PLD hat den Canada Research Chair in Protein Engineering inne. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der Canadian Institutes of Health Research an die PLD finanziert. Diese Arbeit wurde auch durch ein Grant-in-Aid für wissenschaftliche Forschung von der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (Nr. 23310171) und von der Japan Bio-oriented Technology Research Advancement Institution (BRAIN) unterstützt. Wir danken Drs. Chris Marshall und Mike Kuiper für die Pionierarbeit, die zur FIPA geführt hat. Wir sind auch Dr. Sakae Tsuda für die Bereitstellung von Einrichtungen für einige dieser Arbeiten und Dr. Laurie Graham für den Aufbau der Fluoreszenzlicht-Erregungs- und Emissionsfilter dankbar.

1. Wachsende Einzelne Eiskristalle
<ol><li>Nehmen Sie eine saubere Metallwanne (15 cm Durchmesser, 4,5 cm Höhe), die in ein Ethylenglykol-Kühlbad passt und auf einem Schwimmen schwimmt.</li>
	<li>Polyvinylchlorid (PVC) zylindrische Formen vorbereiten, (4,5 cm Durchmesser, 3-4 cm hoch, 4 mm dick), durch Sägen von Profilen aus einem Rohr.<ol>
<li>Schneiden Sie eine Kerbe, (1 mm breit, 2 mm hoch) auf einer Seite (Abbildung 1A).</li>
		<li>Bereiten Sie so viele Formen vor, die bequem in die Pfanne passen (Abbildung 1B). Hinweis: Eine Studie zeigte, dass Polyvinylalkohol (PVA) die Eiskerne beeinflussen kann22. In unserem offenen Schimmel-PVC-System sind wir jedoch nicht auf Probleme der atypischen Eisbildung gestoßen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tragen Sie einen leichten Film aus Vakuumfett auf den unteren Oberflächenring jeder Form auf, d. h. auf die Oberfläche mit ausgeschnittener Kerbe. Verdichten Sie diese gefettete, eingekerbte Oberfläche auf eine Metallwanne mit den Kerben, die von der Mitte der Pfanne weg ausgerichtet sind. Achten Sie darauf, die Kerben nicht mit Fett zu füllen oder zu verschließen.</li>
	<li>Fügen Sie 0,22 m gefiltertes und entgastes/deionisiertes Wasser in die Mitte der Pfanne, aber außerhalb der Formen, und lassen Sie das Wasser langsam in die Formen durch die Kerben eindringen. Achten Sie darauf, keine Blasen einzuführen. Die Wasserschicht sollte ca. 5 mm tief sein.</li>
	<li>Die Pfanne in ein temperaturgeregeltes Ethylenglykolbad auf -0,5 °C abgekühlt. Die Pfanne sollte perfekt eben sein. Fügen Sie bei Bedarf Ballastgewichte an den Seiten der Pfanne hinzu.</li>
	<li>Nachdem die Pfanne und das Wasser -0,5 °C erreicht haben, fügen Sie ein kleines Stück Eis in die Mitte der Pfanne, außerhalb der Formen.<ol>
<li>Dadurch wird das Eiswachstum im unterkühlten Wasser über die Pfanne und in die Formen nukleiert. Die kleine Kerbe am Boden jeder Form lässt nur einen Eiskristall durch, was zu einem einzigen Eiskristall in jeder Form führt.</li>
		<li>Über Nacht bebrüten, um eine Eisschicht zu bilden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>In den nächsten drei Tagen 13 ml 4 °C entgastes/deionisiertes Wasser einmal täglich in jede Form geben und die Temperatur des Ethylenglykolbades nach jeder Zugabe von -0,8 °C am ersten Tag auf -1,1 °C am zweiten Tag und auf -1,5 °C am dritten Tag senken.<ol>
<li>Inkubieren Sie bei diesen Temperaturen über Nacht.</li>
		<li>Am vierten Tag sollten die Formen vollständig mit Eis gefüllt sein.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ziehen Sie die Formen aus der Pfanne, schieben Sie die Eiskristalle aus den Formen und lagern Sie auf einer sauberen Oberfläche, wie z. B. einem Wägeboot, in einem -20 °C Gefrierschrank für ca. 1 Stunde vor dem Handling.</li>
	<li>Anstatt viele kleine einzelne Eiskristalle vorzubereiten, kann ein großer Einzele-Eiskristall mit mehreren Litern Volumen in einem konstanten Temperatur-Inkubator hergestellt werden, wie von Knight23beschrieben. Der große Eiskristall kann ein Jahr oder mehr gelagert werden, wenn er in einem Gefrierschrank von -15 bis -20 °C aufbewahrt wird. Teile von Einzelkristall können mit einer Säge nach Bedarf aus dem Eisblock geschnitten werden.</li>
</ol>2. Bestimmung der Singularität und Orientierung des Eiskristalls
<ol><li>Stellen Sie fest, ob es sich bei dem aus der Form vertriebenen Eis um einen einzelnen Kristall handelt, indem Sie in einem Gefrierraum zwischen zwei gekreuzten Polaroiden (Abbildung 1D)beobachten.<ol>
<li>Wenn der Eiskristall einzeln ist, sollten keine Risse oder Diskontinuitäten gesehen werden, und die Lichtrichtung sollte sich innerhalb des Eiskristalls nicht ändern. Hinweis: Wenn kein Gefrierraum zur Verfügung steht, kann stattdessen ein Kühlraum in allen erforderlichen Schritten genutzt werden, wobei man vorsichtig ist, schnell zu arbeiten und das Eis sparsam zu handhaben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aufgrund der Eisbirefreringence kann man gleichzeitig die Ausrichtung der c-Achsebestimmen. Verwenden Sie die folgenden Informationen, um die Ausrichtung zu bestimmen:<ol>
