Dieses neuartige Protokoll beschreibt die Verwendung mehrerer unterschiedlicher Sequenzen der synthetischen Nukleinsäure, die Gamma PNA imitiert, um Nanostrukturen in spezifischen organischen Lösungsmittelmischungen zu bilden. Die hier beschriebenen Assays zeigen die Notwendigkeit, bestehende Nukleinsäure-Nanotechnologieprotokolle an organische Lösungsmittel anzupassen, bei denen wenig bis gar keine Protokolle veröffentlicht wurden. Praktiker, die mit dieser Technik neue, könnten aufgrund der Neigung des Nanomaterials PNA, sich zu aggregieren, Schwierigkeiten haben, vorhandene Protokolle, die für wässrige Umgebungen entwickelt wurden, in organische lösungsmittelreiche Umgebungen anzupassen.
Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Gamma PNA-Bestände. Nach Erhalt von HPLC-gereinigten Gamma-PNA-Strängen von einem kommerziellen Hersteller, setzen Sie jeden Strang in entionisiertem Wasser auf 300 mikromolare Konzentrationen aus. Bewahren Sie die Gamma-PNAs bei minus 20 Grad Celsius für bis zu mehrere Monate auf.
Wenn Sie bereit sind, selbst zu montieren, bereiten Sie Aneal-Chargenproben in 75%DMSO, 75%DMF und 40%1, 4-Dioxan vor. Bereiten Sie zunächst 20 mikromolare Substocks jedes Oligomers vor, indem Sie 0,67 Mikroliter aus dem Hauptbestand aliquotieren und entionisiertes Wasser für ein Endvolumen von 10 Mikrolitern hinzufügen. Fügen Sie einen Mikroliter von jedem Oligomer aus den 20 mikromolaren Substocks zu einem 200 Mikroliter PCR-Rohr hinzu, das für neun Oligomere ein Gesamtvolumen von neun Mikrolitern erreicht.
Fügen Sie 30 Mikroliter wasserfreies DMSO oder DMF mit einem zusätzlichen Mikroliter entionisiertem Wasser für ein Endvolumen von 40 Mikrolitern hinzu. Zur Zubereitung der 40%1, 4-Dioxan-Charge 16 Mikroliter 1, 4-Dioxan hinzufügen und das Volumen mit entionisiertem Wasser auf 40 Mikroliter bringen. Anneal die Proben für 22,5 Stunden in einem thermischen Cycler Kühlung von 90 bis 20 Grad Celsius.
Typischerweise liegen die Schmelztemperaturen für zwei Oligomer- und drei Oligomer-Gamma-PNA-Teilmengen im Bereich von 40 bis 70 Grad Celsius für unterschiedliche Lösungsmittelbedingungen. Programmieren Sie den thermischen Cycler nach Manuskriptanweisungen. Nach abschlussdem Glühen können proben12 bis 24 Stunden vor der Charakterisierung bei vier Grad Celsius gelagert werden.
Machen Sie eine Feuchtigkeitskammer aus einer leeren Pipettenspitzen-Box, indem Sie die Box mit etwa fünf Milliliter Wasser füllen. Bereiten Sie eine 20-fache Verdünnung von handelsüblichen 2%kollodium in Amylacetat mit Isoamylacetat-Lösungsmittel vor, um die Nitrocelluloselösung zu erzeugen. Verwenden Sie eine Pinzette, um einen Deckelschlupf in die Nitrozelluloselösung einzutauchen und ihn lufttrocknen zu lassen, und dann eine Durchflusskammer aus einem Mikroskopschlitten, zwei doppelseitigen Bandstreifen und dem nitrozellulosebeschichteten Deckelrutsch zu machen.
Bereiten Sie die Biotin-BSA-Lösung vor, indem Sie ein Milligramm Biotin BSA wiegen und in einem Milliliter PBS auflösen. 15 Mikroliter des Biotins BSA schräg in den Strömungskanal pfeifen und bei Raumtemperatur in der Befeuchtungskammer zwei bis vier Minuten inkubieren. 15 Mikroliter des Waschpuffers, der aus einem Milligramm BSA in einem Milliliter PBS besteht, in den Kanal blasen, um überschüssiges Biotin BSA wegzuwaschen, und dann die Oberfläche passivieren, indem sie den Durchflusskanal für zwei bis vier Minuten in der befeuchteten Kammer inkubieren.
