The authors thank Uwe Plessmann, Monika Raabe und Silvia M&#252;nch for technical support.

Alle Experimente an menschlichen Gewebe- oder Blutproben muss von einer Ethikkommission nach beliebigen Vorgaben in der Ethik-Votum gegeben genehmigt und durchgeführt werden. 1. Cellular Enrichment <ol><li> Flüssige Tumoren / Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung. <ol><li> Mononukleäre Zellen aus dem Knochenmark oder Blut Wasserprobe durch Erythrozytenlyse mit Ammoniumchlorid oder durch Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation. <ol><li> Für Erythrozytenlyse, kombinieren 1 ml der Probe mit 4 ml Ammoniumchloridlösung. Inkubieren der Lösung auf Eis für 5 - 10 min. 40 ml phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) + 2% fötales Kälberserum (FCS) und Zentrifuge 5 min bei 400 × g und 4 ° C. </li><li> Für Ficollgradientenzentrifugation, Schicht 10 ml Probe auf 15 ml Ficoll-Hypaque bis 2 unterschiedliche Schichten bilden (achten Sie darauf, um die Schichten zu stören). Zentrifugation bei 400 g für 30 min bei RT (15-25 ° C) sorgfältig und ernten den einkernigenZellen, die in der Interphase gesammelt. </li><li> Spin down die Zellen und nehmen sie in PBS + 2% FCS. Zentrifuge bei 400 xg für 5 min und nehme in 1 ml PBS + 2% FCS. Nehmen Sie eine aliquote Menge als negative Kontrolle und ein Aliquot für jeden Fluoreszenzfarbstoff in der letzten Flecken verwendet. </li></ol></li><li> Inkubation mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern nützlich, um die Leukämiezellpopulation in Verdünnung nach Herstellerangaben auf Eis für 30 min zu isolieren. Färben Sie auch die für die Entschädigung mit jedem Antikörper einzeln Aliquots. Zweimal waschen mit PBS + 2% FCS. HINWEIS: Die verwendeten Antikörper waren Anti-Mensch gegen CD117-PE (Klon 95C3), CD34-FITC (Klon 8G12) und CD33-PE (Clone P67.6). </li><li> Filterzellen durch 35 um Zellsieb, idealerweise unter Verwendung von Hülsen mit Zellsieb in Kappe integriert. </li><li> Fügen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen Fleck (zB 7-AAD). Sortierzellen unter Verwendung eines geeigneten Zellsortierer 11 (Abbildung 2). Sammeln Zellen in Isc<html> Ove modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM) mit 10% FCS. </li></ol></li><li> Solide Tumoren / Laser-Mikrodissektion. <ol><li> Aus den beschriebenen Versuchen wurden FFPE-Proben von Lungenkrebs Probe verwendet. Zu diesem Zweck Lungenkrebsgewebe wurde sofort in 4% gepuffertem Formalin nach chirurgischer Resektion und Stücke von etwa 3 x 2 x 1 cm befestigt, wo in Paraffin für die weitere Analyse eingebettet. </li><li> Schneiden Abschnitte 5-10 &amp; mgr; m Dicke aus der Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Probe mit einem Mikrotom. Berg Abschnitte auf Folie bespannt Membran Rutschen und trocken bei 37 ° C für 1 Stunde. Entparaffinieren und rehydratisieren die Einbaufelder durch aufeinanderfolgende Inkubation in Xylol, absolutem Ethanol, 70% und Wasser für jeweils 1 min. </li><li> Färben die Schnitte mit Hämatoxylin für 20 Sekunden und dann mit Leitungswasser spülen. Sammeln Sie die Zellpopulation mit einem Laser-Mikrodissektion System (siehe auch 12). </li></ol></li></ol>title &quot;&gt; 2. Proteinextraktion <ol><li> Flüssigkeitstumoren. <ol><li> Zentrifugieren Sie die Zellsuspension aus Schritt 1.1.5 bei 400 × g, 4 ° C für 4 Minuten und den Überstand verwerfen. Zweimaliges Waschen mit 500 ul kaltem PBS und Zentrifugation für 5 min bei 400 × g und 4 ° C </li><li> In 40 ul Lysepuffer pro 10 6 Zellen und Inkubation für 15 min auf Eis (10 5 Zellen (ca. 10 ug Gesamtprotein) sollte die minimale Anzahl von Zellen sein). Zentrifugieren Sie das Lysat bei 14.000 × g, 4 ° C für 10 min und den Überstand (gelöscht Zelllysat) in ein neues Reaktionsgefäß. Entsorgen Sie das Pellet. </li></ol></li><li> Solide Tumoren. <ol><li> In 60 ul Gewebe Lysepuffer zu der mikrodissezierten Gewebe und Inkubation für 15 Minuten auf Eis, sammeln die Flüssigkeit durch kurze Zentrifugation und übertragen Sie die Suspension auf ein neues Reaktionsgefäß. Beschallen das Lysat auf Eis für 3 min. </li><li> Werden 15 ul 20% Natriumdodecylsulfat (SDS), um ein endgültiges SDS concentration von 4%. Inkubieren microdissected Gewebe bei 99 ° C in einem Heizblock für 1 h und bei 600 Upm gerührt. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 16.000 × g, 18 ° C für 10 min und den Überstand in ein neues Röhrchen. </li></ol></li></ol> 3. Einrichtung eines SILAC Spike-In Quantifizierung Standard (Super SILAC Standard) HINWEIS: Die Quantifizierung Standard besteht aus einem SILAC-markierten Proteinmischung aus 4 abgeleitet - 6 Zelllinien, die das Tumor-Typ von Interesse entsprechen. Um die maximale Überlappung zwischen dem SILAC-markierten Referenz Proteom und Tumor-abgeleitete Proteom zu erreichen, muss ein Hauptkomponentenanalyse durchgeführt, bevor Zelllinien werden für die Quantifizierungsstandard 14 ausgewählt werden. <ol><li> Hauptkomponentenanalyse (PCA). <ol><li> Um die Proteinexpressionsmuster von Zelllinien zu bestimmen, zu kultivieren etwa zehn verschiedenen Zelllinien in geeigneten Zellkulturmedien. Lyse der Zellen, wie beschrieben,in Schritt 2.1. Bereiten Zellysaten für die Massenspektrometrie, wie in Schritt 6.1 beschrieben. </li><li> Analyse der Proteinexpressionsmuster von jeder Zelllinie auf einem hochauflösenden Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektrometer (nanoLCs-MS / MS). </li><li> Analysieren Sie die resultierenden Rohdaten mit einem kostenlosen ware MaxQuant und führen Sie eine Hauptkomponentenanalyse mit Hilfe der zugehörigen Software, wie Perseus 16,17. </li><li> Wählen Sie 4-6 Zelllinien, die die größte Vielfalt zwischen ihren Protein-Expressionsprofile zeigen, und verwenden Sie sie, um das Super SILAC Spike-In Standard zu generieren. </li></ol></li><li> SILAC-Kennzeichnung und Beschriftung Prüfung. <ol><li> Kultivieren der ausgewählten Zellinien mindestens fünf Zellzyklen in entsprechende SILAC Zellkulturmedium, in dem Arginin und Lysin sind mit stabilen Isotope von Kohlenstoff und Stickstoff (SILAC Medium) 4 gekennzeichnet. </li><li> Lyse der Zellen, wie in Schritt 3.1 beschrieben, und bereiten Zelllysaten für die Massenspektrometrie, wie in Schritt 6.1 beschrieben.Messen Sie die Einbaueffizienz von SILAC Markierung durch nanoLCs-MS / MS. Analysieren Sie die resultierende Roh MS Daten mit MaxQuant und bestimmen die Effizienz der SILAC-Kennzeichnung. Dies wird durch Zählen der Anzahl von Peptiden in ihren beschriftet (schwer) identifiziert und ihre endogene Formen (Licht) und Berechnung des Verhältnisses (schwere) / (schwere + Licht) erreicht. Markierungseffizienz sollte 98% nicht überschreiten. </li></ol></li><li> Kombination von SILAC Proteome und Validierung. <ol><li> Kultivieren und nach Herstelleranweisungen im entsprechenden SILAC Medium erweitern ausgewählten Zelllinien. Lyse der Zellen, wie in Schritt 2.1 für flüssige Tumoren beschrieben oder wie in Schritt 3.2 bei soliden Tumoren beschrieben und festzustellen, Proteinkonzentration für jeden Zelllysat. </li><li> Mischen äquimolarer Proteinmengen von jeder Zelllinie und teilen Sie die Mischung in aliquoten. Snap-Einfrieren