Finanzielle Unterstützung wurde von der JMS NIH Biomechanik in der Regenerativen Medizin T32 Training Program (2T32EB003392) von den NIH Director New Innovator Award (1DP2HL117750) vorgesehen ist, um aus dem QJ Dowd ICES-Fellowship und AWF.

1. Herstellung von Master-Mold mittels Photolithographie <ol><li> Die ECM-Protein-Nanofasern, nanofabrics und Nanostrukturen hergestellt werden, werden zunächst mit Hilfe von Computer Aided Design (CAD) Software konzipiert. Diese CAD-Datei wird dann auf eine Photomaske übertragen. Die Art der Photomaske auf die Auflösung der Funktionen hängen; mit einer Transparenz-basierte Photomaske ausreichend für Spielgrößen bis zu ~ 10 um. Kleinere Funktionen &lt;10 um eine Chrom auf Glasphotomaske erforderlich. Alle Nanofasern und Nanostrukturen hier vorgestellten wurden mit einem Transparenz-basierte Photomaske nicht lateralen Abmessungen hergestellt und waren damit im Nanometer-Maßstab in der Dicke aber. Hinweis: Es ist wichtig, zu unterscheiden, welche Regionen der Photomaske wird dunkel sein (verhindert UV Licht passieren) und die transparent sein wird (lassen UV-Licht durchlässt), da dies, zusammen mit der Art des Fotolacks (positiv oder negativ) , wird die endgültige Topographie des Master-Form diktieren. </li><li> Zur Herstellung der Master-Form beginnen, dehydrieren ein 4 &quot;Silizium-Wafer, indem Sie es auf einer Heizplatte auf 150 ° C für 15 min eingestellt. </li><li> Zentrieren des Wafers auf dem Vakuumspannfutter einer Schleuderbeschichtungsvorrichtung. Gießen SU8-2015 negativen Photoresist auf die Mitte des Wafers und weiterhin Gießen in konzentrischen Kreisen bis zu zwei Drittel des Wafers bedeckt. Hinweis: beim Gießen, um die Bildung von Blasen zu minimieren Halten Sie die Flasche SU8 Nähe des Wafers. </li><li> Programmieren Sie die Spincoaters wie folgt: <ul><li> Spread-Zyklus: 500 min bei einer Beschleunigung von 100 U / s für 10 Sekunden. </li><li> Schleudern: 4000 UpM mit einer Beschleunigung von 100 U / s für 30 Sekunden. </li></ul> Anmerkung: Diese Spincoating Rezept wird eine Photoresistschicht ist, die ~ 10 &amp;mgr; m Dicke zu bilden. Durch Änderung der Spinngeschwindigkeit oder der SU8-Formulierung kann die Dicke eingestellt werden. </li><li> Weiche backen den Wafer, indem Sie es auf einer Heizplatte auf 95 ° C für 3 min eingestellt. </li><li> Setzen Sie die Scheibe mit UV-Licht durchdie Fotomaske für eine Gesamtdosis von 140 mJ / cm 2. Hinweis: SU8 ist ein Negativlack also Regionen, in denen UV-Licht ist in der Lage, durch die Photomaske übergeben wird nach der Entwicklung bleiben und hob Features auf der Master-Form. </li><li> Nach der Belichtung des Wafers, indem Sie es auf einer Heizplatte auf 95 ° C für 4 min eingestellt. </li><li> Entwickeln Sie die Wafer, indem es in SU8 Entwickler für 3 min. Nach 3 min, spülen Sie die Scheibe mit Isopropyl-Alkohol. Wenn ein weißer Film wird während des Spülvorgangs erzeugt wird, wird der Wafer nicht vollständig entwickelt und es sollte wieder in den Entwickler für weitere 30 Sekunden gesetzt werden. Spülen wieder mit Isopropyl-Alkohol. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis ein weißer Film nicht während der Isopropylalkohol gespült bilden. </li><li> Trocknen der Wafer in einem Stickstoffstrom und in eine 150 mm Petrischale vor Staub zu schützen. </li></ol> 2. Herstellen der PDMS-Stempel <ol><li> Bereiten Sie die PDMS-Präpolymer durch die Kombination der Elastomer Basis und Härter in einem10.01 w / w-Verhältnis. Typischerweise 80 g Base und 8 g Härter verwendet werden, um sicherzustellen, dass es ausreichend ist, um das PDMS-Vorlagenform in einer 1 cm dicken Schicht bedecken. </li><li> Mix und entgast die PDMS mit einer zentripetalen Mischpult an den folgenden Einstellungen: <ul><li> Mix: 2.000 rpm für 2 min </li><li> Degas: 2.000 rpm für 2 min. </li></ul></li><li> Wenn ein Mischer ist nicht verfügbar, die PDMS-mischen von Hand für 10 min mit einer 10 ml serologische Pipette. Entgasen der Mischung, indem sie in einem Vakuum-Exsikkator für 30 Minuten, um Blasen zu entfernen. </li><li> Gießen Sie genug PDMS Prepolymer die Master-Form (gemusterten Silizium-Wafer), eine 1 cm dicke Schicht zu bilden. Härten des PDMS durch Backen bei 65 ° C für 4 Stunden oder bei Raumtemperatur für 48 Stunden. </li><li> Einmal