Aus dem National Institute of Mental Health: Das beschriebene Projekt wurde von Preis Anzahl R01MH079751 (F. Peruzzi PI) unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich der Verantwortung der Autoren und nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des National Institute of Mental Health oder des National Institute of Health.

Das folgende Protokoll beschreibt die Standard-Verfahren, um RNA aus GFK und Profil microRNAs mit fertigen PCR-Platten isolieren. Beachten Sie, dass die organische Extraktionsphase ist optional, und daß ein Träger-RNA wird während der Extraktion gewährleistet eine maximale Rückgewinnung der RNA zu der Probe gegeben. Folglich gibt es keine Notwendigkeit, um die RNA zu quantifizieren. Insgesamt kann ein Durchschnitt von 6-8 Platten an einem Tag ausgeführt werden, wenn die cDNA am Tag zuvor (ca. 2 h) synthetisiert. Analyse der Daten wird ausgeführt, wenn alle Proben profiliert und in die Software geladen. Abhängig von der Anzahl von Proben / Gruppen oder deren Kombination für den Vergleich kann die Datenanalyse von einem bis zu mehreren Stunden dauern. 1. RNA-Extraktion Bei -80 ° C in Aliquoten bis zur Analyse der RNA-Extraktion von CSF-Proben durchgeführt, gefroren gelagert. Für dieses Verfahren die Mirvana Paris Isolation Kit verwendet wurde, nach Angaben des Herstellers Instrumentections für die Gesamt-RNA Isolation. Bitte beachten Sie, dass, obwohl Bereicherung für kleine RNA-Spezies mit diesem Kit möglich ist, wird dieser Schritt nicht durchgeführt und die RNA-Extraktionsverfahren ist nach dem Gesamt-RNA Isolation Schritt beendet. Darüber hinaus, obwohl die Mirvana Paris Isolation Kit (wie andere kommerziell erhältliche RNA Isolation Kits) keine organischen Extraktions nicht verlangen, ein Protokoll für dieses Verfahren finden Sie unten. Das Protokoll für die RNA-Extraktion erfolgt in zwei Schritten: 1.1. Bio-Extraction (nicht bei Verwendung Mirvana Paris RNA-Extraktions-Kits erforderlich) 1.2.2. Gesamt-RNA Isolierung 1.1. Bio-Extraktion 1.1.1. Bereiten Reagenzien <ol><li> In 375 ul 2-Mercaptoethanol zu 2x Denaturierung Lösung, und speichern Sie sie bei 4 ° C </li></ol> 1.1.2. Bereiten Sie die CSF <ol><li> Auftauen jedes Aliquot CSF auf Eis vor der RNA-Extraktion. 1 ug MS2 RNA Träger zu 0,5 ml CSF aufgetaut und vorsichtigmischen. Beachten Sie, dass, wenn die organischen Extraktions weggelassen wird, wird die MS2 Träger der in 1.2.2.1 unten beschrieben Probe vor der RNA-Isolierung hinzugefügt werden. </li><li> Mischungs 0,5 ml 2x Denaturierungslösung bei Raumtemperatur zu der CSF. </li><li> 1 ml der Säure-Phenol: Chloroform zu der CSF plus 2x Denaturierung Lösung: achten Sie darauf, den Boden entzogen Phase, die Säure-Phenol: Chloroform, nicht die wässrigen Puffer, der oben auf der Mischung liegt. Zusätzlich ist zu beachten, dass Säure-Phenol: Chloroform enthält Phenol, das ein Gift und ein Reizmittel, Schutzhandschuhe und andere persönliche Schutzausrüstung ist bei der Arbeit mit diesem Reagenz. </li><li> Vortex für 30-60 Sek. mischen. Zur Vereinfachung sind die 2 ml der Probe / Denaturierungslösung / Säure-Phenol: Chloroform-Mischung in zwei 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen aufgeteilt. </li><li> Zentrifugieren für 5 min bei maximaler Geschwindigkeit (10.000 × g) bei Raumtemperatur. </li><li> Die wässrige (obere) Phase vorsichtig entfernen, ohne die untere Phase oder der Interphase zu stören und es auf einfrisches Röhrchen. Beachten Sie die Lautstärke zurückgewonnen. </li></ol> 1.2. RNA-Isolierung Es wird empfohlen, eine eigene Bank, Satz Pipetten und Racks für den Umgang mit RNA-Proben zu haben. Der Arbeitsbereich und Werkzeuge werden durch die Verwendung RNase Zap Spray dekontaminiert und wischt vor jedem Experiment. 