der Teilmengen und bei -80 ° C bis zur Messung. Bei einem Experiment benötigen Sie 20-50 ug Super SILAC Standard. Achten Sie auf die stan vorbereitendard im Überschuss als Änderung des Standard innerhalb einer Reihe von Versuchen zu vermeiden ist. </li></ol></li></ol> 4. Messung der Proteinkonzentration und Spike-in <ol><li> Flüssigkeitstumoren. <ol><li> Mit Proteinquantifizierung Assay bestimmen die Proteinkonzentrationen der jeweiligen Zelllysaten und der Super-SILAC Standard. </li><li> Gleiche Mengen der geklärten Zelllysat und der Super-SILAC Standard und anschliessend hinzufügen Lithiumdodecylsulfat (LDS) Puffer (25% des Volumens der Probe) und Reduktionsmittel (10% des Volumens der Probe). </li><li> Erhitzen der erhaltenen Lösung in einem Heizblock bei 72 ° C für 10 min. Wahlweise speichern die resultierende denaturierten Proteinen bei -80 ° C. </li></ol></li><li> Solide Tumoren. <ol><li> Zur Proteinkonzentrationsmessung auf einem Plattenleser, zu mischen einen Standard Rinderserumalbumin (BSA) Lösung Verdünnungsreihe, das Lysat und das entsprechende Super SILAC mäßig mit einem im Handel erhältlichen Protein assay in einer 96-Well-Platte, und schütteln Sie für 1 min inkubieren angegebenen Zeit und Messung der Extinktion, wie vom Hersteller angegeben. HINWEIS: Die hohe Konzentration von SDS und Dithiothreit (DTT) in dem Lysat ist ein Problem für die meisten verfügbaren Assays zur Bestimmung der Proteinkonzentration. </li><li> Gleiche Mengen des geklärten Lysats und dem Super SILAC Standard mit 200 ul von Harnstoff in der Filtereinheit und Zentrifugieren bei 14.000 xg für 30 min bei 20 ° C. Verwenden Sie nicht mehr als 50 &amp; mgr; l des geklärten Lysats und die Super SILAC Standard. Zu vermeiden sind Temperaturen unter 15 ° C, so dass der Harnstoff nicht auskristallisiert. </li></ol></li></ol> 5. Probentrennung und Protein Digest <ol><li> Flüssigkeitstumoren. <ol><li> Separate 30-100 &amp; mgr; g Gesamtprotein pro Spur auf einem 4-12% Gradienten-SDS-PAGE-Gel. Stain Proteine ​​mit Coomassie-Blau O / N. Überschüssiges Coomassie-Färbung von zwei aufeinanderfolgenden Waschvorgängen mit Wasser. </li><li> Schneiden Sie jede Spur von dem Gel und teilen siein 23 gleich große Scheiben unabhängig von dem Muster der Gelfärbung. Verarbeiten Sie die Gel-Scheiben getrennt, die jeweils in eine in 0,6 ml Polypropylen-Röhrchen. </li><li> Mit Wasser und Methanol / Wasser (50:50, v / v), mit 10 mM DTT reduzieren durch Inkubation für 30 min bei 56 ° C waschen Gelscheiben. Alkylieren die Gelscheiben mit 55 mM Iodacetamid (IAA) durch Inkubation bei 60 min bei RT im Dunkeln. </li><li> Zwischen Probe-Handhabungsschritte, waschen Scheiben mit Acetonitril für 15 min und trocken in einer SpeedVac um überschüssiges Lösungsmittel zu entfernen und verbessern die Aufnahme von Reagenzienlösung. </li><li> Führen Protease Spaltung durch Rehydratisieren getrocknete Gel Scheiben mit der minimalen Menge von Schweine-Trypsin-Lösung (12,5 ng / ul in 0,025 M wässrige Ammoniumhydrogencarbonatlösung) für 16 h bei 37 ° C. </li><li> In 10 ul Wasser Gelstück und Inkubation für 15 min bei 37 ° C. In 80 ul Acetonitril und Inkubation für 15 min bei 37 ° C. Zentrifugieren bei 15.800 · g, 1 min. Sammeln Stand und lagern in einem separaten 0,6 mlRohr. </li><li> Hinzufügen 65 ul 5% igen Ameisensäurelösung, Vortex und inkubiere für 15 min bei 37 ° C. In 65 ul Acetonitril und Inkubation für 15 min bei 37 ° C. Zentrifuge bei 15.800 · g für 1 min. Die überstehende Flüssigkeit und zum Überstand hinzu aus dem vorherigen Schritt. Dampfe das kombinierte Überstand zur Trockene im Vakuum-Konzentrator. </li></ol></li><li> Solide Tumoren. <ol><li> SDS entfernen Gewebelysat verwenden Sie die folgende FASP Protokoll, auch in Bezug 15 beschrieben. </li><li> Nach dem ersten Schritt 5.2.3 beschrieben Zentrifugation fügen weitere 200 &amp; mgr; l 8 M Harnstoff auf dem Filter und weitere Zentrifuge bei 14.000 xg für 20 min bei 20 ° C. Entsorgen Sie die Durchfluss Filtrat. </li><li> 100 l IAA und mischen in einem Thermomixer bei 600 UpM für 1 Minute. Die Filter für 20 min Inkubation bei 20 ° C im Dunkeln. Zentrifugieren Sie den Filter bei 14.000 g für 10 min bei 20 ° C. </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l von Harnstoff zu dem Filter und CENZentrifuge bei 14.000 × g für 15 min bei 20 ° C. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal. </li><li> 100 l NH 4 HCO 3 auf dem Filter und Zentrifuge bei 14.000 g für 10 min bei 20 ° C. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. </li><li> Man fügt 40 &amp; mgr; l NH 4 HCO 3 + 1 &amp; mgr; l (= 0,4 &amp; mgr; g) Trypsin und mischen in Thermomixer bei 20 ° C für 600 min, 1 min. Inkubieren des Filters O / N in einem feuchten Kammer bei 37 ° C. Übertragen Sie die Filter, um neue Sammelröhrchen. </li><li> Zentrifugieren Sie den Filter bei 14.000 g für 10 min bei 20 ° C. Zugeben von 50 ul NH 4 HCO 3 und der Filterzentrifuge bei 14.000 g für 10 min bei 20 ° C. Speichern der resultierenden Peptide bei -20 ° C bis massenspektrometrische Messung. </li><li> Peptidkonzentrationsmessung verzichten 50 ul der resultierenden Durchfluss und eine Reihe von geeigneten Verdünnungen von reinem Tryptophan in einer 96-Well-Platte. Tryptophan-Fluoreszenz zu messen. Konvertieren Sie die resultierende KonzentrationTryptophan Peptidkonzentration, wie 0,1 ug Tryptophan entspricht 9 ug Protein. </li></ol></li></ol> 6. Flüssigkeitschromatographie und massenspektrometrischer Analyse <ol><li> Abgeblasen, Peptiden in 30 &amp; mgr; l Beladungspuffer für 5 Minuten in einem Ultraschallbad. Spin down in einer Zentrifuge bei 15.800 · g für 1 min und pipettieren Sie die klare Lösung in eine MS Autosamplergefäß. </li><li> Injizieren 5 ul Probe pro Analyse mit dem automatischen Probennehmer nanoLCs-MS / MS-System. Konzentrieren und Entsalzen von Peptiden Online auf einer Umkehrphasen-C18-Vorsäule (0,15 mm ID x 20 mm mit 5 um Porengröße C18-Material) entweder in einer belüfteten Säule Setup oder eine Vorsäule Schaltaufbau montiert. </li><li> Separate Peptide auf einer Umkehrphasen-C18-Mikrosäule (0,075 mm ID x 200 mm Selbst gepackt mit 3 um oder kleiner Porengrße C18 Material in einer selbst Packung Nanospray Spalte wie PicoFrit Verwendung eines 90 min-Gradienten von 5&gt; 35% Acetonitril vs . 0,1% wässriger Ameisensäure in 300 nl /Minute Überlaufmittel in einen Hybrid-Quadrupol / Orbitrap Massenspektrometer über eine Nanospray-Ionenquelle. </li><li> Analysieren Peptide mit einem Top15-Daten abhängigen Erwerbsmethode (MS m / z-Bereich 350 -. 1600, Auflösung Ziel 70.000 FWHM, AGC Ziel 1 x 10 6, max Füllzeit 60 msec MS / MS beginnen Masse 100, Auflösung Ziel 17.500 FWHM, AGC Ziel 2 × 10 5, max Füllzeit 60 msec MS / MS-Schwelle 3 x 10 4, sind Ladungszustände. 2 - 5, normalisierten Kollisionsenergie NCE 25%, dynamischen Ausschluss 15 sec). </li></ol> 7. Datenanalyse <ol><li> Für die Datenanalyse mit dem frei verfügbaren MaxQuant 16 Software. Ein detailliertes Protokoll für Bioinformatik-Datenanalyse wird in 16,17 beschrieben. Zur Analyse kombinieren Rohdaten von allen Scheiben aus einem SDS-PAGE-Spur in einem einzigen Experiment 17. </li></ol>