ausgehärtet, können die Regionen, die die Muster ausgeschnitten werden, um die PDMS-Stempel zu bilden. Um die Funktion zu Seite, von der Rückseite der PDMS-Stempel unterscheiden, schneiden eine Kerbe von einer der Ecken auf der Rückseite der Briefmarke. </li></ol> 3. Mikrokontakt-PrInting von ECM-Patterns <ol><li> Rein 25 mm Durchmesser Glasdeckgläser durch Beschallung in 95% Ethanol für 1 Stunde und dann in einem 65 ° C Ofen trocknen. </li><li> Vorbereitung der PIPAAm durch Auflösen PIPAAm in 1-Butanol bei einer Konzentration von 10% (w / v, typischerweise 1 g in 10 ml). </li><li> Mitte ein Deckglas auf der Vakuumspannvorrichtung und der Spincoater Pipette 200 ul der Lösung PIPAAm so dass die gesamte Glasoberfläche bedeckt. </li><li> Schleuderbeschichtung des Deckglases bei 6.000 rpm für 1 min. </li><li> Reinigen Sie die PDMS-Stempel durch Beschallung in 50% Ethanol für 30 min und dann unter einem Stickstoffstrom trocken. Hinweis: Die Trocknung und die nachfolgenden Schritte sollten in einem biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt werden, um die Sterilität für Anwendungen, bei denen die ECM-Nanostrukturen wird mit Zellen verwendet werden, beizubehalten. </li><li> Beschichten der strukturierten Oberfläche jeder PDMS-Stempel mit 200 &amp;mgr; l der Proteinlösung, typischerweise 50 ug / ml in sterilem destilliertem Wasser für FN. Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur. Hinweis: ThBeschichtungsvolumen ist für eine 1,5 cm 2 PDMS-Stempel und müssen je nach Größe der PDMS-Stempel, der verwendet ECM-Protein, und die Konzentration des ECM-Protein in Lösung eingestellt werden. </li><li> Waschen Sie die PDMS-Stempel in destilliertem Wasser, um überschüssiges Protein und gründlich trocknen unter einem Stickstoffstrom entfernen. Hinweis: Jeder Wasser gelassen auf der Briefmarke wird die vorzeitige Auflösung des PIPAAm Beschichtung auf dem Deckglas auslösen und richtige Proteintransfer zu verhindern. </li><li> Für sterile Herstellung, legen Sie die PIPAAm-beschichtete Deckgläser in einer geschlossenen Petrischale und sterilisieren mit UV-Exposition, 45 min unter der UV-Licht in einem biologischen Sicherheitsschrank ist ausreichend. Dieser Schritt kann die Sterilität nicht erforderlich weggelassen. </li><li> Führen Mikrokontaktdruck, indem Sie die Funktion Seite der PDMS-Stempel in Kontakt mit der PIPAAm-beschichtete Deckglas. Wenn erforderlich, Pinzette leicht auf der Rückseite der Briefmarken tippen, um Luftblasen zu entfernen und sicherzustellen, gleichmäßigen Kontakt. </li><li> Nach 5 kmn, ziehen Sie die PDMS-Stempel aus dem Deckglas. </li><li> Auf dieser Stufe können weitere ECM-Proteine ​​strukturiert werden, um komplexere und Mehrkomponentenstrukturen. Bis zu 3 Drucke überprüft wurden, um mit diesem Prozess zu arbeiten, und mehr machbar sein. </li></ol> 4. Mitteilung von ECM-Nanofasern und Nanostrukturen <ol><li> Legen Sie die gemusterten PIPAAm beschichtete Deckgläschen in einer 35 mm Petrischale und untersuchen das Muster Treue mit Phasenkontrastmikroskopie. Je nach dem Muster, kann eine CCD-Kamera erforderlich sein, die Merkmale des Musters aufzulösen. Fluoreszenzmikroskopie können auch verwendet werden, um die, sofern die ECM-Proteine ​​fluoreszierend markiert Muster zu inspizieren. </li><li> 3 ml 40 ° C destilliertem Wasser auf die Petrischale und lassen Sie das Wasser nach und cool. </li><li> Die Auflösung des PIPAAm Schicht und die Freisetzung der ECM Proteinmuster kann unter Verwendung von Phasenkontrastmikroskopie überwacht werden. Wenn die Anwendung die Verwendung von optischen tec nicht zulassenhniques kann die Freisetzung durch Messung der Lösungstemperatur überwacht werden. Typischerweise wird das Wasser auf Raumtemperatur und unterhalb der LCST PIPAAm (32 ° C) abgekühlt, um sicherzustellen, dass die ECM-Protein-Nanostrukturen sind bekannt. </li><li> Nach der Freigabe werden die Nanofasern, nanofabrics und anderen Nanostrukturen in Wasser schwimmen. Um sie zu verwenden für weitere Anwendungen, die sie benötigen, um manipuliert werden. Die genaue Vorgehensweise wird auf dem Versuchsziel ab und kann Schritte wie Immobilisierung auf eine andere Oberfläche, bewegt sich mit einem Mikromanipulator-System oder die Einbettung in einem Hydrogel gehören. </li></ol>

