ensures&#160;similar ambient conditions for all specimens. Firstly, we provide a calibration guideline for light sheet fluorescence microscopes. Secondly, we propose a mounting method for multiple embryos that is compatible with sample rotation. Thirdly, we provide exemplary three-dimensional live imaging datasets of Drosophila, for which we juxtapose three transgenic lines with fluorescently labeled nuclei, as well as of Tribolium, for which we compare the performance of three transgenic sublines that carry the same transgene, but at different genomic locations. Our protocol is specifically designed for comparative studies as it pro-actively addresses ambient variance, which is always present in sequential live imaging. This is especially important for quantitative analyses and characterization of aberrational phenotypes, which result e.g., from knockout experiments. Further, it increases the overall throughput, which is highly convenient when access to light sheet&#160;fluorescence microscopes is limited. Finally, the proposed mounting method can be adapted for other insect species and further model organisms, e.g., zebrafish, with basically no optimization effort.

Light sheet-based fluorescence microscopy is the most valuable tool in developmental biology. A major issue in comparative studies is ambient variance. Our protocol describes an experimental framework for simultaneous live imaging of multiple specimens and, therefore, addresses this issue pro-actively.

Gleichzeitige Live-Bildgebung mehrerer Insektenembryonen in probenkammerbasierten Lichtbogenfluoreszenzmikroskopen

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample ...

Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid external development, tractable genetics, and translucency of the zebrafish, Danio rerio, LSFM has delivered insights into cardiac form and function at high spatial and temporal resolution without significant phototoxicity or photobleaching. Imaging of beating hearts challenges existing sample preparation and microscopy techniques. One needs to maintain a healthy sample in a constricted field of view and acquire ultrafast images to resolve the heartbeat. Here we describe optimized tools and solutions to study the zebrafish heart in vivo. We demonstrate the applications of bright transgenic lines for labeling the cardiac constituents and present novel gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental defects and changes in heart rate. We also propose a data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging. The entire workflow presented here focuses on zebrafish embryonic heart imaging but can also be applied to various other samples and experiments.

We describe optimized tools to study the zebrafish heart in vivo with light sheet fluorescence microscopy. Specifically, we suggest bright cardiac transgenic lines and present new gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental and heart defects. A possible data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging is also provided.