<ol>
	<li>Walther, T. C., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics+in+cell+biology.">Mass spectrometry-based proteomics in cell biology.</a> J Cell Biol. 190 (4), 491-500 (2010).</li><li>Lenz, C., Urlaub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+methodology+to+improve+proteome+coverage+depth.">Separation methodology to improve proteome coverage depth.</a> Expert Rev Proteomics. 11 (4), 409-414 (2014).</li><li>Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Status+of+large-scale+analysis+of+post-translational+modifications+by+mass+spectrometry.">Status of large-scale analysis of post-translational modifications by mass spectrometry.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3444-3452 (2013).</li><li>Ong, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture,+SILAC,+as+a+simple+and+accurate+approach+to+expression+proteomics.">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).</li><li>Jimenez, C. R., Verheul, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics:+from+cancer+biology+to+protein+biomarkers,+drug+targets,+and+clinical+applications.">Mass spectrometry-based proteomics: from cancer biology to protein biomarkers, drug targets, and clinical applications.</a> Am Soc Clin Oncol Educ Book. , e504-e510 (2014).</li><li>Tang, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+cancer+stem+cell+heterogeneity+and+plasticity.">Understanding cancer stem cell heterogeneity and plasticity.</a> Cell Res. 22 (3), 457-472 (2012).</li><li>Evans, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+insight+into+iTRAQ:+where+do+we+stand+now.">An insight into iTRAQ: where do we stand now.</a> Anal Bioanal Chem. 404 (4), 1011-1027 (2012).</li><li>Ostasiewicz, P., Zielinska, D. F., Mann, M., Wisniewski, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome,+phosphoproteome,+and+N-glycoproteome+are+quantitatively+preserved+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+and+analyzable+by+high-resolution+mass+spectrometry.">Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry.</a> J Proteome Res. 9 (7), 3688-3700 (2010).</li><li>Malmstr&#246;m, J., Picotti, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+of+targeted+mass+spectrometry+for+protein+biomarker+verification.">Perspectives of targeted mass spectrometry for protein biomarker verification.</a> Curr Opin Chem Biol. 13 (5-6), 518-525 (2009).</li><li>Gillet, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+data+extraction+of+the+MS/MS+spectra+generated+by+data-independent+acquisition:+a+new+concept+for+consistent+and+accurate+proteome+analysis.">Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: a new concept for consistent and accurate proteome analysis.</a> Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> J Vis Exp. 41, (2010).</li><li>Edwards, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+mammalian+tissue.">Laser capture microdissection of mammalian tissue.</a> J Vis Exp. 8, 309 (2007).</li><li>Liu, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+pipeline+for+biomarker+discovery+of+laser+capture+microdissected+breast+cancer+tissue.">Proteomics pipeline for biomarker discovery of laser capture microdissected breast cancer tissue.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 155-164 (2012).</li><li>Geiger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture+as+a+spike-in+standard+in+quantitative+proteomics.">Use of stable isotope labeling by amino acids in cell culture as a spike-in standard in quantitative proteomics.</a> Nat Protoc. 6 (2), 147-157 (2011).</li><li>Wisniewski, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+sample+preparation+from+formalin+fixed+and+paraffin+embedded+tissue.">Proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue.</a> J Vis Exp. (79), (2013).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+MaxQuant+computational+platform+for+SILAC-based+quantitative+proteomics.">A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics.</a> Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nat Protoc. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li><li>Sarvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133++cancer+stem-like+cells+in+small+cell+lung+cancer+are+highly+tumorigenic+and+chemoresistant+but+sensitive+to+a+novel+neuropeptide+antagonist.">CD133+ cancer stem-like cells in small cell lung cancer are highly tumorigenic and chemoresistant but sensitive to a novel neuropeptide antagonist.</a> Cancer Res. 74 (5), 1554-1565 (2014).</li><li>Shlush, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+pre-leukaemic+haematopoietic+stem+cells+in+acute+leukaemia.">Identification of pre-leukaemic haematopoietic stem cells in acute leukaemia.</a> Nature. 506 (7488), 328-333 (2014).</li><li>Schaab, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+phosphoproteome+analysis+of+human+bone+marrow+reveals+predictive+phosphorylation+markers+for+the+treatment+of+acute+myeloid+leukemia+with+quizartinib.">Global phosphoproteome analysis of human bone marrow reveals predictive phosphorylation markers for the treatment of acute myeloid leukemia with quizartinib.</a> Leukemia. 28 (3), 716-719 (2014).</li><li>H&#252;ttenhain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+cancer-associated+proteins+in+body+fluids+using+targeted+proteomics.">Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics.</a> Sci Transl Med. 4 (142), 142ra94 (2012).</li><li>Burgess, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+and+efficient+quantification+of+low-abundance+proteins+at+very+high+multiplex+via+targeted+mass+spectrometry.">Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (4), 1137-1149 (2014).</li><li>Boja, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+Validation+Considerations+of+Multiplex+Mass+Spectrometry-based+Proteomic+Platforms+for+Measuring+Protein+Biomarkers.">Analytical Validation Considerations of Multiplex Mass Spectrometry-based Proteomic Platforms for Measuring Protein Biomarkers.</a> J Proteome Res. , (2014).</li></ol>