<ol>
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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die hier vorgestellten Methode SIA imitiert Zell-vermittelte Matrixaufbau und ermöglicht die Konstruktion von ECM-Protein-Nanofasern und Nanostrukturen mit einstellbaren Größe, Organisation und Zusammensetzung. Zwar nicht identisch mit Zell-ECM erzeugt, schafft SIA ECM nanoskaliger Protein Fibrillen 20, die reversible Faltung unterziehen / Entfaltung bei der mechanischen Belastung 21 und 20 Zellen binden zusammen. Dies bietet eine einzigartige Fähigkeit, ECM-Protein-Materialien, die ...

Die extrazelluläre Matrix (ECM) in Geweben aus multifunktionellen Proteine ​​in physikalischen und chemischen Regulation mehrerer Zellprozesse einschließlich Adhäsion, Proliferation, Differenzierung und Apoptose beteiligt 1-3 besteht. Das ECM synthetisiert, zusammengebaut und von Zellen organisiert und die Proteinbestand Fibrillen haben einzigartige Zusammensetzungen, Fasergröße, Geometrien und Architekturen, die mit miteinander verbundenen Gewebetyps und des Entwicklungsstadiums variieren. Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass die ECM lehr Hinweise liefern, um Zellen zu Geweben entwickelt 4 zu bilden, was darauf hindeutet, dass die ECM rekapituliert in Bezug auf die Zusammensetzung und Struktur könnte die Entwicklung biomimetischer Materialien für Tissue Engineering und Biotechnologie-Anwendungen ermöglichen zu führen. Eine Anzahl von Herstellungsverfahren entwickelt worden, um polymere Gerüste, die Aspekte der ECM in Gewebe nachahmen kann Ingenieur. Zum Beispiel Elektrospinning-und Phasen separation haben sowohl die Fähigkeit gezeigt porösen Matrices aus Fasern mit einem Durchmesser von zehn Mikrometern bis einigen zehn Nanometern 5-7 bilden. Beide Techniken haben auch gezeigt, daß hochporöse Matrizen von Nanofasern Zelladhäsion und Infiltration in das Gerüst 8 unterstützt. Jedoch sind diese Ansätze in den Fasergeometrien möglich, Orientierungen und 3D-Architekturen, die erzeugt werden kann begrenzt. Das Elektro erzeugt typischerweise Gerüste entweder mit zufällig orientierten oder stark ausgerichteten Fasern wohinPhasenTrennung erzeugt Gerüste mit zufällig orientierten Fasern. Es gibt auch Einschränkungen hinsichtlich der Materialien, mit Forschern typischerweise unter Verwendung von synthetischen Polymeren, wie Poly (ε-caprolacton) 8 und Poly (milch-co-glykolsäure) 9, die nachfolgend mit ECM-Proteinen beschichtet sind, um die Zelladhäsion zu fördern. Natürliche Biopolymere werden ebenfalls verwendet, einschließlich Kollagen Typ I 10, 11 Gelatine, Fibrinogen 12,Chitosan 13, 14 und Seide, aber nur einen kleinen Teil der Proteine ​​in nativem Gewebe gefunden. Die meisten Gewebe enthalten eine größere Milieu von ECM-Proteinen und Polysacchariden, einschließlich Fibronectin (FN), Laminin (LN), Kollagen Typ IV und Hyaluronsäure, die schwierig oder unmöglich zu Nanofasern unter Verwendung von existierenden Verfahren herzustellen sind. Um dieser Herausforderung zu begegnen, haben wir unsere Forschung auf die Art und Weise imitiert Zellen synthetisieren, montieren und organisieren ECM-Protein Fibrillen in ihrer Umgebung konzentriert. Während die spezifische Fibrillogenese Verfahren variiert für verschiedene ECM-Proteine, typischerweise eine Konformationsänderung im ECM-Protein-Moleküls wird durch eine enzymatische oder Rezeptor-vermittelte Wechselwirkung, die kryptische Selbstmontagestellen macht ausgelöst. Hier verwenden wir FN als Modellsystem, um die Fibrillogenese Prozess besser zu verstehen. Kurz gesagt, FN Homodimere an Integrin-Rezeptoren auf der Zelloberfläche über die RGD-Aminosäuresequenz in der 10. Typ II bindenIch wiederhole Einheit. Einmal gebunden, bewegen sich die Integrine auseinander Actomyosin über Kontraktion und entfalten die FN-Dimere kryptische Selbstmontagestellen freizulegen. Die Exposition