1.2.1. Bereiten Reagenzien: <ol><li> In 21 ml 100% Ethanol zu miRNA Waschlösung 1 und 40 ml 100% Ethanol zum Waschlösung 2/3. Bitte beachten Sie, dass miRNA Waschlösung 1 enthält Guanidiumthiocyanat, die eine potenziell gefährliche Substanz ist. </li></ol> 1.2.2. Gesamt-RNA Isolierung <ol><li> In 1,25 Volumina von Raumtemperatur 100% Ethanol zu der wässrigen Phase von der organischen Extraktion und gründlich mischen. </li><li> Legen Sie eine Filterpatrone in einen der Röhrchen. </li><li> Pipette nicht mehr als 700 ul des Lysats / Ethanol-Mischung auf die Filterpatrone. </li><li> Zentrifugieren für 30 s bei maximalerGeschwindigkeit. Anwenden der Mischung von mehr als 700 &amp;mgr; l in aufeinanderfolgenden Anwendungen auf dem gleichen Filter. Entsorgen Sie die Durchfluss nach jeder Zentrifugation und speichern Sie die Röhrchen für den Waschschritten. </li><li> Bewerben 700 ul miRNA Waschlösung 1 auf die Filterpatrone und Zentrifuge für 15 sec bei maximaler Geschwindigkeit. Verwerfen Sie den Durchfluss durch von der Röhrchen und ersetzen Sie die Filterpatrone in die gleiche Röhrchen. </li><li> Bewerben 500 ul Waschlösung 2/3 und Zentrifuge für 15 sec bei maximaler Geschwindigkeit. Verwerfen Sie den Durchfluss durch von der Röhrchen und ersetzen Sie die Filterpatrone in die gleiche Röhrchen. Tragen Sie eine zweite 500 ul Waschlösung 2/3 und Zentrifuge für 15 sec bei maximaler Geschwindigkeit. Verwerfen Sie den Durchfluss durch von der Röhrchen und ersetzen Sie die Filterpatrone in die gleiche Röhrchen. Drehen die Anordnung für 1 min bei Maximalgeschwindigkeit um Restfluid aus dem Filter zu entfernen. </li><li> Übertragen Sie die Filterpatrone in eine frische Röhrchen. Bewerben 100 &amp; mu; L vorgewärmten (95 ° C) Nuklease-freies Wasser auf die Mitte des Filters, und schließen Sie den Deckel. Zentrifugieren für 30 Sekunden bei maximaler Geschwindigkeit, um die RNA zu erholen. </li><li> Sammeln Sie das Eluat, RNA und speichern sie bei -80 ° C für spätere Anwendungen. </li><li> Quantifizieren 1 ul RNA unter Verwendung des Nanodrop 2000c Spektrophotometer. Beachten Sie, dass RNA-Quantifizierung kann ausgelassen werden, wenn eine RNA-Träger während der RNA-Extraktion der Probe zugegeben werden. In diesem Fall 8 ul RNA der cDNA-Synthese unterzogen, wie unten beschrieben. </li></ol> 2. miRNA-Profil: qRT-PCR-Protokoll Das Protokoll für die miRNA Profilierung besteht aus zwei Schritten: <ol><li> Erststrang-cDNA-Synthese </li><li> Echtzeit-PCR-Amplifikation </li></ol> 2.1. Erststrang-cDNA-Synthese 2.1.1. Verdünnen Matrizen-RNA <ol><li> Einzustellen jeder der Matrizen-RNA-Proben auf eine Konzentration von 5 ng / &amp;mgr; l unter Verwendung von Nuklease freiem Wasser. Wenn derRNA wurde nicht quantifiziert (siehe Schritt 1.2.2.9), dann 8 ul RNA für die cDNA-Synthese verwendet </li></ol> 2.1.2. Bereiten Reagenzien <ol><li> Tauen Sie vorsichtig die 5x Reaktionspuffer und Nuklease freiem Wasser, und sofort auf Eis legen. </li><li> Mischen durch Vortexen. Die RNA Spike-in durch Zugabe von 40 ul Nuklease freiem Wasser auf dem Rohr und vortexen, lassen Sie es auf Eis für 15-20 min. Unmittelbar vor der Anwendung zu entfernen, die das Enzym-Mix aus der Tiefkühltruhe, mischen durch Schwenken der Röhrchen und setzen auf Eis. Spin down alle Reagenzien. </li></ol> 2.1.3. Reverse-Transkriptions-Reaktion Setup <ol><li> Vorbereitung der erforderlichen Menge an RT-Arbeitslösung in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen oder dgl. (in den Anteilen in Tabelle 1 angegeben, mit Ausnahme der RNA-Matrize), vortexen (1-2 Sekunden bei Höchstgeschwindigkeit), kurz Spin-down ( verwenden wir eine Mini-Eppendorf-Zentrifuge mit Festdrehzahl, 10 sec) und legen Sie es auf Eis. Beachten Sie, dass die RNA UniSp6 Spitze-In vor der RT-Reaktion zu der Probe gegeben (siehe Tabelle 1). </li><li> Dispense RT Arbeitslösung in nucleasefreiem PCR-Röhrchen. </li><li> Verzichten Matrizen-RNA in jedes Röhrchen. Hinweis: denken Sie daran, 10% Überschussvolumen / jedes Reagenz für Pipettier-und / oder Roboter-Totvolumen berechnen. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Panel I Volumen (ul) </td><td> Panel I + II Volumen (ul) </td></tr><tr><td> 5x Reaktionspuffer </td><td> 4.4 </td><td> 8.8 </td></tr><tr><td> Nuklease freiem Wasser </td><td> 9.9 </td><td> 19,8 </td></tr><tr><td> Enzym-Mix </td><td> 2.2 </td><td> 4.4 </td></tr><tr><td> UniSp6 RNA Spike-In-Vorlage </td><td> 1.1 </td><td> 2.2 </td></tr><tr><td> Vorlage Gesamt-RNA (5 ng / ul) </td><td> 4.4 </td><td> 8.8 </td></tr&gt; <tr><td> Gesamtvolumen </td><td> 22 </td><td> 44 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Reverse-Transkriptions-Reaktion-Setup. </li></ol> 2.1.4. Mix-und Spin-Reagenzien <ol><li> Mischen Sie die Reaktion durch schon (1-2 sec) Vortexen, um sicherzustellen, daß alle Reagenzien werden gründlich gemischt. Nach dem Mischen Spin-Down (Mini Eppendorf-Zentrifuge mit Festdrehzahl, 10 sec). </li></ol> 2.1.5. Inkubieren und Wärme inaktivieren <ol><li> Programmieren Sie eine PCR-Maschine wie folgt: </li><li> Inkubation für 