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt oder andere Fragen offen zu legen.

Massenspektrometrische Analyse von Patienten stammende Krebszell Proteome wird für die Entdeckung neuer diagnostischer / prädiktive Biomarker benötigt, als auch zu einem besseren Verständnis von Krebs-Zellbiologie, geben, die vielleicht wiederum zu der Identifizierung von neuen potenziellen Wirkstoff-Targets. Allerdings sind solche massenspektrometrische Analysen sehr anspruchsvoll, vor allem, weil verschiedene präanalytische Probleme müssen gelöst werden, wenn man sich um robuste und biologisch relevante Ergebnisse zu erhalten. Die hier beschriebenen experimentellen Arbeitsablauf ermöglicht quantitative Proteomik Charakterisierung von Proteomen von zellulären Subpopulationen von flüssigen und festen Tumoren abgeleitet. Die anfängliche Anreicherung von Tumorzellen entweder durch FACS-basierte Zell sortingor Mikrodissektion benötigt wird, um eine Verunreinigung durch Zellen der Tumormikroumgebung zu vermeiden. Darüber hinaus sind diese Techniken erlauben es, zelluläre Subpopulationen von Interesse zu isolieren. Neueste zellbiologische Studien haben Dämonstrated, dass bestimmte Zellpopulationen haben tumorauslösende Eigenschaften und sind somit für die Krebs Pathogenese 19,20 höchst relevant. Massenspektrometrie sensibler geworden in den letzten Jahren sind quantitative proteomische Analyse denkbar, dass die geringen Mengen an Protein, das von einigen tausend Zellen abgeleitet werden können, was es ermöglicht, den Schwerpunkt auf die funktionsrelevanten Zellpopulationen. Die Einrichtung hier vorgestellten kann verwendet werden, um in FFPE-Proben Identifizierung und Validierung neuartiger diagnostischer Biomarker werden. Daher verspricht sie nützliches Werkzeug für die Verbesserung der klinischen Diagnostik BEA, als bisher gibt es noch ein Mangel an molekulare Biomarker in ausreichender Zahl und Qualität für viele Krebsarten. Wichtige Beispiele für schwierige Differentialdiagnosen, für die Biomarker fehlen, sind die Unterscheidung zwischen primären Lungenkrebs von Metastasen in der Lunge, intrapankreatischen cholangiozelluläres Karzinom und Adenokarzinom des Pankreas sowie unterscheidenzierung von gutartigen Neurofibrom von hoch malignen peripheren Nervenscheidentumoren. Darüber hinaus haben wir und andere haben gezeigt, dass quantitative Aufklärung der Proteom-Signaturen können bei der Untersuchung von Krebszellen Biologie im Allgemeinen und für die Entdeckung prädiktiver Biomarker für therapeutische Reaktion bei Krebspatienten 21 Jahre alt sein. Zwei aktuelle Nachteile der hier vorgestellten Verfahren sind die Voraussetzung für umfangreiche manuelle Probenaufbereitung und die Nachfrage am nanoLC-MS / MS Erfassungszeit. Während erstere können durch Bewegen der Probenvorbereitung bis zum Beispiel 96-Well-Format und mit Roboter gewandt werden, wird dieser eine Änderung der massenspektrometrischen Akquisitionsstrategie benötigen. Nach Teilmengen von Zielproteine ​​identifiziert, die mit zB Tumorklassifikation in Verbindung gebracht werden können, sehen wir die Gestaltung von gezielten Massenspektrometrie Methoden, die quantitative Ablesungen für diese Teilmengen mit einem stark reduzierten Trennaufwand zu schaffen, unddaher mit einem entsprechend reduzierten Akquisitionszeit. Falls die benötigte Erfassungszeit benötigt konnte von 24 reduziert werden - 36 h (flüssige Tumoren) oder 3 Stunden (solide Tumoren), um zB, 1 h durch gezielte Massenspektrometrie und eine einfache eindimensionale Trennung von Peptiden, wird der daraus resultierende Gewinn im Durchsatz könnte verwendet werden, um wesentlich die Anzahl von biologischen und technischen Wiederholungen geprüft zu erhöhen, mit entsprechenden Verbesserungen in der Bedeutung der Quantifizierungsergebnisse werden. Gezielte massenspektrometrische Ansätze wurden bereits gezeigt, dass sie ein geeignetes Instrument für die Überprüfung der Krebs assoziiertes Protein-Biomarker-Kandidaten 22 zu sein, und sind an einem Punkt, wo sie Versprechen für die Validierung oder sogar als mögliches Instrument für die klinische Routineanwendung 23 zeigen entwickelt , 24.