<li>Wenn die c-Achsegenau parallel zum einfallenden Licht ist, wird theoretisch kein Licht durch die gekreuzten Polaroids passieren. Wenn das einfallende Licht leicht von parallel zur c-Achsebetitelt wird, wird ein gleichmäßiges mehrfarbiges Lichtspektrum durch den Kristall übertragen, wenn es zwischen den gekreuzten Polaroids gedreht wird. Diese gleichmäßige Transmission entsteht durch die optische Inaktivität von Eis Ih entlang seiner c-Achse24. Die Basalebene des Eiskristalls ist normal zur c-Achse.</li>
		<li>Wenn die c-Achseweiter vom parallelen zum einfallenden Licht entfernt ist und der Eiskristall zwischen den gekreuzten Polaroids gedreht wird, wechselt das übertragende Licht zwischen 0-100% Transmission mit jeder 90° Drehung des Kristalls.</li>
		<li>Am häufigsten ist die c-Achsenormal zur kreisförmigen Ebene des zylindrischen Eiskristalls.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bestimmen Sie die Ausrichtung der a-Achsendurch Eislochierung25, die geschieht, indem Sie den Eiskristall fest in Aluminiumfolie wickeln, ein kleines Loch mit einer Nadel durch die Folie in das Eis auf der Basalebene (normal zur c-Achse)stecken und ihn 20 min unter Vakuum stellen.<ol>
<li>Diese Behandlung erzeugt eine Ätze mit sechseckiger Symmetrie auf der Basalebene, wo die a-Achsendurch die Scheitelpunkte des sechsseitigen Sterns verlaufen (Abbildung 2A).</li>
		<li>Auf Wunsch kann der Eiskristall mit einer Säge entweder parallel oder senkrecht zu einer Seite des Sechsecks geschnitten werden, um ihn mit einer primären oder sekundären Prismaebene senkrecht zum kalten Finger zu montieren (Abbildung 3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Adsorption von fluoreszierend gekennzeichneten Frostschutzproteinen an einen einzigen Eiskristall
<ol><li>Montieren Sie einen einzelnen Eiskristall auf den kalten Finger (Abbildung 1C), indem Sie zuerst einen Hohlraum in die Oberseite des Kristalls bohren. Dazu wechseln Sie das Eis abwechselnd mit zwei Aluminiumstäben mit leicht unterschiedlichem Durchmesser, aber ähnlich dem Durchmesser des kalten Fingers, um den Hohlraum zu bilden, in den der kalte Finger passen kann.</li>
	<li>Kühlen Sie den kalten Finger auf -0,5 °C, legen Sie ihn in die Eishöhle und halten Sie den Eiskristall an Ort und Stelle, bis er auf das Metall gefriert (Abbildung 2B). Vermeiden Sie Luftblasen, wenn Sie den Kristall am Finger befestigen, da sie eine effiziente Wärmeübertragung vom Finger zum Stab behindern.</li>
	<li>Füllen Sie einen halbkugelförmigen Becher, der etwa doppelt so groß ist wie der Durchmesser des Eiskristalls, mit gefiltertem entionisiertem Wasser oder Puffer, gekühlt auf ca. 4 °C. Untertauchen Sie den kalten, fingergebundenen Eiskristall in die Tasse und entfernen Sie überschüssiges Wasser oder Puffer, so dass die Spitze des Eiskristalls ungefähr mit der flüssigkeitsschicht gleich ist und das Eis die Tassenwände nicht berührt.<ol>
<li>Bedecken Sie den Becher mit Isolierung und senken Sie die Temperatur auf -5 °C.</li>
		<li>Warten Sie etwa 1 Stunde, bis sich der Eiskristall zu einer Hemisphäre formt und überprüft seinen Status etwa alle 20 min (Abbildung 2C).</li>
		<li>Das Eis wird die Form des halbkugelförmigen Bechers annehmen, indem es den Eiskristall schmilzt und wächst, aber es sollte nie überwachsen, um die Tassenwände zu berühren. Es sollte mindestens 1 cm Abstand zwischen Wand und Hemisphäre vorhanden sein und der kalte Finger sollte nicht aus dem Eis herausragen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie die Tasse aus dem Eiskristall und fügen Sie die fluoreszierende Proteinlösung zu einem Endvolumen von 25-30 ml und der gewünschten Analysekonzentration hinzu, wobei Sie darauf achten, das gesamte Flüssigkeitsvolumen in der Tasse unverändert zu halten. Eine typische AFP-Konzentration beträgt 0,1 mg/ml.<ol>
<li>Den Eiskristall wieder in den Becher untertauchen, so dass die Spitze des Eiskristalls mit der Flüssigkeit auf dem Niveau ist und der Eiskristall die Tassenwände nicht berührt (Abbildung 2D).</li>
		<li>Lassen Sie die kalte Fingertemperatur auf -8 °C fallen und lassen Sie die Proteinlösung 2-3 Stunden lang in den Eiskristall einfrieren, wodurch die Lösung oft unter Rühren behandelt wird. Das aus der Proteinlösung gebildete Eis sollte mindestens 5 mm betragen, bevor das Eiswachstum gestoppt wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie den Eiskristall aus der Tasse, während Sie noch am kalten Finger befestigt sind. Lösen Sie das Eis von letzterem, indem Sie das Kühlmittel durch den kalten Finger auf knapp über 0 °C erwärmen und warten, bis der Eiskristall abschmilzt.</li>
	<li>Legen Sie den Kristall flach auf eine saubere Oberfläche, wie z. B. eine Wägeschale, achten Sie darauf, das neu formierte Eis nicht zu berühren und vor der Übergabe mindestens 20 min bei -20 °C aufzubewahren.</li>
</ol>4. Visualisierung von Frostschutzprotein-gebundenen Eisebenen
<ol><li>Die Visualisierung der Fluoreszenz erfolgt in einem abgedunkelten Gefrierschrank oder Kühlraum, indem der Eiskristall flach unter Lampen mit wellenlängenspezifischen Anregungsfiltern platziert wird, um das Fluoreszenzetikett und kameraemissionsfilter zu anregen, um jedes andere unspezifische Licht zu blockieren. Basierend auf dem Muster können die Eisebenen, die durch AFPs gebunden sind, geschätzt werden (Abbildung 4).</li>