60 min bei 42 ° C </li><li> Wärme-Inaktivierung der reversen Transkriptase für 5 min bei 95 ° C </li><li> Sofort kühlen auf 4 ° C </li><li> Lagerung bei 4 ° C oder gefrier Hinweis: Das Protokoll kann zu diesem Zeitpunkt unterbrochen werden. Die unverdünnte cDNA kann bei -20 ° C für bis zu 5 Wochen (optional bei 4 ° C bis zu 4 Tage) gehalten werden. </li></ol><pclass = &quot;jove_step&quot;&gt; 2.2. Echtzeit-PCR-Amplifikation 2.2.1. Bereiten Reagenzien für die Real-time PCR <ol><li> Zeigen cDNA (aus Schritt 2.1.5) auf Eis. </li><li> Tauwetter Nuklease freiem Wasser und PCR Master Mix auf Eis. Schützen Sie die PCR Master Mix Röhrchen aus Licht, indem sie mit Alufolie abdecken. Unmittelbar vor der Anwendung mischen die PCR Master Mix durch Vortexen 1-2 sec in einem Mini-Zentrifuge und drehen sich mit 1.500 xg unten für 1 min. </li></ol> 2.2.2. Kombinieren Sie SYBR Green Master Mix, Wasser und cDNA und in den PCR-Platten Folgende Vorgehensweise wird empfohlen, um niedrige Konzentrationen von cDNA aus den Rohroberfläche haften zu vermeiden: <ol><li> Vor dem Entfernen der Plattendichtung, kurz drehen Sie die Platte (n) in einer Kühlzentrifuge bei 1.500 g für 1 min. </li><li> In einem 15 ml konischen Röhrchen verbinden 2x PCR Master Mix und Wasser. Panel I: 2,000 ul 2x Master-Mix und 1980 ul Wasser; Panel I + II: 4.000 ul 2x Master-Mix und 3960 μ; L Wasser. </li><li> In 20 ul cDNA (Panel I) oder 40 ul cDNA (Panel I + II) und mischen. </li><li> Vorsichtig mischen durch Vortexen 1-2 sec und Spin in einer Kühlzentrifuge bei 1.500 g für 1 min. </li><li> Setzen Sie die PCR Master Mix / cDNA-Mix in einer Mehrkanalpipette Reservoir. Sie haben ein Reservoir, das die Länge des Mehrkanal-Pipette zu identifizieren. Dies hält den Pegel der Lautstärke hoch genug, so dass für gleiche Volumen Aliquots in der gesamten Mehrkanal. Dies ist kritisch gegenüber der letzten Teilmengen. </li><li> Dispense 10 ul PCR Master Mix / cDNA mischen, um jede Vertiefung der 384-well-Platte mit einem 16-Kanal-Pipette. </li><li> Verschließen Sie die Platte mit optischen Abdichtung. </li><li> Spin Platte kurz in einer Kühlzentrifuge (1500 g für 1 min), um die Lösungen zu mischen, und entfernen Sie Luftblasen. Hinweis: Das Experiment kann an dieser Stelle angehalten werden. Bewahren Sie die Reaktionen von Licht für bis zu 24 Stunden geschützt bei 4 ° C. </li></ol> 2.2.3. Echtzeit-PCR Führen Sie Echtzeit-PCR-Amplifikation und Schmelzkurvenanalyse nach den in Tabelle 2 aufgeführten Parameter. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Prozessschritt </td><td> Einstellungen, Roche LC480 </td></tr><tr><td> Polymerase Aktivierung / Denaturierung </td><td> 95 ° C, 10 min </td></tr><tr><td> Verstärkung </td><td> 45 Zyklen bei Amplification 95 ° C, 10 sec 60 ° C, 1 Min. Ramp-Rate 1,6 ° C / sec Optische Lese </td></tr><tr><td> Schmelzkurvenanalyse </td><td> Ja </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Echtzeit-PCR-Zyklusbedingungen mit dem Roche LightCycler 480. 2.3. Echtzeit-PCR-Daten-Analyse Echtzeit-PCR-Daten-Analyse mit dem Exiqon Genex Professional 5.0 getan, nach ter empfahl Anweisungen. Der Genex Schritt-für-Schritt-Anleitung kann heruntergeladen werden <a href="http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf">http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf</a> Datenanalyse besteht aus drei Schritten: <ol><li> Import von Daten </li><li> Vorverarbeitung von Daten </li><li> Die statistische Analyse </li></ol> 2.3.1. Import von Daten <ol><li> In der Roche LightCycler 480 wählen Sie die 2. Ableitung Analyseverfahren und die Berechnung der Cq-Werte. Die Daten werden als Tabelle exportiert und als Textdateien gespeichert. </li><li> Um die Daten, offene Genex importieren und klicken Sie auf den Exiqon Import-Assistenten und klicken Sie auf &quot;Start&quot;. Folgen Sie den Anweisungen, um Format, Instrumenten-und Plattenlayout-Datei (en) auswählen. Beachten Sie, dass Platte Layout-Dateien (Excel-Dateien) werden von der Exiqon Website (heruntergeladen <a href="http://www.exiqon.com/plate-layout-files">http://www.exiqon.com/plate-layout-files</a> ). </li><li> Bedeutungt Panels I und II und klicken Sie auf &quot;Weiter&quot;. </li><li> Das nach der Datei-Import erzeugte Tabelle enthält vordefinierte Spalten. Proben Namen können bearbeitet werden und Klassifikation Spalten hinzugefügt oder in diesem Schritt entfernt werden. Klicken Sie