dieser FN-FN-Bindungsstellen ermöglicht es den FN-Dimere nach rechts auf der Zelloberfläche 15 in eine unlösliche Fibrillen zusammenzubauen. Work in zellfreien Systemen hat gezeigt, dass kryptische FN-FN-Bindungsstellen durch Entfaltung mit Vergällungsmittel 16 oder Oberflächenspannung bei einem Luft-Flüssigkeit-Feststoff-Schnittstelle 17-19 offenbart werden. Jedoch werden die FN-Fasern, die durch diese Techniken auf bestimmte Faser Größen und Geometrien beschränkt und sind typischerweise an eine Oberfläche gebunden. Hier beschreiben wir einen Ansatz bezeichnet oberflächeninitiierte Montage (SIA) 20, die diese Einschränkungen überwindet durch die Verwendung von Protein-Oberflächen-Wechselwirkungen zu freistehenden unlöslichen Nanofasern, nanofabrics (2D-Pläne) und anderen Nanostrukturen von einzelnen oder mehreren ECM-Proteinen (Abbildung 1 erstellen ). In diesem process, werden ECM-Proteine ​​aus einem kompakten, kugelförmigen Konformation in Lösung adsorbiert und teilweise denaturiert (ungefaltet) auf einem gemusterten hydrophoben Polydimethylsiloxan (PDMS)-Stempel. Die ECM-Proteine ​​werden dann in diesem Zustand auf einen thermisch ansprechenden Poly (N-isopropylacrylamid) (PIPAAm) Oberfläche durch Mikrokontaktdruck 22 übertragen. Wenn es mit 40 ° C Wasser hydratisiert die PIPAAm bleibt eine feste, aber wenn bis 32 ° C abgekühlt, es durch eine untere kritische Lösungstemperatur (LCST), wo sie hydrophil wird spielt quillt mit Wasser und dann löst sich, die Freigabe der ECM-Nanostrukturen zusammengesetzt aus der die Oberfläche. Die SIA-Methode ermöglicht die Kontrolle über die Dimensionen mit Nanometer-Präzision. Durch die Steuerung Schlüsselparameter wie Zusammensetzung, Fasergeometrie und Architektur ist es möglich, viele Eigenschaften der ECM in vivo gefunden zu rekapitulieren und zu fortgeschrittenen Gerüste für Tissue Engineering und Biotechnologie-Anwendungen zu entwickeln.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="651">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm</td>
			<td style="width:145px;">Polysciences</td>
			<td style="width:123px;">21458-10</td>
			<td style="width:167px;">40,000 Mw</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Sylgard 184 Silicone kit (PDMS)</td>
			<td style="width:145px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;">Mix 10 parts base with 1 part curing agent.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Butanol</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:145px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:123px;">354008</td>
			<td style="width:167px;">Human, 1mg</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Laminin</td>
			<td style="width:145px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:123px;">354239</td>
			<td style="width:167px;">Ultrapure, mouse, 1mg</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Negative Photoresist</td>
			<td style="width:145px;">Microchem</td>
			<td style="width:123px;">SU8-2015</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">SU8 Developer</td>
			<td style="width:145px;">Microchem</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:216px;">Sonicator Branson M3510</td>
			<td style="width:145px;">Branson Ultrasonic Corporation</td>
			<td style="width:123px;">CPN-952-318</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:216px;">Thinky ARE-250 Mixer</td>
			<td style="width:145px;">Thinky Corporation</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Spincoater</td>
			<td style="width:145px;">Specialty Coating Systems</td>
			<td style="width:123px;">G3P-8</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Glass cover 25mm diameter, No 1.5</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">12-545-86</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ecm protein nanofibers and nanostructures engineered using surface-initiated assembly