Die Massenspektrometrie-basierte Proteomik entstanden und ist heute eine weit verbreitete Disziplin in der Zellbiologie und translationalen biomedizinischen Forschung. Der technische Fortschritt in diesem Gebiet haben es möglich, komplexe zelluläre Prozesse in Zelllinien und Tiermodellen zu untersuchen gemacht, da Tausende von Proteinen in einer einzigen massenspektrometrischen Experiment 1,2 identifiziert werden. Ähnliche Fortschritte bei der Analyse für viele posttranslationale Modifikationen wie Phosphorylierung oder Ubiquitinierung gemacht worden, obwohl dies erfordert in der Regel maßgeschneiderte Abläufe für die Anreicherung und die Datenanalyse für jede Art von Modifikation 2,3. Darüber hinaus ist die Beteiligung von chemischen und metabolischen Markierung Strategien, einschließlich SILAC, ermöglicht eine genaue relative Quantifizierung von Proteinen und PTMs, so dass dieses Verfahren besonders für die Entdeckung der grundlegenden zellulären Prozesse, diagnostische Biomarker und potenzielle Angriffspunkte für Arzneimittel in menschlichen Krebs 4 attraktiv. Jedochmehrere Herausforderungen müssen hinsichtlich Proteom-Analyse von primären humanen Krebs 5 überwunden werden. Zunächst zeigen menschliche Krebsproben oft einen hohen Grad an zellulärer Heterogenität, die durch die Anwesenheit verschiedener Zellentypen in der Tumor-Mikroumgebung, einschließlich Immunzellen und Fibroblasten gehör. Zweitens führt klonalen Evolution die genetische Vielfalt innerhalb der Tumoren selbst, was in der Existenz mehrerer Zellpopulationen mit unterschiedlichen funktionellen Eigenschaften. Nach dem derzeitigen Konzept der wenigen Krebsstammzellen als die treibenden Kräfte bei der Krebsentstehung und Progression, Proteomanalyse eines solchen (funktional höchst relevant) Zellpopulationen wird erwartet, dass von großer Bedeutung für ein besseres Verständnis der onkogenen Mechanismen für die klinische Anwendung relevant sein 6. Drittens werden quantitative Proteinexpressionsprofile von großen Sätzen von Proben oft zur Identifizierung robuste klinische Biomar erforderlichekers; Dies kann nicht durch chemische Markierung wie iTRAQ 7 durchgeführt werden, während die metabolische Markierung Strategien - die sich, wie sie es tun, auf die zelluläre Proliferation 4 - sind ebenfalls nicht anwendbar. Viertens sind die meisten verfügbaren festen Tumorproben in Formalin fixierten, die massenspektrometrische Proteomanalyse aufgrund der Bildung von Proteinquervernetzungen 8 verkompliziert. Schließlich sind die meisten bestehenden Proteomik Workflows erfordern erhebliche Mengen an Probenverarbeitung und Datenerfassung, wodurch die Analyse der Probennummern für die klinische Forschung relevanten schwierig und fordern neue Workflow-Paradigmen 9,10. Um diese Hindernisse zu adressieren wir einen Versuchsaufbau, die entweder durchflusszytometrische Zell kombiniert Sortier 11 oder Laser-Mikrodissektion 12,13 für die Zellanreicherung mit einem Super SILAC 14 Strategie, ein globales interner Standard für eine umfassende massenspektrometrische Analyse einzuführen entwickelt. Durch die Verwendung der hier beschriebenen Verfahren ist es möglich, bis 8.000 Proteine ​​in einzelnen menschlichen Tumorproben von entweder flüssigen oder festen Krebsarten abgeleitet quantifizieren up.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="943">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:181px;">Company</td>
			<td style="width:151px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">660 nm Kit</td>
			<td style="width:181px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:151px;">22662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture medium depleted of arginine and lysine</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">88421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coomassie Brilliant Blue R-250 staining solution</td>
			<td style="width:181px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:151px;">161-0436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialyzed fetal calf serum (FCS)</td>
			<td style="width:181px;">PAA</td>
			<td style="width:151px;">A15-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diffuser caps for microdissection</td>
			<td style="width:181px;">MMI</td>
			<td style="width:151px;">50202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS-sorter</td>
			<td style="width:181px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">FACSAria III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ionic Detergent Compatibility Reagent</td>
			<td style="width:181px;">Thermo scientific</td>
			<td>22663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser-capture microdissector</td>
			<td style="width:181px;">MMI&#160;</td>
			<td style="width:151px;">cell cut plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LDS buffer&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Membrane slides for microdissection</td>
			<td style="width:181px;">MMI</td>
			<td style="width:151px;">50103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcon YM-30</td>
			<td style="width:181px;">Millipore</td>
			<td style="width:151px;">MRCF0R030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Gels</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">NP0335PK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Picofrit Self-Pack Columns</td>
			<td style="width:181px;">New Objective</td>
			<td style="width:151px;">PF360-75-15-N-5</td>
			<td>Mass Spectrometry Column/Emitter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reducing agent</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Reprosil-Pur LC/MS/MS Column stationary phase</td>
			<td style="width:181px;">Dr. Maisch</td>
			<td style="width:151px;">120 C18-AQ, 3 &#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Reprosil-Pur LC/MS/MS Precolumn stationary phase</td>
			<td style="width:181px;">Dr. Maisch</td>
			<td style="width:151px;">120 C18-AQ, 5 &#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SILAC-labeled arginine</td>
			<td style="width:181px;">Eurisotop</td>
			<td style="width:151px;">CLM-2265-H-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SILAC-labeled lysine</td>
			<td style="width:181px;">Eurisotop</td>
			<td style="width:151px;">DLM-2640-0.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin, NB Sequencing Grade</td>
			<td style="width:181px;">Serva</td>
			<td style="width:151px;">3728301</td>
			<td>for in-gel digests</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin, Sequencing Grade</td>
			<td style="width:181px;">Promega</td>
			<td style="width:151px;">V5111</td>
			<td>for in-solution digests</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buffer and solutions</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;">Cell lysis buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 7.8, 5mM NaF,&#160; 0,5% NP40, 0.1% laurylmaltoside, Roche complete protease inhibitor, 1 mM Na3VO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Tissue lysis buffer: 100 mM Tris/HCl pH 7.8, 0.1 M DTT&#160;</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Urea: 8 M urea in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>for FASP-protocoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IAA: 0.05 M iodoacetamide, 8 M urea, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>for FASP-protocoll</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">0.05 M NH4HCO3</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mM dithiothreitol (DTT) in 0.1 M ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>for in-gel digest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">55 mM iodoacetamide (IAA) in 0.1 mM ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>for in-gel digest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;5% aqueous formic acid.</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative mass spectrometric profiling of cancer-cell proteomes derived from liquid and solid tumors

In eingehenden Analysen der Krebszelle Proteome sind erforderlich, um onkogene Pathomechanismen aufzuklären, aber auch, um potenzielle Zielmoleküle und diagnostische Biomarker zu identifizieren. Jedoch sind Verfahren zum quantitativen Proteom-Charakterisierung von Patienten stammende Tumoren und insbesondere ihre zellulären Subpopulationen weitgehend. Hier beschreiben wir eine Versuchsanordnung, die quantitative Analyse der Proteome von Krebs Zell-Subpopulationen von entweder flüssigen oder festen Tumoren abgeleitet werden können. Dies wird durch die Kombination von Zellanreicherungsstrategien mit quantitativen Super SILAC basierte Massenspektrometrie gefolgt von bioinformatischen Datenanalyse erreicht. Um bestimmte zelluläre Untergruppen bereichern werden flüssige Tumoren zunächst durch Fließ immunophenotyped Zytometrie durch FACS-Sortierung gefolgt; bei soliden Tumoren wird laser Mikrodissektion verwendet, um bestimmte Zellpopulationen zu reinigen. In einem zweiten Schritt werden die Proteine ​​aus den gereinigten Zellen extrahiert und anschließend mit einem tumorspezifischen kombiniert,Spike-In-Standard, der Proteinquantifizierung ermöglicht SILAC-markiert. Das resultierende Protein Mischung wird entweder Gelelektrophorese oder Filter Aided Probenvorbereitung (FASP), gefolgt von tryptischen Verdau unterzogen. Schließlich werden tryptischen Peptide mit einem Hybrid-Quadrupol-Orbitrap Massenspektrometer analysiert, und die erhaltenen Daten werden mit Bioinformatik-Software-Suiten, einschließlich MaxQuant verarbeitet. Mittels der hier dargestellten Arbeitsablauf bis zu 8.000 Proteinen identifiziert werden können und in einem Patienten stammenden Proben quantifiziert werden, und die resultierenden Proteinexpressionsprofile kann bei Patienten zu Diagnose proteomic Signaturen oder mögliche Wirkstoffziele zu identifizieren, verglichen werden.