	<li>Wenn Wellenlängenspezifische Leuchten nicht verfügbar sind, kann stattdessen ein UV-Lichtkasten verwendet werden.</li>
	<li>Herkömmliche Eisätze können auch einfach durchgeführt werden, indem die Eishalbkugel bei -20 °C für mindestens 3 Stunden sublimiert werden kann, danach kann Restproteinpulver auf der Eisoberfläche sichtbar werden (Abbildung 5).</li>
	<li>Schritt 2.3 kann wiederholt werden, um die Ausrichtung der a-Achsender fertigen Eishalbkugel zu bestimmen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+peptides+and+glycopeptides+in+cold-water+fishes.">Antifreeze peptides and glycopeptides in cold-water fishes.</a> Annu. Rev. Physiol. 45, 245-260 (1983).</li><li>Sidebottom, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytochemistry+-+heat-stable+antifreeze+protein+from+grass.">Phytochemistry - heat-stable antifreeze protein from grass.</a> Nature. 406 (6793), 256-256 (2000).</li><li>Tomczak, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+stabilization+of+membranes+at+low+temperatures+by+an+antifreeze+protein.">A mechanism for stabilization of membranes at low temperatures by an antifreeze protein.</a> Biophys. J. 82 (2), 874-881 (2002).</li><li>Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactive+Ca2+-dependent+antifreeze+protein+in+an+antarctic+bacterium.">Hyperactive Ca2+-dependent antifreeze protein in an antarctic bacterium.</a> FEMS Microbiol. Lett. 245 (1), 67-72 (2005).</li><li>Garnham, C. P., Campbell, R. L., Davies, P. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compound+ice-binding+site+of+an+antifreeze+protein+revealed+by+mutagenesis+and+fluorescent+tagging.">Compound ice-binding site of an antifreeze protein revealed by mutagenesis and fluorescent tagging.</a> Biochemistry. 49 (42), 9063-9071 (2010).</li><li>Nutt, D. R., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+function+of+the+hydration+layer+around+an+antifreeze+protein+revealed+by+atomistic+molecular+dynamics+simulations.">Dual function of the hydration layer around an antifreeze protein revealed by atomistic molecular dynamics simulations.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (39), 13066-13073 (2008).</li><li>Knight, C. A., Cheng, C. C., Devries, A. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-helix+structure+and+ice-binding+properties+of+a+hyperactive+antifreeze+protein+from+an+insect.">Beta-helix structure and ice-binding properties of a hyperactive antifreeze protein from an insect.</a> Nature. 406 (6793), 325-328 (2000).</li><li>Pertaya, N., Marshall, C. B., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+spruce+budworm+antifreeze+protein+interacting+with+ice+crystals:+Basal+plane+affinity+confers+hyperactivity.">Direct visualization of spruce budworm antifreeze protein interacting with ice crystals: Basal plane affinity confers hyperactivity.</a> Biophys. J. 95 (1), 333-341 (2008).</li><li>Middleton, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+protein+from+freeze-tolerant+grass+has+a+beta-roll+fold+with+an+irregularly+structured+ice-binding+site.">Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site.</a> J. Mol. Biol. 416 (5), 713-724 (2012).</li><li>Scotter, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basis+for+hyperactivity+of+antifreeze+proteins.">The basis for hyperactivity of antifreeze proteins.</a> Cryobiology. 53 (2), 229-239 (2006).</li><li>Knight, C. A., Wierzbicki, A., Laursen, R. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+superior+activity+of+the+large+isoform+of+snow+flea+antifreeze+protein.">Structural basis for the superior activity of the large isoform of snow flea antifreeze protein.</a> Biochemistry. 49 (11), 2593-2603 (2010).</li><li>Takamichi, M., Nishimiya, Y., Miura, A., Tsuda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+active+qae+isoform+confers+thermal+hysteresis+activity+on+a+defective+sp+isoform+of+type+iii+antifreeze+protein.">Fully active qae isoform confers thermal hysteresis activity on a defective sp isoform of type iii antifreeze protein.</a> FEBS J. 276 (5), 1471-1479 (2009).</li><li>Bar-Dolev, M., Celik, Y., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+ice+growth+and+melting+modifications+by+antifreeze+proteins.">New insights into ice growth and melting modifications by antifreeze proteins.</a> J. R. Soc. Interface. 9 (77), 3249-3259 (2012).</li><li>Celik, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+experiments+reveal+that+antifreeze+proteins+bound+to+ice+crystals+suffice+to+prevent+their+growth.">Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (4), 1309-1314 (2013).</li><li>Garnham, C. P., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+dimeric+beta-helical+model+of+an+ice+nucleation+protein+with+bridged+active+sites.">Novel dimeric beta-helical model of an ice nucleation protein with bridged active sites.</a> BMC Struct. Biol. 11, (2011).</li></ol>