auf &quot;Weiter&quot;, wenn Sie fertig sind. </li><li> Daten speichern und laden, um Daten-Editor. </li></ol> 2.3.2. Vorverarbeitung von Daten <ol><li> Wie von Exiqon und Genex empfohlen, beim Vergleich mehrerer Platten das erste, was zu tun ist, um die Daten zwischen den Platten durch die Wahl unter-Plattenkalibrierung von der Vorverarbeitung Menü kalibrieren. </li><li> Es wird empfohlen, miRNA-Arrays in dreifacher Ausfertigung Läufen gefahren. Wenn ein miRNA ist nicht vorhanden, in mindestens zwei von drei Replikaten es als nonexpressed eingestellt werden. </li><li> Im nächsten Schritt wird in der Vorverarbeitung, stellen einen Schnitt aus. Eine Schnittwert festlegen, dass Daten mit einem Schwellenwert-Zyklus (C t) höher als dieser Wert, werden verworfen. In den vorliegenden Experimenten mit Rückenmarksflüssigkeit Probe wurde der Cut-off bei 39 gesetzt. Therefore werden alle Proben mit einem C t höher als 39 in den drei Replikate verworfen. Wenn ein miRNA einen C t&gt; 39 für eine Sonde (eine Nachbildung von drei) wird, dass das Lesen mit dem Durchschnitt der C t für die anderen zwei Sonden ausgetauscht werden, sofern sie beide unter 39. </li><li> Definieren Referenzgenen. Genex Professional verfügt über die Option, geNorm und / oder Normfinder nutzen, um Referenzgene zu identifizieren. Wählen Sie eine Liste von miRNAs, die ähnliche Cq-Werte über alle Proben haben und führen geNorm und / oder Normfinder. Nach dieser Analyse in dem hier angegebenen Beispiel miR-622 und miR-1266 hatte die gleichmäßige Werte für die Proben und wurden als Referenzgenen gewählt (Fig. 1). </li><li> Als nächstes werden Daten unter Verwendung der Referenzgenen normalisiert und die erhaltenen Werte entsprechen der &amp;Dgr; t </li><li> Wenn die cDNA-Synthese-Reaktionen wurden dreifach durchgeführt, zu diesem Zeitpunkt die Werte gemittelt werden. </li><li> Bestätigen Blatt erneutbewegen leer und fast leeren Spalten. In der Vorlauf Fenster wählen Sie &quot;Bestätigen Blatt&quot; und als auf der leeren Spalten löschen Linie gelten. In der Zeile darunter, wählte den gewünschten Prozentsatz der gültigen Daten und klicken Sie auf Anwenden. Wählen Sie zB 100%, wenn Sie nur miRNAs, die für alle Proben zu vergleichen wollen. </li><li> Griff fehlenden Daten. Wählen Sie &quot;Fehlende Daten&quot; aus der Vorverarbeitung Menü und wählte eine der Optionen, um fehlende Daten zu verarbeiten. Dieser Schritt ist erforderlich. Beachten Sie, dass Genex erhalten Sie Fehler, wenn Sie versuchen, Dateien, die nicht behandelte fehlenden Daten enthalten laden. </li><li> Bestimmen relative Quantifizierung zwischen Gruppen von Proben (dh. Experiment versus Kontrolle). Die relative Quantifizierung von Gruppen unter Verwendung des ΔΔ C t-Methode berechnet. In Genex, klicken Sie auf die Registerkarte Vorverarbeitung und wählen Sie die relative Quantifizierung. In dem Fenster wählen Sie die Referenzgruppe und schlug an. Beachten Sie, dass für den grafischen Darstellungen und / oder für weitere statistische Analysen, expression Daten sollten auf einer logarithmischen Skala umgewandelt werden. In der Vorlauf-Menü Log2. </li></ol> 2.3.3. Statistische Analyse Genex-Software ermöglicht eine breite Palette von statistischen Analysen, einschließlich T-Test und ANOVA. <ol><li> Lade die endgültige MDF-Datei in Genex und offene Daten-Manager. Es ist wichtig, die korrekte Muster oder Gruppen von Proben, für die statistische Analyse durchgeführt wird ausgewählt. </li><li> Wählen Sie &quot;Statistik&quot; und wählte das Symbol für den gewünschten Test. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Ausführen&quot; im Fenster der Systemsteuerung. Ergebnisse speichern als Excel-oder MDF-Dateien. </li></ol> 2.3.4. Expression-Profiling MicroRNAs und Proben klassifiziert werden können, geclustert und auf hitze Karten und Dendrogrammen visualisiert, wie folgt <ol><li> Lade die endgültige MDF-Datei in Genex und offene Daten-Manager. Verwenden Sie dieses Fenster, um Gruppen von Proben oder miRNAs auswählen und erstellen. Klicken Sie auf &quot;Übernehmen&quot;, wenn Sie fertig sind. </li> &lt;li&gt; In der linken oberen Ecke wählen Cluster und klicken Sie auf das Symbol Heatmap </li><li> Im Kontrollfenster klicken Sie auf &quot;Ausführen&quot;. Die Heatmap können in verschiedenen Formaten wie TIFF oder BMP gespeichert werden, es kann auch kopiert und modifiziert werden, wie gebraucht. </li></ol>