Proteomanalyse von flüssigen und festen Tumoren von Patienten ist ein vielversprechender Ansatz für die Entdeckung neuer diagnostischer und prädiktiver Biomarker. Die Probenvorbereitung und die massenspektrometrische Analyse gibt jedoch eine Herausforderung, sie aufgrund der Komplexität der Proben und die Notwendigkeit für eine genaue Quantifizierung von Proteinen in großen Mengen von Proben. Die oben beschriebenen experimentellen Prozedur beginnt mit der Isolierung von Zellen von Interesse, entweder durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung oder durch Laser-Mikrodissektion. Hierzu werden die Zellen aus einem Patienten stamm Knochenmarkabsaugungen oder Blutproben mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen definierte Oberflächenmarker von Interesse vor dem FACS-basierte Sortierung und Zelllyse gefärbt. Um zelluläre Untergruppen von Gewebeschnitten zu bereichern, müssen diese erst auf entsprechende Objektträger aufgebracht werden, um Laser-Mikrodissektion ermöglichen. Hierzu Halterung ter Gewebeschnitte auf geeignete Membran gleitet und mit einem Laser-Capture-MicroDissector nach den Anweisungen des Herstellers. Die Auswahl der Bereiche und Zellen von Interesse erfordert angemessene Kenntnisse über die Histomorphologie von gesunden und Tumorgewebe. Die extrahierten Zellen werden dann in einem geeigneten Sammelröhrchen überführt. Anfängliche Experimente sollte, um die Menge an Gewebe zur Extraktion von ausreichenden Mengen an Protein (mindestens 10 &amp; mgr; g Gesamtprotein) für jeden neuen Gewebe von Interesse notwendig definiert durchgeführt werden. Jede microdissected Probe wird mit 60 ul Gewebe Lysepuffer behandelt. Für eine effiziente Lyse haben Zellen von Gewebeproben für 3 min, und nach der Zugabe von 15 ul SDS-Proben werden in einem Thermomixer bei 99 ° C für 1 h inkubiert, um die Formalin-induzierten Protein-Quervernetzungen zu entfernen beschallt werden. Die Zentrifugation wird endlich erleichtern die Sammlung der geklärten Zelllysat. Für jede Krankheit interest (flüssigen und festen Tumoren) eine geeignete Super SILAC Quantifizierungsstandard ist zu bilden, 14 werden. Eine entsprechende Norm sollte mehr als 90% der Proteine ​​in den Proben von Interesse zum Ausdruck zu vertreten. Zur Herstellung einer Quantifizierungsstandard sollte Zellinien zur Krebstyp von Interesse bezogenen ersten durch Massenspektrometrie analysiert werden, um ihren Proteinexpressionsprofile festzulegen und anschließend eine Hauptkomponentenanalyse durchgeführt werden soll. 4-6 verschiedenen Zelllinien mit Differenzproteinexpressionsmuster zu wählen und mit &quot;schweren&quot; Arginin und Lysin SILAC-markiert. Markierungseffizienz sollte nanoLCs-MS / MS überprüft werden und sollte mehr als 98% betragen. Danach sollten die Zelllinien in der gleichen Weise wie die entsprechenden Patienten stammenden Probe, und anschließend sollte äquimolarer Proteinmengen von jeder Probe und dem SILAC spike in Standard gemischt werden, lysiert werden. Ein entscheidender Schritt zur genauen Quantifizierung von Proteinen von klinischen Proben of Interesse ist die genaue Mischung äquimolarer Proteinmengen von Patienten stammende Proben und die SILAC spike in Quantifizierungsstandard. Um die Proteinkonzentration der Lysate von sortierten Zellen gewonnen werden, können verschiedene Proteinquantifizierung Assays verwendet werden. Für Zellysaten aus Gewebe stammenden Zellen ein Assay benötigt, die mit hohen Konzentrationen an SDS und DTT in dem Lysat umgehen kann. Proteinkonzentrationen der Patienten stammenden Proben und die SILAC spike in Standard sollte jedes Mal vor dem Kombinieren mit den jeweiligen klinischen Proben, um eine korrekte Mischung, die von entscheidender Bedeutung, sogar Hunderte von Proben vergleichbar ist sicherzustellen gemessen werden. Nachdem die Mischung aus gleichen Mengen von spike in Standard und Lysat, Proben von Flüssigkeitstumoren mit HLT vermischt, in einem Thermomixer erhitzt, bei 72 ° C für 10 min gewonnen und anschließend in 1D-PAGE unterzogen und In-Gel-Verdauung des abgetrennten Proteine ​​mit Trypsin. Proben aus erhaltenGewebe aus SDS mit der FASP Ansatz wie von Wisniewski et al fest 15 befreit und mit Trypsin verdaut. Die tryptischen Peptiden erhalten durch Messen Tryptophan-Fluoreszenz, die von für die Gewebeproben besonderem Interesse ist, wie die Menge der Peptide, die von dem Filter gelöst unterscheidet zwischen 15% und 75% im Vergleich zu den Proteinmengen zunächst auf den Filter geladen quantifizieren. Dazu messen wir die Fluoreszenz von Tryptophan. Der Vergleich mit einer geeigneten Tryptophan Verdünnungsreihe ermöglicht die Quantifizierung von Peptiden, wie 1,1 ug Tryptophan entspricht etwa 100 ug Peptid. Falls erforderlich, Proben vor allem aus FASP Verarbeitung abgeleitet werden auf kommerziellen oder hausgemachte Bühne Tipps vor dem Laden auf den nanoLC / MS / MS-System 18 mit Umkehrphasen-C18 (RP-C18) Material verpackt vorgereinigt werden. Massenspektrometrische Analyse basiert auf einem hohen geführt-Auflösung, hoher Empfindlichkeit Massenspektrometriesystem. Kurz gesagt, werden Peptidproben entsalzt und auf einer RP-C18 Vorsäule vorkonzentriert und auf einer RP-C18 analytischen Säule direkt an das Massenspektrometer gekoppelt getrennt. Um eine ausreichende Tiefe der Analyse zu erzielen, wir verwenden entweder eine Kombination aus SDS-PAGE Protein Vorfraktionierung mit 40 min RP-C18-Gradienten (für flüssige Tumoren) oder Einzelinjektionen mit langen 2 - 3 h RP-C18-Gradienten (soliden Tumoren durch FASP verarbeiteten ). MS-Spektren werden mit einer Auflösung von 70.000 FWHM oder besser erworben, um eine genaue Quantifizierung der SILAC Paare durch Integration der chromatographischen Peakprofile ermöglichen. Zur Proteinidentifizierung wird eine Top15 datenabhängigen Erfassungsverfahren verwendet, um eine große Anzahl von Peptid MS / MS-Spektren für Peptid- und Proteinidentifizierung zu erzeugen. Aus den resultierenden Rohdaten werden Protein Identifizierung und Quantifizierung von Datenbank erreicht Suche mit MaxQuant Software gegen ein UniProt Knowledgebase Menschen komplette Proteom-Sequenzdatenbank 17. In MaxQuant Software (aktuelle Version 1.5.0.25) Peptide aus dem erworbenen MS / MS-Spektren von Peptidfragment-Abgleich mit Spektren in silico aus der Proteinsequenz-Datenbank abgeleitet identifiziert. Zur gleichen Zeit, sind Vorläuferion Isotopenprofile um ihre chromatographischen Retentionszeiten extrahiert und ihre integrierten Peakflächen werden zur relativen Quantifizierung des verwendeten Lichts: Schwer von SILAC Kennzeichnung erzeugt Peptidpaare. Peptid Identitäten und relativen Intensitäten werden dann zu den entsprechenden Proteineigenschaften versehen. Dann wird Perseus Software (aktuelle Version 1.5.0.15) verwendet werden, um weiter stromabwärts statistische Auswertung der MaxQuant Verarbeitungsergebnisse, einschließlich Probe zu Probe-Vergleiche, PCA und hierarchisches Clustering durchzuführen. Mit dem Versuchsaufbau beschrieben haben wir identifiziert und quantifiziert bis 8.000 Proteine ​​von weniger als 30 &amp; mgr; g Gesamtproteinvon flüssigen Tumoren abgeleitet. Bis 2.500 Proteine ​​aus festen Tumorproben können identifiziert und in einer Schrotflinte Proteomanalyse mit einem LC-Gradienten von nur 2 Stunden quantifiziert, so dass die Analyse von Hunderten von klinischen Proben in einer relativ kurzen Zeit. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52435/52435fig1highres.jpg" /> Abbildung 1. Experimentelle Arbeitsablauf. Die wichtigsten Schritte der zellulären-Teilmenge Bereicherung, Proteinisolierung, Spike-In des Quantifizierungsstandards und massenspektrometrische Analyse sind für flüssige und feste Tumoren gezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52435/52435fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52435/52435fig2highres.jpg" /> Abbildung 2. Cellular Bereicherung strategischn. FACS-Sortierung und LCM. (A) Beispielhafte Gating-Strategie darstellt Gating auf einem CD117-gefärbten Leukämiezellpopulation durch einen Zellsortierer erworben. (B) Laser Mikrodissektion von solidem Tumorgewebe. Gewebeschnitte von 5 bis 10 um Dicke wurden auf Film beschichteter Membran Folien vor der Färbung gelagert. Region von Interesse wurde manuell für die Laser Mikrodissektion ausgewählt. Gezeigt werden Abschnitte vor Mikrodissektion mit dem interessierenden Bereich gelb markiert und nach Mikrodissektion. Ein Maßstab von 50 &amp; mgr; m ist in der Abbildung enthalten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52435/52435fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52435/52435fig3highres.jpg" /> Abbildung 3. Cluster-Analyse der menschlichen Krebszell Proteome. Unbeaufsichtigte Clusteranalyse protein Expressionsprofile von flüssigen und festen Tumoren wurde unter Verwendung der Rechenplattform Perseus. AC - Adenokarzinom, SCC - Plattenepithelkarzinom, SCC-Met - Plattenepithelkarzinom Metastasen von Kopf- und Halskrebs, R - Technische Replikation.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors at JoVE.com