Es wurden keine Interessenkonflikte angemeldet.

Entwicklung der Eisätzmethode durch Charles Knight zur Bestimmung von AFP-gebundenen Eisflugzeugen hat die Studien über den Mechanismus der Eisbindung durch AFPs weit fortgeschritten. Während Strukturen von AFPs durch Röntgenkristallographie26,27 gelöst werden konnten, gab es keine offensichtliche Methode, um die komplementäre Oberfläche auf Eis abzuleiten, an die sich die AFP gebunden hatte. Als Typ I AFP von Winterflunder zunächst charakterisiert wurde, wurde es angenommen, an die primären Prismaebe...

Die Produktion von Frostschutzproteinen (AFPs) ist ein wichtiger Überlebensmechanismus einiger Organismen, die in eisbeladenen Umgebungen leben. Bis vor kurzem dachte man, dass die einzige Funktion von AFPs darin bestand, das Wachstum von inneren Eiskristallen zu verhindern oder zu verlangsamen, die die Durchblutung blockieren, Gewebeschäden verursachen und osmotischen Stress verursachen würden. Organismen, die kein Einfrieren vertragen, wie Fische, drücken AFPs aus, um das Eiskristallwachstum vollständig zu hemmen1. Andere, wie Gras, sind frosttolerant und drücken AFPs aus, um die Eisrekristallisation zu hemmen, die die Bildung großer Eiskristalle in ihren Geweben reduziert2. Die Stabilisierung von Membranen bei niedriger Temperatur ist eine weitere Funktion, die für die AFPs vorgeschlagen wurde3. Kürzlich wurde eine neue Rolle für die AFP eines antarktischen Bakteriums, Marinomonas primoryensis, aus eisbedeckten Brackseenvorgeschlagen 4. Diese AFP ist Teil eines viel größeren Adhesin-Proteins5, von dem angenommen wird, dass es das Bakterium an Eis anheftet, um einen besseren Zugang zu Sauerstoff und Nährstoffen zu erhalten6. Andere Mikroben sind dafür bekannt, AFPs zu sezernieren, was die Struktur des Eises, in dem sie leben, verändern könnte7.
AfPs wurden in einigen Fischen, Insekten, Pflanzen, Algen, Bakterien, Diatomen und Pilzen gefunden. Sie haben bemerkenswert unterschiedliche Sequenzen und Strukturen, die mit ihrer Entwicklung von verschiedenen Vorläufern bei verschiedenen Gelegenheiten übereinstimmen; und doch binden sie alle an Eis und hemmen sein Wachstum durch den Adsorptionsinhibitionsmechanismus8. Die AFPs haben jeweils eine bestimmte Oberfläche, die als eisbindende Stelle (IBS) fungiert. Diese wurden typischerweise durch standortgesteuerte Mutagenese von Oberflächenrückständen9-11identifiziert. Die IBS wird vermutet, um Wassermoleküle in einem eisähnlichen Muster zu arrangieren, das bestimmten Eisebenen entspricht. So bildet die AFP ihren Liganden, bevor sie an sie bindet5, 12. Eisebenen können durch ihre Miller-Indizes definiert werden, und verschiedene AFPs können an verschiedene Ebenen binden. So bindet Typ I AFP von Winterflunder an die 20-21 Pyramidenebenen13, Typ III AFP bindet sowohl primäre Prisma als auch Pyramidenebenen mit einer zusammengesetzten Eisbindungsfläche11,14, während der Fichtenknospenwurm AFP, ein hyperaktiver AFP, gleichzeitig an die Primär- und Basalebene15,16bindet. Andere hyperaktive AFPs, wie MpAFP, binden an mehrere Eisebenen, wie ihre vollständige Abdeckung von einzelnen Eiskristallhemisphärenzeigt 5,17. Es wird vermutet, dass die Fähigkeit von hyperaktiven AFPs, die Basalebene zu binden, sowie andere Ebenen, für ihre 10-fache höhere Aktivität gegenüber mäßig aktiven AFPs18verantwortlich sein kann. Obwohl die Effizienz hyperaktiver AFPs gut dokumentiert ist, ist ihre Fähigkeit, sich an mehrere Eisebenen zu binden, immer noch nicht verstanden.
Die ursprüngliche Methode zur Bestimmung der AFP-gebundenen Eisflugzeuge wurde von Charles Knight13,19entwickelt. Bei dieser Methode wird ein makroskopischer Einzeleiskristall auf einen hohlen Metallstab (Kaltfinger) montiert und zu einer Hemisphäre geformt, indem er in einen halbkugelförmigen Becher mit entgastem Wasser getaucht wird. Dann wird die Hemisphäre in eine verdünnte Lösung von AFPs getaucht und eine Eisschicht wird von der AFP-Lösung auf die Eiskristall-Hemisphäre über mehrere Stunden angebaut, die durch die Temperatur des Ethylenglykols gesteuert wird, das durch den kalten Finger zirkuliert. Der Eiskristall wird aus der Lösung entfernt, vom kalten Finger gelöst und in einen Gefrierraum von -10 bis -15 °C gelegt. Die Oberfläche wird mit einer scharfen Klinge abgekratzt, um den gefrorenen Oberflächenfilm der Frostschutzproteinlösung zu entfernen, und der Eiskristall darf sich für mindestens 3 Stunden sublimieren. Nach der Sublimation können die eisebenen, die von AFPs gebunden sind, als weiß geätzte Muster gesehen werden, die aus Restproteinen abgeleitet sind. Die Eishalbkugel kann an ihrer c-Achseund a-Achsenausgerichtet werden, um die Basal- und Prismenebenen des Eises zu lokalisieren und die Miller-Indizes der geätzten Flecken zu bestimmen.
Hier beschreiben wir eine Modifikation der ursprünglichen Methode zur Bestimmung von AFP-gebundenen Eisebenen, eine Methode, die wir als fluoreszenzbasierte Eisebene Affinität (FIPA)11bezeichnen. Die AFPs sind fluoreszierend entweder mit einem chimären Etikett, wie grünem fluoreszierendem Protein (GFP)11,16,17,20, oder mit einem fluoreszierenden Farbstoff kovalent an die AFP5,21gebunden. Die fluoreszierend markierten AFPs werden auf einen einzigen Eiskristall adsorbiert und mit dem gleichen experimentellen Verfahren wie die ursprünglichen Eisätzexperimente überwuchert. Das Ausmaß der AFP-Bindung an die wachsende Eishalbkugel kann während des gesamten Experiments mit einer ultravioletten (UV) Lampe überwacht werden. Nach Abschluss des Experiments kann die Hemisphäre direkt vom kalten Finger abgenommen und ohne Sublimation abgebildet werden. Wenn gewünscht, kann die Hemisphäre jedoch sublimiert werden, um einen traditionellen Eisätz zu visualisieren. Änderungen, die an der FIPA-Methodik vorgenommen wurden, verkürzen das traditionelle Eisätzprotokoll um mehrere Stunden. Darüber hinaus besteht das Potenzial, mehrere AFPs mit jeweils einem anderen fluoreszierenden Etikett gleichzeitig zu bebildern, um die überlappenden Muster von AFP-gebundenen Eisebenen zu visualisieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="605">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:177px;">NESLAB RTE Refrigerating Bath/Circulators</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:145px;">RTE7</td>
			<td style="width:189px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:177px;">Ethylene glycol, Premixed Antifreeze/Coolant</td>
			<td style="width:95px;">Certified</td>
			<td style="width:145px;">29-3037-0</td>
			<td style="width:189px;">Common automotive antifreeze</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:177px;">Cold finger</td>
			<td style="width:95px;">not available</td>
			<td style="width:145px;">not available</td>
			<td style="width:189px;">Custom made with brass (9 cm long, 1.5 cm outer diameter)</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:177px;">Hemispherical cup</td>
			<td style="width:95px;">not available</td>
			<td style="width:145px;">not available</td>
			<td style="width:189px;">Custom made with resin (8 cm outer diameter, 6 cm inner diameter)</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:177px;">High Dual Output Lighting System</td>
			<td style="width:95px;">Lightools Research</td>
			<td style="width:145px;">LT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX</td>
			<td style="width:189px;">Additional and custom excitation filters can be purchased from Lightools Research</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;width:177px;">Camera</td>
			<td rowspan="2" style="width:95px;">Canon</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">EOS 50D</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="79">
			<td height="79" style="height:79px;width:177px;">Emission Filters</td>
			<td style="width:95px;">Lightools Research</td>
			<td style="width:145px;">LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG</td>
			<td style="width:189px;">Filter ring adapter may be required to fit filter onto camera lens</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining the ice-binding planes of antifreeze proteins by fluorescence-based ice plane affinity