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	<li>Pacifici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+miRNA+profile+in+HIV-encephalitis.">Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis.</a> J. Cell. Physiol. 10, (2012).</li><li>Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+widespread+regulation+of+microRNA+biogenesis,+function+and+decay.">The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay.</a> Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (2010).</li><li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+signatures+in+human+cancers.">MicroRNA signatures in human cancers.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 857-866 (2006).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microRNAs+in+serum:+a+novel+class+of+biomarkers+for+diagnosis+of+cancer+and+other+diseases.">Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.</a> Cell Res. 18, 997-1006 (2008).</li><li>De Smaele, E., Ferretti, E., Gulino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+biomarkers+for+CNS+cancer+and+other+disorders.">MicroRNAs as biomarkers for CNS cancer and other disorders.</a> Brain Res. 1338, 100-111 (2010).</li><li>Heneghan, H. M., Miller, N., Kerin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNAs+as+biomarkers+and+therapeutic+targets+in+cancer.">MiRNAs as biomarkers and therapeutic targets in cancer.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 543-550 (2010).</li><li>Kosaka, N., Iguchi, H., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNA+in+body+fluid:+a+new+potential+biomarker+for+cancer+diagnosis+and+prognosis.">Circulating microRNA in body fluid: a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis.</a> Cancer Sci. 101, 2087-2092 (2010).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers.">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435, 834-838 (2005).</li><li>Shah, A. A., Leidinger, P., Blin, N., Meese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA:+small+molecules+as+potential+novel+biomarkers+in+cancer.">miRNA: small molecules as potential novel biomarkers in cancer.</a> Curr. Med. Chem. 17, 4427-4432 (2010).</li><li>Blondal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+sample+and+miRNA+profile+quality+in+serum+and+plasma+or+other+biofluids.">Assessing sample and miRNA profile quality in serum and plasma or other biofluids.</a> Methods. 59, 1-6 (2013).</li><li>Jensen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two+commercial+global+miRNA+expression+profiling+platforms+for+detection+of+less+abundant+miRNAs.">Evaluation of two commercial global miRNA expression profiling platforms for detection of less abundant miRNAs.</a> BMC Genomics. 12, 435 (2011).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