Die extrazelluläre Matrix (ECM) in Geweben synthetisiert und von Zellen zusammengesetzt, um ein 3D fibrilläre Proteinnetzwerk mit streng reguliert Faserdurchmesser, Zusammensetzung und Organisation bilden. Neben der Bereitstellung von Strukturförderung, die physikalischen und chemischen Eigenschaften der ECM spielen eine wichtige Rolle in mehrere zelluläre Prozesse einschließlich Adhäsion, Differenzierung und Apoptose. In vivo wird die ECM indem kryptischen Selbstmontage (Fibrillogenese) Websites innerhalb von Proteinen zusammengebaut . Dieses Verfahren unterscheidet sich für verschiedene Proteine, sondern Fibronectin (FN) Fibrillogenese ist gut charakterisiert und dient als Modellsystem für die zellvermittelte ECM Anordnung. Genauer gesagt, Zellen zu verwenden, Integrin-Rezeptoren auf der Zellmembran FN Dimere und Aktomyosin generierten Kontraktionskräfte zu binden, um Bindungsstellen für den Zusammenbau zu entfalten und unlöslichen Fasern freizulegen. Dieser Rezeptor-vermittelte Verfahren ermöglicht Zellen aus der Zellgewebe sca versammeln und organisieren die ECMles. Hier präsentieren wir eine Methode bezeichnet oberflächeninitiierte Montage (SIA), die Zell-vermittelte Matrixanordnung rekapituliert Verwendung von Protein-Oberflächen-Wechselwirkungen zu ECM-Proteine ​​entfalten und montieren sie in unlösliche Fasern. Zunächst werden ECM-Proteine ​​auf eine hydrophobe Polydimethylsiloxan (PDMS) Oberfläche, wo sie teilweise zu denaturieren (breiten) und setzen kryptische Bindungsdomänen adsorbiert. Die entfalteten Proteine ​​werden dann in wohldefinierten Mikro-und Nanostrukturen durch Mikrokontaktdruck auf eine thermisch ansprechende Poly (N-isopropylacrylamid) (PIPAAm) Oberfläche übertragen. Thermisch ausgelöste Auflösung des PIPAAm führt zur Endmontage und Freisetzung von ECM-Protein unlöslich Nanofasern oder Nanostrukturen mit definierter Geometrie. Complex-Architekturen sind durch Ingenieur definierten Muster auf den PDMS-Stempel für Mikrokontakt-Drucken verwendet werden kann. Neben FN kann die SIA-Prozess mit Laminin, Fibrinogen verwendet werden und Kollagene vom Typ I und IV der Mehrkomponenten-Nano ECM erstellenturen. Somit SIA kann zur ECM-Materialien auf Proteinbasis mit genauer Kontrolle der Proteinzusammensetzung, Fasergeometrie und Gerüst-Architektur, um die Struktur und Zusammensetzung der ECM in vivo gentechnisch zu rekapitulieren.

SIA ist in der Lage Engineering ECM-Protein-Nanofasern mit präziser Kontrolle über die Faserabmessungen. Um dies zu demonstrieren, wurden Anordnungen von FN-Nanofasern mit ebenen Abmessungen von 50 x 20 um auf eine PIPAAm beschichteten Deckglas (2A) strukturiert. Nach Freigabe, beauftragte die Fasern, weil sie unter einer inhärenten Vorspannung, wenn auf der Oberfläche PIPAAm (2B) strukturiert. Die Analyse der FN-Nanofasern ergab, waren sie monodisperse Pre-Release mit einer durchsc...

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ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly

Eine Methode, um komplexe Nanofasern und Nanostrukturen aus einzelnen oder mehreren extrazellulären Matrixproteinen zu erhalten, wird beschrieben. Diese Methode verwendet Protein-Oberflächen-Wechselwirkungen zu frei stehenden Materialien auf Proteinbasis mit abstimmbaren Zusammensetzung und Architektur für den Einsatz in einer Vielzahl von Gewebe-und Biotechnologie-Anwendungen zu erstellen.