Frostschutzproteine (AFPs) werden in einer Vielzahl von kalt-harten Organismen exprimiert, um das interne Eiswachstum zu verhindern oder zu verlangsamen. AFPs binden sich durch ihre Eisbindungsflächen an bestimmte Eisebenen. Die FiPA-Analyse (Fluoreszenzbasierte Eisebene)ist eine modifizierte Technik zur Bestimmung der Eisebenen, an die die AFPs binden. FIPA basiert auf der ursprünglichen Eisätzmethode zur Bestimmung von AFP-gebundenen Eisebenen. Es erzeugt klarere Bilder in einer verkürzten experimentellen Zeit. In der FIPA-Analyse werden AFPs fluoreszierend mit einem chimären Tag oder einem kovalenten Farbstoff beschriftet und dann langsam in einen makroskopischen Einzeleiskristall eingearbeitet, der zu einer Hemisphäre vorgeformt und zur Bestimmung der A- und C-Achsenausgerichtet ist. Die AFP-gebundene Eishalbkugel wird unter UV-Licht dargestellt, um AFP-gebundene Ebenen mithilfe von Filtern zu visualisieren, um unspezifisches Licht zu blockieren. Die fluoreszierende Kennzeichnung der AFPs ermöglicht die Echtzeitüberwachung der AFP-Adsorption in Eis. Es wurde festgestellt, dass die Beschriftungen die Ebenen, an die AFPs gebunden sind, nicht beeinflussen. Die FIPA-Analyse führt auch die Möglichkeit ein, mehr als einen unterschiedlich markierten AFP auf demselben einzigen Eiskristall zu binden, um ihre Bindungsebenen zu differenzieren. Diese Anwendungen der FIPA tragen dazu bei, unser Verständnis dafür zu fördern, wie AFPs an Eis binden, um ihr Wachstum zu stoppen, und warum viele AFP-produzierende Organismen mehrere AFP-Isoformen ausdrücken.

Die Vorbereitung und Montage des einzelnen Eiskristalls sind die beiden Schritte des FIPA-Verfahrens, bei denen am häufigsten Fehler gemacht werden. Die Bestimmung, ob der vorbereitete Eiskristall einzeln ist, erfolgt durch Untersuchung durch gekreuzte Polaroide (Abbildung 1D), wie in Schritt 2.1 des Protokollabschnitts beschrieben. Wenn ein multikristalliner Eiskristall für die FIPA-Analyse verwendet wird, wird das Ergebnis eine diskontinuierliche Bindung der AFPs auf der Hemisphäre ohne ein kohären...

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Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Frostschutzproteine (AFPs) binden an bestimmte Eisebenen, um das Eiswachstum zu verhindern oder zu verlangsamen. Die Fluoreszenzbasierte Eisebene (FIPA)-Analyse ist eine Modifikation der ursprünglichen Eisätzmethode zur Bestimmung von AFP-gebundenen Eisebenen. AFPs werden fluoreszierend beschriftet, in makroskopische Einzeleiskristalle integriert und unter UV-Licht visualisiert.

Bestimmung der eisbindenden Ebenen von Frostschutzproteinen durch Fluoreszenzbasierte Eisebene Affinität

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

determining-ice-binding-planes-antifreeze-proteins-fluorescence-based

Research

JoVE Journal

Chemistry

8.9K Aufrufe.  Queen's University. Frostschutzproteine (AFPs) binden an bestimmte Eisebenen, um das Eiswachstum zu verhindern oder zu verlangsamen. Die Fluoreszenzbasierte Eisebene (FIPA)-Analyse ist eine Modifikation der ursprünglichen Eisätzmethode zur Bestimmung von AFP-gebundenen Eisebenen. AFPs werden fluoreszierend beschriftet, in makroskopische Einzeleiskristalle integriert und unter UV-Licht visualisiert.