MicroRNAs sind kleine nicht-kodierende RNAs, die die Genexpression regulieren, durch die Hemmung der Translation und / oder die Förderung der mRNA-Abbau 2. Aufgrund ihrer hohen Stabilität in zellfreien Bedingungen haben microRNAs in vielen Körperflüssigkeiten nachgewiesen worden. Außerdem hat deutliche Expressionsprofil miRNAs mit Stufe und / oder Progression bei einer Vielzahl von menschlichen Krebsarten 3-9 korreliert. Es gibt verschiedene Tools zur Verfügung, u...

MicroRNAs gehören zu der Familie der kleinen (21-23 nt Länge) nicht-kodierenden RNAs die Genexpression posttranskriptional regulieren. Mikro-RNAs in den extrazellulären Raum, in dem sie erscheinen, relativ stabil zu sein, sezerniert werden. Während Bestimmung von Veränderungen in der miRNA-Expression kann ein wichtiger Schritt zur Identifizierung von Biomarkern sein, die Durchführung miRNA-Profile und Handhabung einer großen Menge von Daten kann einschüchternd sein. Hier beschreiben wir ein Protokoll von Änderungen in miRNA-Expression in der Zerebrospinalflüssigkeit von einem empfindlichen Echtzeit-PCR (für andere Körperflüssigkeiten) zu bestimmen. Wir beschreiben auch die Verwendung von Software für die Datenanalyse, einschließlich der statistischen Auswertung und grafische Darstellung der Ergebnisse. Das gesamte Verfahren ist relativ einfach und unkompliziert und in Abhängigkeit von der Anzahl der Proben, die profiliert werden und die Anzahl von Echtzeit-PCR-Maschinen verfügbar sind, auch relativ schnell. Der experimentelle Teil erfordert Genauigkeit bei der HandhabungRNA und Pipettieren in 384-Well-Platten, während der Datenanalyse Abschnitt mit Genex erfordert einige Grundkenntnisse in Informatik und Statistik.