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

Quantitative massenspektrometrische Analyse von Krebs-Zellen-Proteome Abgeleitet von Liquid und soliden Tumoren

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

quantitative-mass-spectrometric-profiling-cancer-cell-proteomes

Research

JoVE Journal

Medicine

16.0K Aufrufe.  University Medical Center, Göttingen. In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

Serie: Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of areas of distinct differentiation into recognized histological subtypes, or different pathological grade, often there are more subtle differences in phenotype which defy accurate classification (Figure 1). Ultimately, since morphology is dictated by the underlying molecular phenotype, areas with visible differences are likely to be accompanied by differences in the expression of proteins which orchestrate cellular function and behavior, and therefore, appearance. The significance of visible and invisible (molecular) heterogeneity for prognosis is unknown, but recent evidence suggests that, at least at the genetic level, heterogeneity exists in the primary tumor1,2, and some of these sub-clones give rise to metastatic (and therefore lethal) disease. 
Moreover, some proteins are measured as biomarkers because they are the targets of therapy (for instance ER and HER2 for tamoxifen and trastuzumab (Herceptin), respectively). If these proteins show variable expression within a tumor then therapeutic responses may also be variable. The widely used histopathologic scoring schemes for immunohistochemistry either ignore, or numerically homogenize the quantification of protein expression. Similarly, in destructive techniques, where the tumor samples are homogenized (such as gene expression profiling), quantitative information can be elucidated, but spatial information is lost. Genetic heterogeneity mapping approaches in pancreatic cancer have relied either on generation of a single cell suspension3, or on macrodissection4. A recent study has used quantum dots in order to map morphologic and molecular heterogeneity in prostate cancer tissue5, providing proof of principle that morphology and molecular mapping is feasible, but falling short of quantifying the heterogeneity. Since immunohistochemistry is, at best, only semi-quantitative and subject to intra- and inter-observer bias, more sensitive and quantitative methodologies are required in order to accurately map and quantify tissue heterogeneity in situ.
We have developed and applied an experimental and statistical methodology in order to systematically quantify the heterogeneity of protein expression in whole tissue sections of tumors, based on the Automated QUantitative Analysis (AQUA) system6. Tissue sections are labeled with specific antibodies directed against cytokeratins and targets of interest, coupled to fluorophore-labeled secondary antibodies. Slides are imaged using a whole-slide fluorescence scanner. Images are subdivided into hundreds to thousands of tiles, and each tile is then assigned an AQUA score which is a measure of protein concentration within the epithelial (tumor) component of the tissue. Heatmaps are generated to represent tissue expression of the proteins and a heterogeneity score assigned, using a statistical measure of heterogeneity originally used in ecology, based on the Simpson's biodiversity index7.
To date there have been no attempts to systematically map and quantify this variability in tandem with protein expression, in histological preparations. Here, we illustrate the first use of the method applied to ER and HER2 biomarker expression in ovarian cancer. Using this method paves the way for analyzing heterogeneity as an independent variable in studies of biomarker expression in translational studies, in order to establish the significance of heterogeneity in prognosis and prediction of responses to therapy.

Here we describe a method to quantify molecular heterogeneity in histological sections of tumor material using quantitative immunofluorescence, image analysis, and a statistical measure of heterogeneity. The method is intended for use in clinical biomarker development and analysis.