Serie: Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition proteins, are found in cold-adapted organisms and protect them from freeze injuries by interacting with ice crystals. IBPs are found in a variety of organism, including fish1, plants2, 3, arthropods4, 5, fungi6, and bacteria7. IBPs adsorb to the surfaces of ice crystals and prevent water molecules from joining the ice lattice at the IBP adsorption location. Ice that grows on the crystal surface between the adsorbed IBPs develops a high curvature that lowers the temperature at which the ice crystals grow, a phenomenon referred to as the Gibbs-Thomson effect. This depression creates a gap (thermal hysteresis, TH) between the melting point and the nonequilibrium freezing point, within which ice growth is arrested8-10, see Figure 1. One of the main tools used in IBP research is the nanoliter osmometer, which facilitates measurements of the TH activities of IBP solutions. Nanoliter osmometers, such as the Clifton instrument (Clifton Technical Physics, Hartford, NY,) and Otago instrument (Otago Osmometers, Dunedin, New Zealand), were designed to measure the osmolarity of a solution by measuring the melting point depression of droplets with nanoliter volumes. These devices were used to measure the osmolarities of biological samples, such as tears11, and were found to be useful in IBP research. Manual control over these nanoliter osmometers limited the experimental possibilities. Temperature rate changes could not be controlled reliably, the temperature range of the Clifton instrument was limited to 4,000 mOsmol (about -7.5 &deg;C), and temperature recordings as a function of time were not an available option for these instruments.
We designed a custom-made computer-controlled nanoliter osmometer system using a LabVIEW platform (National Instruments). The cold stage, described previously9, 10, contains a metal block through which water circulates, thereby functioning as a heat sink, see Figure 2. Attached to this block are thermoelectric coolers that may be driven using a commercial temperature controller that can be controlled via LabVIEW modules, see Figure 3. Further details are provided below. The major advantage of this system is its sensitive temperature control, see Figure 4. Automated temperature control permits the coordination of a fixed temperature ramp with a video microscopy output containing additional experimental details.
To study the time dependence of the TH activity, we tested a 58 kDa hyperactive IBP from the Antarctic bacterium Marinomonas primoryensis (MpIBP)12. This protein was tagged with enhanced green fluorescence proteins (eGFP) in a construct developed by Peter Davies' group (Queens University)10. We showed that the temperature change profile affected the TH activity. Excellent control over the temperature profile in these experiments significantly improved the TH measurements. The nanoliter osmometer additionally allowed us to test the recrystallization inhibition of IBPs5, 13. In general, recrystallization is a phenomenon in which large crystals grow larger at the expense of small crystals. IBPs efficiently inhibit recrystallization, even at low concentrations14, 15. We used our LabVIEW-controlled osmometer to quantitatively follow the recrystallization of ice and to enforce a constant ice fraction using simultaneous real-time video analysis of the images and temperature feedback from the sample chamber13. The real-time calculations offer additional control options during an experimental procedure. A stage for an inverted microscope was developed to accommodate temperature-controlled microfluidic devices, which will be described elsewhere16.
The Cold Stage System
The cold stage assembly (Figure 2) consists of a set of thermoelectric coolers that cool a copper plate. Heat is removed from the stage by flowing cold water through a closed compartment under the thermoelectric coolers. A 4 mm diameter hole in the middle of the copper plate serves as a viewing window. A 1 mm diameter in-plane hole was drilled to fit the thermistor. A custom-made copper disc (7 mm in diameter) with several holes (500 &mu;m in diameter) was placed on the copper plate and aligned with the viewing window. Air was pumped at a flow rate of 35 ml/sec and dried using Drierite (W.A. Hammond). The dry air was used to ensure a dry environment at the cooling stage. The stage was connected via a 9 pin connection outlet to a temperature controller (Model 3040 or 3150, Newport Corporation, Irvine, California, US). The temperature controller was connected via a cable to a computer GPIB-PCI card (National instruments, Austin, Texas, USA).

Ice binding proteins (IBPs), also known as antifreeze proteins, inhibit ice growth and are a promising additive for use in the cryopreservation of tissues. The main tool used to investigate IBPs is the nanoliter osmometer. We developed a home-designed cooling stage mounted on an optical microscope and controlled using a custom-built LabVIEW routine. The nanoliter osmometer described here manipulated the sample temperature in an ultra-sensitive manner.

LabVIEW-betriebenen Novel Nanoliter Osmometer für Ice Binding Protein Untersuchungen

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition ...

Forschung

Chemie

Methods to Identify the NMR Resonances of the 13C-Dimethyl N-terminal Amine on Reductively Methylated Proteins

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a proven technique for protein structure and dynamic studies. To study proteins with NMR, stable magnetic isotopes are typically incorporated metabolically to improve the sensitivity and allow for sequential resonance assignment. Reductive 13C-methylation is an alternative labeling method for proteins that are not amenable to bacterial host over-expression, the most common method of isotope incorporation. Reductive 13C-methylation is a chemical reaction performed under mild conditions that modifies a protein&#39;s primary amino groups (lysine &#949;-amino groups and the N-terminal &#945;-amino group) to 13C-dimethylamino groups. The structure and function of most proteins are not altered by the modification, making it a viable alternative to metabolic labeling. Because reductive 13C-methylation adds sparse, isotopic labels, traditional methods of assigning the NMR signals are not applicable. An alternative assignment method using mass spectrometry (MS) to aid in the assignment of protein 13C-dimethylamine NMR signals has been developed. The method relies on partial and different amounts of 13C-labeling at each primary amino group. One limitation of the method arises when the protein&#39;s N-terminal residue is a lysine because the &#945;- and &#949;-dimethylamino groups of Lys1 cannot be individually measured with MS. To circumvent this limitation, two methods are described to identify the NMR resonance of the 13C-dimethylamines associated with both the N-terminal &#945;-amine and the side chain &#949;-amine. The NMR signals of the N-terminal &#945;-dimethylamine and the side chain &#949;-dimethylamine of hen egg white lysozyme, Lys1, are identified in 1H-13C heteronuclear single-quantum coherence spectra.