ECM-Protein-Nanofasern und Nanostrukturen Engineered Mit Oberflächen initiierte Versammlung

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.4K Aufrufe.  Carnegie Mellon University.  Eine Methode, um komplexe Nanofasern und Nanostrukturen aus einzelnen oder mehreren extrazellulären Matrixproteinen zu erhalten, wird beschrieben. Diese Methode verwendet Protein-Oberflächen-Wechselwirkungen zu frei stehenden Materialien auf Proteinbasis mit abstimmbaren Zusammensetzung und Architektur für den Einsatz in einer Vielzahl von Gewebe-und Biotechnologie-Anwendungen zu erstellen. 

Serie: ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

Visualisierung von rekombinanten DNA-und Protein-Komplexe mit Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Forschung

Biotechnik

Utilization of Plasmonic and Photonic Crystal Nanostructures for Enhanced Micro- and Nanoparticle Manipulation

A method to manipulate the position and orientation of submicron particles nondestructively would be an incredibly useful tool for basic biological research. Perhaps the most widely used physical force to achieve noninvasive manipulation of small particles has been dielectrophoresis(DEP).1 However, DEP on its own lacks the versatility and precision that are desired when manipulating cells since it is traditionally done with stationary electrodes. Optical tweezers, which utilize a three dimensional electromagnetic field gradient to exert forces on small particles, achieve this desired versatility and precision.2 However, a major drawback of this approach is the high radiation intensity required to achieve the necessary force to trap a particle which can damage biological samples.3 A solution that allows trapping and sorting with lower optical intensities are optoelectronic tweezers (OET) but OET's have limitations with fine manipulation of small particles; being DEP-based technology also puts constraint on the property of the solution.4,5
This video article will describe two methods that decrease the intensity of the radiation needed for optical manipulation of living cells and also describe a method for orientation control. The first method is plasmonic tweezers which use a random gold nanoparticle (AuNP) array as a substrate for the sample as shown in Figure 1. The AuNP array converts the incident photons into localized surface plasmons (LSP) which consist of resonant dipole moments that radiate and generate a patterned radiation field with a large gradient in the cell solution. Initial work on surface plasmon enhanced trapping by Righini et al and our own modeling have shown the fields generated by the plasmonic substrate reduce the initial intensity required by enhancing the gradient field that traps the particle.6,7,8 The plasmonic approach allows for fine orientation control of ellipsoidal particles and cells with low optical intensities because of more efficient optical energy conversion into mechanical energy and a dipole-dependent radiation field. These fields are shown in figure 2 and the low trapping intensities are detailed in figures 4 and 5. The main problems with plasmonic tweezers are that the LSP's generate a considerable amount of heat and the trapping is only two dimensional. This heat generates convective flows and thermophoresis which can be powerful enough to expel submicron particles from the trap.9,10 The second approach that we will describe is utilizing periodic dielectric nanostructures to scatter incident light very efficiently into diffraction modes, as shown in figure 6.11 Ideally, one would make this structure out of a dielectric material to avoid the same heating problems experienced with the plasmonic tweezers but in our approach an aluminum-coated diffraction grating is used as a one-dimensional periodic dielectric nanostructure. Although it is not a semiconductor, it did not experience significant heating and effectively trapped small particles with low trapping intensities, as shown in figure 7. Alignment of particles with the grating substrate conceptually validates the proposition that a 2-D photonic crystal could allow precise rotation of non-spherical micron sized particles.10 The efficiencies of these optical traps are increased due to the enhanced fields produced by the nanostructures described in this paper.

Plasmonic tweezers and photonic crystal nanostructures are shown to produce useful enhancements in the efficiency and orientation control of optically trapping micro- and nano-particles.

Nutzung von Plasmonic und Photonic Crystal Nanostrukturen für verbesserte Mikro-und Nanopartikel-Manipulation

A method to manipulate the position and orientation of submicron particles nondestructively would be an incredibly useful tool for basic biological ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently incorporated into film assemblies that serve as adsorption platforms for protein monolayer electrochemistry (PME). PME is utilized as the model system for studying electrochemical properties of redox proteins by confining them to an adsorption platform at a modified electrode, which also serves as a redox partner for electron transfer (ET) reactions. Studies have shown that gold nanoparticle film assemblies of this nature provide for a more homogeneous protein adsorption environment and promote ET without distance dependence compared to the more traditional systems modified with alkanethiol self-assembled monolayers (SAM).1-3 In this paper, MPCs functionalized with hexanethiolate ligands are synthesized using a modified Brust reaction4 and characterized with ultraviolet visible (UV-Vis) spectroscopy, transmission electron microscopy (TEM), and proton (1H) nuclear magnetic resonance (NMR). MPC films are assembled on SAM modified gold electrode interfaces by using a "dip cycle" method of alternating MPC layers and dithiol linking molecules. Film growth at gold electrode is tracked electrochemically by measuring changes to the double layer charging current of the system. Analogous films assembled on silane modified glass slides allow for optical monitoring of film growth and cross-sectional TEM analysis provides an estimated film thickness. During film assembly, manipulation of the MPC ligand protection as well as the interparticle linkage mechanism allow for networked films, that are readily adaptable, to interface with redox protein having different adsorption mechanism. For example, Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) can be adsorbed hydrophobically to dithiol-linked films of hexanethiolate MPCs and cytochrome c (cyt c) can be immobilized electrostatically at a carboxylic acid modified MPC interfacial layer. In this report, we focus on the film protocol for the AZ system exclusively. Investigations involving the adsorption of proteins on MPC modified synthetic platforms could further the understanding of interactions between biomolecules and man-made materials, and consequently aid the development of biosensor schemes, ET modeling systems, and synthetic biocompatible materials.5-8