Heterogenität Mapping von Protein Expression in Tumoren mittels quantitativer Immunfluoreszenz

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

Forschung

Medizin

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

MicroRNA-Detektion in Prostatatumoren durch quantitative real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due to the high percentage of binucleated cells,1 the predominantly heterochromatic state of the DNA, and the non-dividing nature of the cardiomyocyte which renders adult nuclei in a permanent state of interphase.2 Transcriptional regulation during development and disease have been well studied in this organ,3-5 but what remains relatively unexplored is the role played by the nuclear proteins responsible for DNA packaging and expression, and how these proteins control changes in transcriptional programs that occur during disease.6 In the developed world, heart disease is the number one cause of mortality for both men and women.7 Insight on how nuclear proteins cooperate to regulate the progression of this disease is critical for advancing the current treatment options.
Mass spectrometry is the ideal tool for addressing these questions as it allows for an unbiased annotation of the nuclear proteome and relative quantification for how the abundance of these proteins changes with disease. While there have been several proteomic studies for mammalian nuclear protein complexes,8-13 until recently14 there has been only one study examining the cardiac nuclear proteome, and it considered the entire nucleus, rather than exploring the proteome at the level of nuclear sub compartments.15 In large part, this shortage of work is due to the difficulty of isolating cardiac nuclei. Cardiac nuclei occur within a rigid and dense actin-myosin apparatus to which they are connected via multiple extensions from the endoplasmic reticulum, to the extent that myocyte contraction alters their overall shape.16 Additionally, cardiomyocytes are 40% mitochondria by volume17 which necessitates enrichment of the nucleus apart from the other organelles. Here we describe a protocol for cardiac nuclear enrichment and further fractionation into biologically-relevant compartments. Furthermore, we detail methods for label-free quantitative mass spectrometric dissection of these fractions-techniques amenable to in vivo experimentation in various animal models and organ systems where metabolic labeling is not feasible.

Advances in mass spectrometry have allowed the high throughput analysis of protein expression and modification in a host of tissues. Combined with subcellular fractionation and disease models, quantitative mass spectrometry and bioinformatics can reveal new properties in biological systems. The method described herein analyzes chromatin-associated proteins in the setting of heart disease and is readily applicable to other in vivo models of human disease.

Quantitative Analyse von Chromatin Proteome in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome compared to matched normal tissue. Based on these analyses it is evident that there are many undiscovered genetic drivers of cancer1. Unfortunately these drivers are hidden within a much larger number of passenger anomalies in the genome that do not directly contribute to tumor formation. Another aspect of the cancer genome is that there is considerable genetic heterogeneity within similar tumor types. Each tumor can harbor different mutations that provide a selective advantage for tumor formation2. Performing an unbiased forward genetic screen in mice provides the tools to generate tumors and analyze their genetic composition, while reducing the background of passenger mutations. The Sleeping Beauty (SB) transposon system is one such method3. The SB system utilizes mobile vectors (transposons) that can be inserted throughout the genome by the transposase enzyme. Mutations are limited to a specific cell type through the use of a conditional transposase allele that is activated by Cre Recombinase. Many mouse lines exist that express Cre Recombinase in specific tissues. By crossing one of these lines to the conditional transposase allele (e.g. Lox-stop-Lox-SB11), the SB system is activated only in cells that express Cre Recombinase. The Cre Recombinase will excise a stop cassette that blocks expression of the transposase allele, thereby activating transposon mutagenesis within the designated cell type. An SB screen is initiated by breeding three strains of transgenic mice so that the experimental mice carry a conditional transposase allele, a concatamer of transposons, and a tissue-specific Cre Recombinase allele. These mice are allowed to age until tumors form and they become moribund. The mice are then necropsied and genomic DNA is isolated from the tumors. Next, the genomic DNA is subjected to linker-mediated-PCR (LM-PCR) that results in amplification of genomic loci containing an SB transposon. LM-PCR performed on a single tumor will result in hundreds of distinct amplicons representing the hundreds of genomic loci containing transposon insertions in a single tumor4. The transposon insertions in all tumors are analyzed and common insertion sites (CISs) are identified using an appropriate statistical method5. Genes within the CIS are highly likely to be oncogenes or tumor suppressor genes, and are considered candidate cancer genes. The advantages of using the SB system to identify candidate cancer genes are: 1) the transposon can easily be located in the genome because its sequence is known, 2) transposition can be directed to almost any cell type and 3) the transposon is capable of introducing both gain- and loss-of-function mutations6. The following protocol describes how to devise and execute a forward genetic screen using the SB transposon system to identify candidate cancer genes (Figure 1).

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

A method of identifying unknown drivers of carcinogenesis using an unbiased approach is described. The method uses the Sleeping Beauty transposon as a random mutagen directed to specific tissues. Genomic mapping of transposon insertions that drive tumor formation identifies novel oncogenes and tumor suppressor genes

Identifizierung von<em&gt; Dornröschen</em&gt; Transposon Insertionen in Solid Tumors mit Linker-vermittelte PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

Liquor microRNA Profiling mittels quantitativer Real-Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

In Vivo Optical Imaging von Hirntumoren und Arthritis mit fluoreszierenden SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

Verfahren zur Gewinnung von Primäreierstockkrebszellen von Solid Proben

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

Die Erzeugung von Microtumors Mit 3D Human Biogel Kultursystem und Patienten stammGlioblastomZellen für Kinomic Profilieren and Drug Response-Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

Isolation und Profilierung von microRNA-haltigen Exosomen von Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Spatial Measurements of Perfusion, Interstitial Fluid Pressure and Liposomes Accumulation in Solid Tumors

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes is a critical determinant of their efficacy. Both the chaotic tumor microcirculation and elevated IFP are linked to the heterogeneous intra-tumoral distribution of nanotechnology-based drug delivery systems such as liposomes. In the present study, the relationship between tumor microcirculation, elevated IFP, and accumulation of nanoparticles was investigated through in vivo experimentation. This was accomplished by evaluation of the tumor microcirculation using dynamic contrast enhanced computed tomography (DCE-CT) and measurement of tumor IFP using a novel image-guided robotic needle placement system connected to the micro-CT scanner. The intra-tumoral accumulation of liposomes was determined by CT image-based assessment of a nanoparticle liposomal formulation that stably encapsulate the contrast agent iohexol (CT-liposomes). CT imaging allowed for co-localization of the spatial distribution of tumor hemodynamics, IFP and CT-liposome accumulation in an individual subcutaneous xenograft mouse model of breast cancer. Measurements led to the discovery that perfusion and plasma volume fraction are strong mediators of the intra-tumoral distribution of liposomes. Furthermore, the results suggest that IFP plays an indirect role in mediating liposome distribution through modulating blood flow.

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes has been linked to an abnormal tumor microenvironment. Herein methods are presented to measure tumor microcirculation by perfusion imaging and elevated interstitial fluid pressure (IFP) using an image-guided robotic system. Measurements are compared to the intra-tumoral accumulation of liposomes, determined using volumetric micro-CT imaging.