Methods to Identify the NMR Resonances of the 13C-Dimethyl N-terminal Amine on Reductively Methylated Proteins

Two methods for assigning the &#945;- and &#949;-dimethylamine nuclear magnetic resonance signals of a reductively 13C-methylated N-terminal lysine are described. One method utilizes the pH-induced selectivity of the reductive methylation reaction, and the other uses aminopeptidase to selectively remove the N-terminal lysine.

Methoden, um die NMR-Resonanzen von Identify<sup&gt; 13</sup&gt; C-Dimethyl-N-terminalen Amins auf reduktiv methylierte Proteine

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a proven technique for protein structure and dynamic studies. To study proteins with NMR, stable magnetic ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control self-assembly and mimicking this process in vitro will bring about major advances in the areas of materials science and nanotechnology. Among the available biological building blocks, peptides have several advantages as they present substantial diversity, their synthesis in large scale is straightforward, and they can easily be modified with biological and chemical entities1,2. Several classes of designed peptides such as cyclic peptides, amphiphile peptides and peptide-conjugates self-assemble into ordered structures in solution. Homoaromatic dipeptides, are a class of short self-assembled peptides that contain all the molecular information needed to form ordered structures such as nanotubes, spheres and fibrils3-8. A large variety of these peptides is commercially available.
This paper presents a procedure that leads to the formation of ordered structures by the self-assembly of homoaromatic peptides. The protocol requires only commercial reagents and basic laboratory equipment. In addition, the paper describes some of the methods available for the characterization of peptide-based assemblies. These methods include electron and atomic force microscopy and Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). Moreover, the manuscript demonstrates the blending of peptides (coassembly) and the formation of a &#34;beads on a string&#34;-like structure by this process.9 The protocols presented here can be adapted to other classes of peptides or biological building blocks and can potentially lead to the discovery of new peptide-based structures and to better control of their assembly.

This paper describes the formation of highly ordered peptide-based structures by the spontaneous process of self-assembly. The method utilizes commercially available peptides and common lab equipment. This technique can be applied to a large variety of peptides and may lead to the discovery of new peptide-based assemblies.

Bildung geordneter Strukturen Biomolekulare durch die Selbstorganisation von kurzen Peptiden

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the time-profile volume and enthalpy changes of light induced conformational changes in proteins on microsecond to millisecond time-scales that are not accessible using traditional stop-flow instruments. In addition, since overall changes in volume and/or enthalpy are probed, these techniques can be applied to proteins and other biomacromolecules that lack a fluorophore and or a chromophore label. To monitor dynamics and energetics of structural changes associated with Ca2+ binding to calcium transducers, such neuronal calcium sensors, a caged calcium compound, DM-nitrophen, is employed to photo-trigger a fast (&#964; &#60; 20 &#956;sec) increase in free calcium concentration and the associated volume and enthalpy changes are probed using photothermal beam deflection technique.

Here we report an application of the photothermal beam deflection technique in combination with a caged calcium compound, DM-nitrophen, to monitor microsecond and millisecond dynamics and energetics of structural changes associated with the calcium association to a neuronal calcium sensor, Downstream Regulatory Element Antagonist Modulator.

Submillisekunden Konformationsänderungen in Proteinen durch Photothermische Ablenkein Gelöst

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein substrates. The histone tails represent one of the most heavily modified stretches within all human proteins. Peptidyl-arginine deiminase 4 (PAD4) has been shown to convert arginine residues into the non-genetically encoded citrulline residue. Few assays described to date have been operationally facile with satisfactory sensitivity. Thus, the lack of adequate assays has likely contributed to the absence of potent non-covalent PAD4 inhibitors. Herein a novel fluorescence-based assay that allows for the monitoring of PAD4 activity is described. A pro-fluorescent substrate analog was designed to link PAD4 enzymatic activity to fluorescence liberation upon the addition of the protease trypsin. It was shown that the assay is compatible with high-throughput screening conditions and has a strong signal-to-noise ratio. Furthermore, the assay can also be performed with crude cell lysates containing over-expressed PAD4.

PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

Fluoreszenz-basierte Überwachung von PAD4 Aktivität über eine Pro-Fluoreszenz Substratanalogon

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

Optimization of Synthetic Proteins: Identification of Interpositional Dependencies Indicating Structurally and/or Functionally Linked Residues

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional units (e.g., domains). Traditional consensus-building models fail to account for interpositional dependencies &#8211; functionally required covariation of residues that tend to appear simultaneously throughout evolution and across the phylogentic tree. These relationships can reveal important clues about the processes of protein folding, thermostability, and the formation of functional sites, which in turn can be used to inform the engineering of synthetic proteins. Unfortunately, these relationships essentially form sub-motifs which cannot be predicted by simple &#8220;majority rule&#8221; or even HMM-based consensus models, and the result can be a biologically invalid &#8220;consensus&#8221; which is not only never seen in nature but is less viable than any extant protein. We have developed a visual analytics tool, StickWRLD, which creates an interactive 3D representation of a protein alignment and clearly displays covarying residues. The user has the ability to pan and zoom, as well as dynamically change the statistical threshold underlying the identification of covariants. StickWRLD has previously been successfully used to identify functionally-required covarying residues in proteins such as Adenylate Kinase and in DNA sequences such as endonuclease target sites.

Synthetic protein sequences based on consensus motifs typically ignore co-evolving residues, that imply interpositional dependencies (IPDs). IPDs can be essential to activity, and designs that disregard them may result in suboptimal results. This protocol uses StickWRLD to identify IPDs and help inform rational protein design, resulting in more efficient results.

Optimierung der synthetische Proteine: Bezeichnung interpositional Abhängigkeiten Anzeige- strukturell und / oder funktionell verknüpft Rückstände

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional ...