Table III. List of equipment
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<tbody>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:27px;">
			Equipment
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:27px;">
			Company
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:27px;">
			Catalog Number
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Finnpipette Novus Multichannel Pipetter
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Thermo Scientific
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			HH05279
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Finntip Pipette Tips
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Thermo Scientific
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			9400613
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Thermal Cycler C1000
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Biorad
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Biorad
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			TLS0801
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Flat Cap Strips
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Biorad
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			TLS0803
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			LightCycler&#174; 480 Real-Time PCR System
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Roche
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			LightCycler&#174; 480 Sealing Foil
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Roche
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			04 729 757 001
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Refrigerated Centrifuge 5804R
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Eppendorf
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Swing-bucket Rotor, 4-place
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Eppendorf
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			A-4-44
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-Top Mini Centrifuge
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			05-090-100
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-Top Vortex
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			02-681-5
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Matrix Reagent Reservoir, 25 ml
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Thermo Scientific
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			8093
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Thermomixer Confort
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Eppendorf
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-To Mini Centrifuge Sigma 1-15
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-Top Vortex
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Velp Scientifica
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			F202A0173
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

Table IV. List of reagents
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<tbody>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:25px;">
			Reagents
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:25px;">
			Company
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:25px;">
			Catalog Number
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Exiqon
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			203300
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Exiqon
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			203400
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Invitrogen
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			10977-015
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Exiqon
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			203608
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			mirVana&#8482; miRNA isolation Kit, 40 isolations
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Ambion
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			AM1556
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			MS2 RNA carrier
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Roche Applied Science
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			10165948001
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			2Betamercaptoethanol 98%
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Sigma Aldrich
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			M3148-25ml
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Ethanol 100%
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Carlo Erba
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			64-17-5
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Nuclease free water
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Qiagen
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			1039480
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			RNAse Zap&#174;
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Ambion
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			AM9780
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cerebrospinal fluid microrna profiling using quantitative real time pcr