Messen Sie 0,5 Milligramm Streptavidin und ein Milligramm BSA, dann lösen Sie beide in einem Milliliter PBS. 15 Mikroliter der Streptavidin-Lösung in den Strömungskanal geben und zwei bis vier Minuten in die befeuchtete Kammer legen und den Kanal durch fließendes 15 Mikroliter Waschpuffer waschen. Als nächstes fließen 15 Mikroliter der geglühten Charge von Gamma-PNA-Oligomeren in die befeuchtete Kammer und waschen dann die ungebundenen Nanostrukturen, indem sie 15 Mikroliter eines Millimolaren Trolox in der gleichen Lösungsmittelzusammensetzung wie die Nanostrukturen fließen.
Übertragen Sie den Durchflusskanal auf den Diahalter und bebildern Sie ihn mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit TIRF-Bildgebung, einem 60-fachen Öl-Tauchobjektiv und einer 1,5-fachen Lupe ausgestattet ist. Scannen Sie den Durchflusskanal mit einer 60- oder 90-fachen Vergrößerung, während Sie den Cy3-Kanal überwachen. Bereiten Sie 20 und 6% SDS-Bestände nach Manuskriptanweisungen vor, dann die Gamma-PNA-Oligomere annealieren, indem Sie einem 200 Mikroliter-PCR-Röhrchen einen Mikroliter von jedem 20 Mikromolaren-Oligomer hinzufügen.
Fügen Sie 30 Mikroliter wasserfreies DMSO und einen Mikroliter 6% oder 20%SDS zu den PCR-Röhren für ein Endvolumen von 40 Mikrolitern hinzu, was zu einer endgültigen SDS-Konzentration von 5,25 bzw. 17,5 Millimolar führt. Anneal die Gamma-PNAs im Thermocycler wie zuvor beschrieben. Charakterisieren Sie Gamma-PNA-Nanostrukturen in Gegenwart von SDS mit dem TIRF- oder TEM-Protokoll.
Die TIRF-Bildgebung von Gamma-PNA-Oligomeren, die in 75% DMSO geglüht wurden, zeigte gut organisierte Architekturen, während das Glühen in 75%DMF zu spikulierenförmigen oder nadelartigen Nanostrukturen führte. Der Zustand von 40%1, 4-Dioxan erzeugte eine spärliche Dekoration von fadenförmigen Nanostrukturen. Darüber hinaus zeigten die Proben von Gamma-PNA-Nanoröhren, die in 75%DMSO gebildet wurden, die Bündelung von Nanofasern bei hoher Vergrößerung oder nanoskopischen Auflösungen während der TEM-Bildgebung.
Die quantitative Analyse der Breite der Nanostrukturen ergab eine mittlere Breite von 16,3 Nanometern mit Höchstwerten jenseits von 80 Nanometern. Isosequenzielle DNA-Oligomere, die zusammenhängende Gamma-PNAs ersetzten, bildeten gerade fadenförmige Strukturen, während der Ersatz von Crossover-Gamma-PNAs zu stellaten Strukturen führt. Die Nanostrukturen, die durch zusammenhängende DNA-Oligomere ersetzt wurden, hatten eine mittlere Breite von etwa 19 Nanometern.
Bei hohen SDS-Konzentrationen nehmen Gamma-PNA-Nanofasern auch hoch vernetzte Morphologien im Vergleich zu ihren kritischen Micelle-Konzentrationen an, wenn sie mit TIRF-Bildgebung betrachtet werden. DIE TEM-Bildgebung zeigt an, dass die Gamma-PNA-Baugruppe in 5,25 Millimolar-SDS die größten Reduktionen bei der strukturellen Bündelung aufwies. Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig, die Lösungsmittelzusammensetzungen, wie erwähnt, zu erhalten, da die Nanostrukturen zu einer Aggregation führen.
Diese Methoden ermutigen Praktiker, andere unerforschte Wege verschiedener Lösungsmittelzusammensetzungen, Tenside und anderer PNA-DNA-Nanostrukturen zu verfolgen.