Alkanethiolate stabilized gold colloids known as monolayer protected clusters (MPCs) are synthesized, characterized, and assembled into thin films as an adsorption interface for protein monolayer electrochemistry of simple redox protein like Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) and cytochrome c (cyt c).

Synthesis, Assembly und Charakterisierung von Monolayer Protected Gold-Nanopartikeln Films für die Protein-Monoschicht Elektrochemie

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen supply to the cell microenvironment, as passive diffusion is limited to a very thin layer. Although various materials have been described to restore the integrity of full-thickness defects of the abdominal wall, no material has yet proved to be optimal, due to low graft vascularization, tissue rejection, infection, or inadequate mechanical properties. This protocol describes a means of engineering a fully vascularized flap, with a thickness relevant for muscle tissue reconstruction. Cell-embedded poly L-lactic acid/poly lactic-co-glycolic acid constructs are implanted around the mouse femoral artery and vein and maintained in vivo for a period of one or two weeks. The vascularized graft is then transferred as a flap towards a full thickness defect made in the abdomen. This technique replaces the need for autologous tissue sacrifications and may enable the use of in vitro engineered vascularized flaps in many surgical applications.

To date, thick tissue defects are typically reconstructed by applying autologous tissue flaps or engineered tissues. In this protocol, we present a new method for engineering vascularized tissue flap bearing an autologous pedicle, to serve as a substitute to autologous flaps.

Engineered Vaskularisierte Muskellappen

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Mikrostrukturierung und Montage von 3D-Micro-Ader

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, engineered grafts offer great potential for patient treatment. However, engineered vascular grafts are generally not easily scalable, requiring manufacture of custom molds or polymer tubes in order to customize to different sizes, constituting a time-consuming and costly practice. Human arteries range in lumen diameter from about 2.0-38 mm and in wall thickness from about 0.5-2.5 mm. We have created a method, termed the "Ring Stacking Method," in which variable size rings of tissue of the desired cell type, demonstrated here with vascular smooth muscle cells (SMCs), can be created using guides of center posts to control lumen diameter and outer shells to dictate vessel wall thickness. These tissue rings are then stacked to create a tubular construct, mimicking the natural form of a blood vessel. The vessel length can be tailored by simply stacking the number of rings required to constitute the length needed. With our technique, tissues of tubular forms, similar to a blood vessel, can be readily manufactured in a variety of dimensions and lengths to meet the needs of the clinic and patient.

Scalable engineered blood vessels would improve clinical applicability. Using easily sizable 3D-printed guides, rings of vascular smooth muscle were created and stacked into a tubular form, forming a vascular graft. Grafts can be sized to meet the range of human coronary artery dimensions by simply changing the 3D-printed guide size.

Die Skalierung von Engineered Gefäßprothesen Mit 3D-gedruckte Führer und den Ring Stapelverfahren

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease modeling. Self-assembled tissues offer advantages over scaffold-based tissue engineering, such as enhanced matrix deposition, strength, and function. However, there are few available methods for fabricating 3D tissues without seeding cells on or within a supporting scaffold. Previously, we developed a system for fabricating self-assembled tissue rings by seeding cells into non-adhesive agarose wells. A polydimethylsiloxane (PDMS) negative was first cast in a machined polycarbonate mold, and then agarose was gelled in the PDMS negative to create ring-shaped cell seeding wells. However, the versatility of this approach was limited by the resolution of the tools available for machining the polycarbonate mold. Here, we demonstrate that 3D-printed plastic can be used as an alternative to machined polycarbonate for fabricating PDMS negatives. The 3D-printed mold and revised mold design is simpler to use, inexpensive to produce, and requires significantly less agarose and PDMS per cell seeding well. We have demonstrated that the resulting agarose wells can be used to create self-assembled tissue rings with customized diameters from a variety of different cell types. Rings can then be used for mechanical, functional, and histological analysis, or for fabricating larger and more complex tubular tissues.