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). The fibronectin protein film was immobilized on the silicon nitride (SiN) membrane that forms the SALVI detection area. During ToF-SIMS analysis, three modes of analysis were conducted including high spatial resolution mass spectrometry, two-dimensional (2D) imaging, and depth profiling. Mass spectra were acquired in both positive and negative modes. Deionized water was also analyzed as a reference sample. Our results show that the fibronectin film in water has more distinct and stronger water cluster peaks compared to water alone. Characteristic peaks of amino acid fragments are also observable in the hydrated protein ToF-SIMS spectra. These results illustrate that protein molecule adsorption on a surface can be studied dynamically using SALVI and ToF-SIMS in the liquid environment for the first time.

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

This work presents a protocol for liquid handling and sample introduction to a microchannel for in situ time-of-flight secondary ion mass spectrometry analysis of protein biomolecules in an aqueous solution.

In-situ-Charakterisierung von Hydrated Proteine ​​in Wasser durch SALVI und TOF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins with the synthesis of a hydrophilic poly(oligo(ethylene glycol) methyl ether methacrylate) (POEGMA) homopolymer using reversible addition-fragmentation chain-transfer (RAFT) polymerization. Under mild visible light irradiation (&#955; = 460 nm, 0.7 mW/cm2), this macro-chain transfer agent (macro-CTA) in the presence of a ruthenium based photoredox catalyst, Ru(bpy)3Cl2 can be chain extended with a second monomer to form a well-defined block copolymer in a process known as Photoinduced Electron Transfer RAFT (PET-RAFT). When PET-RAFT is used to chain extend POEGMA with benzyl methacrylate (BzMA) in ethanol (EtOH), polymeric nanoparticles with different morphologies are formed in situ according to a polymerization-induced self-assembly (PISA) mechanism. Self-assembly into nanoparticles presenting POEGMA chains at the corona and poly(benzyl methacrylate) (PBzMA) chains in the core occurs in situ due to the growing insolubility of the PBzMA block in ethanol. Interestingly, the formation of highly pure worm-like micelles can be readily monitored by observing the onset of a highly viscous gel in situ due to nanoparticle entanglements occurring during the polymerization. This process thereby allows for a more reproducible synthesis of worm-like micelles simply by monitoring the solution viscosity during the course of the polymerization. In addition, the light stimulus can be intermittently applied in an ON/OFF manner demonstrating temporal control over the nanoparticle morphology.

This article describes a process for producing polymeric self-assembled nanoparticles using visible light mediated dispersion polymerization. Using low energy visible light to control the polymerization allows for the reproducible formation of self-assembled worm-like micelles at high solids content.

Einfache Synthese von wurmartigen Mizellen durch sichtbares Licht Mediated Dispersion Polymerisation mit Photoredox Katalysator

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Determining the Chemical Composition of Corrosion Inhibitor/Metal Interfaces with XPS: Minimizing Post Immersion Oxidation

An approach for acquiring more reliable X-ray photoelectron spectroscopy data from corrosion inhibitor/metal interfaces is described. More specifically, the focus is on metallic substrates immersed in acidic solutions containing organic corrosion inhibitors, as these systems can be particularly sensitive to oxidation following removal from solution. To minimize the likelihood of such degradation, samples are removed from solution within a glove box purged with inert gas, either N2 or Ar. The glove box is directly attached to the load-lock of the ultra-high vacuum X-ray photoelectron spectroscopy instrument, avoiding any exposure to the ambient laboratory atmosphere, and thus reducing the possibility of post immersion substrate oxidation. On this basis, one can be more certain that the X-ray photoelectron spectroscopy features observed are likely to be representative of the in situ submerged scenario, e.g. the oxidation state of the metal is not modified.

A protocol to avoid the oxidation of metallic substrates during sample transfer from an inhibited acidic solution to an X-ray photoelectron spectrometer is presented.

Die Bestimmung der chemischen Zusammensetzung von Corrosion Inhibitor / Metal-Schnittstellen mit XPS: Minimierung Beitrag Tauch Oxidation

An approach for acquiring more reliable X-ray photoelectron spectroscopy data from corrosion inhibitor/metal interfaces is described. More specifically, ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring high sensitivity and a wide dynamic range. Mass spectrometry-based quantification assays for proteins typically involve protein digestion followed by the selective reaction monitoring/multiple reaction monitoring (SRM/MRM) quantification of peptides using a low-resolution (Rs ~1,000) tandem quadrupole mass spectrometer. One of the limitations of this approach is the interference phenomenon observed when the peptide of interest has the "same" precursor and fragment mass (in terms of m/z values) as other co-eluting peptides present in the sample (within a 1-Da window). To avoid this phenomenon, we propose an alternative mass spectrometric approach, a high selectivity (HS) MRM assay that combines the ion mobility separation of peptide precursors with the high-resolution (Rs ~30,000) MS detection of peptide fragments. We explored the capabilities of this approach to quantify low-abundance peptide standards spiked in a monoclonal antibody (mAb) digest and demonstrated that it has the sensitivity and dynamic range (at least 3 orders of magnitude) typically achieved in HCP analysis. All six peptide standards were detected at concentrations as low as 0.1 nM (1 femtomole loaded on a 2.1-mm ID chromatographic column) in the presence of a high-abundance peptide background (2 &#181;g of a mAb digest loaded on-column). When considering the MW of rabbit phosphorylase (97.2 kDa), from which the spiked peptides were derived, the LOQ of this assay is lower than 50 ppm. Relative standard deviations (RSD) of peak areas (n = 4 replicates) were less than 15% across the entire concentration range investigated (0.1-100 nM or 1-1,000 ppm) in this study.

Here, we describe a chromatographic assay coupled with the ion mobility separation of peptide precursors followed by the high-resolution (~30,000) MS-detection of peptide fragments for the quantification of spiked peptide standards in a monoclonal antibody digest.

Ein HS-MRM-Assay für die Quantifizierung der Wirtszelle Proteine in Protein Biopharmazeutika durch flüssige Chromatographie Ion Mobility QTOF Massenspektrometrie

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...