<html> MicroRNAs (miRNAs) sind eine starke Schicht der Genregulation Führungs RISC zu Seiten mRNAs Ziel befindet und somit durch Modulation ihrer translationale Repression. Änderungen in der miRNA-Expression wurde gezeigt, dass bei der Entwicklung von allen großen komplexen Erkrankungen beteiligt sein. Darüber hinaus zeigten neuere Erkenntnisse, dass miRNAs an die extrazelluläre Umgebung sezerniert werden und in die Blutbahn und anderen Körperflüssigkeiten, wo sie mit hoher Stabilität zirkulieren kann. Die Funktion eines solchen zirkulierenden miRNAs bleibt weitgehend ungeklärt, aber systematische Hochdurchsatz-Methoden, wie z. B. miRNA-Profiling Arrays haben zur Identifizierung von miRNA-Signaturen in verschiedenen pathologischen Bedingungen, einschließlich der neurodegenerativen Erkrankungen und einige Krebsarten führen. In diesem Zusammenhang ist die Identifizierung von miRNA-Expressionsprofils in der Cerebrospinalflüssigkeit, wie in unserer jüngsten Studie berichtet, macht miRNAs attraktive Kandidaten für Biomarker-Analyse. _content &quot;&gt; Es gibt verschiedene Tools für die Profilierung von microRNAs, wie Microarrays zur Verfügung, quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) und deep sequencing. Hier beschreiben wir eine empfindliche Methode, um microRNAs in Liquor durch quantitative Echtzeit-PCR-Profil. Wir verwendet die Exiqon microRNA ready-to-use PCR menschlichen Platten I und II V2.R, die ermöglicht den Nachweis von 742 einzigartige menschliche microRNAs. Wir führten die Arrays in dreifacher Ausfertigung läuft und wir verarbeitet und analysiert Daten mit der Genex Professional 5 Software. Über dieses Protokoll, haben wir erfolgreich in verschiedenen Arten von Zelllinien und Primärzellen, Liquor, Plasma und Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Geweben Profil microRNAs.

Die Ergebnisse dieser Studie wurden bereits veröffentlicht worden 1. Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse aus der Analyse der Kandidatenreferenz microRNAs mit geNorm Anwendung. Dementsprechend zwei microRNAs, miR-622 und miR-1266, wurden als Referenzgene identifiziert und wurden verwendet, um miRNA Werte normalisieren. Für die CSF-Studie hatten wir drei Gruppen von Proben: HIV-(n = 10), HIVE (n = 4) und HIV + ohne Enzephalitis (HIV +, n = ...

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Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

Wir beschreiben ein Protokoll der Echtzeit-PCR, um microRNAs in der Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit (CSF) zu profilieren. Mit Ausnahme von RNA-Extraktionsprotokollen kann der Vorgang um RNA aus anderen Körperflüssigkeiten, Zellkulturen oder Gewebeproben extrahiert verlängert werden.

Liquor microRNA Profiling mittels quantitativer Real-Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

cerebrospinal-fluid-microrna-profiling-using-quantitative-real-time

Research

JoVE Journal

Medicine

15.3K Aufrufe.  LSU Health Sciences Center.  Wir beschreiben ein Protokoll der Echtzeit-PCR, um microRNAs in der Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit (CSF) zu profilieren. Mit Ausnahme von RNA-Extraktionsprotokollen kann der Vorgang um RNA aus anderen Körperflüssigkeiten, Zellkulturen oder Gewebeproben extrahiert verlängert werden. 