This protocol describes a platform for fabricating self-assembled tissue rings in variable sizes using a customized 3D-printed plastic mold. PDMS negatives are cured in the 3D-printed mold; then agarose is cast in the cured PDMS negatives. Cells are seeded into the resulting agarose wells where they aggregate into tissue rings.

Herstellung von benutzerdefinierten Agarose Brunnen für die Aussaat von Zelle und Gewebe Ring Selbstmontage mit 3D-Druck Formen

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial bypass. Characterization of the growth dynamics and remodeling process of degradable polymer scaffold-based tissue-engineered blood vessels (TEBVs) with pulsatile stimulation is crucial for vascular tissue engineering. Optical imaging techniques stand out as powerful tools for monitoring vascularization of engineered tissue enabling high-resolution imaging in real-time culture. This paper demonstrates a nondestructive and fast real-time imaging strategy to monitor the growth and remodeling of TEBVs in long-term culture by using optical coherence tomography (OCT). Geometric morphology is evaluated, including vascular remodeling process, wall thickness, and comparison of TEBV thickness in different culture time points and presence of pulsatile stimulation. Finally, OCT provides practical possibilities for real-time observation of the degradation of polymer in the reconstructing tissues under pulsatile stimulation or not and in each vessel segment, by compared with the assessment of polymer degradation using scanning electron microscopic(SEM) and polarized microscope.

A step by step protocol for nondestructive and long-period monitoring the process of vascular remodeling and scaffold degradation in real-time culture of biodegradable polymeric scaffold-based tissue-engineered blood vessels with pulsatile stimulation using optical coherence tomography is described here.

Zerstörungsfreie Überwachung der abbaubaren Gerüst-basierten Tissue-Engineering Blutgefäß Entwicklung mit optischen Kohärenztomographie

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial ...

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant technique with nutritional support. Recently, there have been many attempts at esophageal tissue engineering, but the success rate has been limited due to difficulty in early epithelization in the special environment of peristalsis. Here, we developed an artificial esophagus that can improve the regeneration of the esophageal mucosa and muscle layers through a two-layered tubular scaffold, a mesenchymal stem cell-based bioreactor system, and a bypass feeding technique with modified gastrostomy. The scaffold is made of polyurethane (PU) nanofibers in a cylindrical shape with a three-dimensional (3D) printed polycaprolactone strand wrapped around the outer wall. Prior to transplantation, human-derived mesenchymal stem cells were seeded into the lumen of the scaffold, and bioreactor cultivation was performed to enhance cellular reactivity. We improved the graft survival rate by applying surgical anastomosis and covering the implanted prosthesis with a thyroid gland flap, followed by temporary nonoral gastrostomy feeding. These grafts were able to recapitulate the findings of initial epithelialization and muscle regeneration around the implanted sites, as demonstrated by histological analysis. In addition, increased elastin fibers and neovascularization were observed in the periphery of the graft. Therefore, this model presents a potential new technique for circumferential esophageal reconstruction.

Esophageal reconstruction is a challenging procedure, and development of a tissue-engineered esophagus that enables regeneration of esophageal mucosa and muscle and that can be implanted as an artificial graft is necessary. Here, we present our protocol to generate an artificial esophagus, including scaffold manufacturing, bioreactor cultivation, and various surgical techniques.

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated media. In this article, we describe detailed protocols that enable the construction of nanofiber architectures in organic solvent mixtures through the self-assembly of uniquely addressable, single-stranded, gamma-modified peptide nucleic acid (&#947;PNA) tiles. Each single-stranded tile (SST) is a 12-base &#947;PNA oligomer composed of two concatenated modular domains of 6 bases each. Each domain can bind to a mutually complimentary domain present on neighboring strands using programmed complementarity to form nanofibers that can grow to microns in length. The SST motif is made of 9 total oligomers to enable the formation of 3-helix nanofibers. In contrast with analogous DNA nanostructures, which form diameter-monodisperse structures, these &#947;PNA systems form nanofibers that bundle along their widths during self-assembly in organic solvent mixtures. Self-assembly protocols described here therefore also include a conventional surfactant, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), to reduce bundling effects.

This article provides protocols for the design and self-assembly of nanostructures from gamma-modified peptide nucleic acid oligomers in organic solvent mixtures.

Selbstmontage von Gamma-modifizierten Peptid-Nukleinsäuren in komplexe Nanostrukturen in organischen Lösungsmittelmischungen

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...