Um das Verständnis der Transkriptionsfaktor-DNA-Bindung zu verbessern, haben wir eine Methode entwickelt, um Dissoziationskonstanten in großem Maßstab mit z.B. Anisotropiemessungen zu messen. Diese Technik ermöglicht die automatische Erlangung von vollständigen Titrationskurven, um die Dissoziationskonstante mit hoher Empfindlichkeit zu bestimmen. Es arbeitet in Lösung im Gleichgewicht, hat moderaten Durchsatz und großen Dynamikbereich.
Wir haben HiP-FA angewendet, um die Bindungsaffinitätslandschaft von Transkriptionsfaktoren zu verfeinern. Das Protokoll könnte jedoch auf andere Arten von Bindungsereignissen wie Protein-Protein- oder Protein-Arzneimittel-Wechselwirkungen angewendet werden, zum Beispiel. Ich rate, zunächst mehrere Titrationen mit den gleichen Bindungspartnern durchzuführen, um eine Schätzung über die Reproduzierbarkeit der Messungen zu erhalten.
Wenn verfügbar, verwenden Sie ein automatisiertes System für eine noch bessere Reduzibilität. Um die DNA-Oligomere der Referenz-DNA zu annealieren, mischen Sie sieben Mikroliter von je zehn Millimolar-Di-Labeled vorwärts und unbeschrifteten Reverse-Strang in einem Rohr. Für die Konkurrenz-DNA mischen Sie 20 Mikroliter von jedem 100 Millimolar unbeschrifteten Strang in zwei Bohrungen einer 96 gewellten PCR-Platte.
Dann verwenden Sie eine Standard-PCR-Maschine, um die DNA-Lösungen für die drei Minuten auf 70 Grad Celsius zu erwärmen. Dann reduzieren Sie auf Raumtemperatur mit einer Rate von 0,1 Grad Celsius pro Sekunde. Verwenden Sie einen Mikrowellenherd, um 0,5 Gramm Agarose in 100 Milliliter Bindungspuffer zu schmelzen.
Fügen Sie doppelt destilliertes Wasser hinzu, um das Endvolumen anzupassen, um eine mögliche Verdunstung auszugleichen. Bereiten Sie zehn Milliliter-Lager-Aliquots vor. Um die Titrations- und Kalibrierbrunnen einer 96-Well-Platte vorzubereiten, übertragen Sie zwei Gel-Lager-Aliquots auf einen 75-Grad-Celsius-Inkubator-Shaker.
Für jeden Titrationsbrunnen 1,4 Nanomol Referenz-DNA, Transkriptionsfaktorprotein, in einer Endkonzentration von 20-60 Nanomolen, 0,2 Millimolar DTT und den Bindungspuffer zu 240 Mikrolitern des geschmolzenen Gels hinzufügen. Mischen Sie gründlich, indem Sie das Rohr umkehren und schütteln. Dann, langsam Pipette 200 Mikroliter pro Brunnen des DNA-haltigen Gels in den dafür vorgesehenen Titrationsbrunnen einer 96-Well-Platte.
Für jede Kalibrierung gut, fügen Sie 5 Nanomole nile blauen Farbstoff zu 240 Mikroliter des geschmolzenen Gels. Vermeiden Sie Luftblasen, führen sie langsam 200 Mikroliter der farbstoffhaltigen Gellösung in fünf bis sechs Brunnen der 96-Well-Platte. Legen Sie das Gel auf eine perfekt horizontale Oberfläche und inkubieren für zehn Minuten bei Raumtemperatur, und weitere 10 Minuten bei 4 Grad Celsius.
Verwenden Sie einen Multi-Well-Plattenleser, um die Homogenität der Gelhöhen in verschiedenen Brunnen der Platte zu überprüfen. Um die Konkurrenz-DNA-Lösung vorzubereiten, kombinieren Sie zunächst die beschriftete Referenz-DNA, das Protein und den dreifach konzentrierten Bindungspuffer. Mischen Sie dann 20 Mikroliter der Lösung mit 40 Mikrolitern jeder der geglühten Wettbewerber-DNA-Lösungen.
Kombinieren Sie für jede Kalibrierung gut die entsprechenden Mengen einer der geglühten Wettbewerber-DNA-Lösungen und den dreifach konzentrierten Bindungspuffer mit 15 Millimolaren-Nile-Blau-Farbstoff-Lösung. Zum Schluss 50 Mikroliter der gemischten Konkurrenzlösungen so gleichzeitig wie möglich auf die Gele geben. Um mit der Bildaufnahme zu beginnen, stellen Sie die 96-Well-Platte auf die Mikroskopstufe.
Nehmen Sie dann Zeitreihen von Z-Stack-Bildern von Brunnen, bis das Protein vollständig aus der Referenz-DNA gebunden ist. Führen Sie den Titrationstest gemäß dem Manuskript durch. Verwenden Sie dann die HiP-FA-Software, um Titrationskurven für einzelne Konkurrenzsequenzen zu erstellen.
Klicken Sie dann auf die Export-Schaltfläche, um die Dissoziationskonstante und die Konzentration des aktiven Proteins in jedem Titrationsbrunnen zu erhalten. Achten Sie besonders darauf, wenn Sie die viskosen Gellösungen pipetieren. Ungenaue Pipettierungen können die Genauigkeit für die Bestimmung der Dissoziationskonstanten senken.
In dieser Studie wird die HiP-FA-Methode angewendet, um die DNA-bindenden Präferenzen eines B-Reißverschluss-Transkriptionsfaktors zu bestimmen. Giant, aus dem Fly-Segmentierungs-Gen-Netzwerk. Die hohe Ähnlichkeit der PWM für Replikationen, die entweder manuell oder mit Automatisierungstechniken vorbereitet wurden, zeigte die hohe Reproduzierbarkeit der HiP-FA-Methode.
PWM s bei dieser Methode und anderen Methoden sind insgesamt ähnlich. An den Positionen zwei und sieben des Kernmotivs sind jedoch signifikante Abweichungen zu beobachten, bei denen Mutationen entweder zu einem vollständigen Bindungsverlust oder zu einer viel stärkeren Bindung als frühere Messungen führen können. Wir verwenden HiP-FA, um Verfeinerungen für die Bindungen von Dutzenden von Transkriptionsfaktor zu generieren und es zeigt, dass am Ende eine bessere Vorhersage der Daten zu erhalten.
Wir glauben, dass sein Maß an hoher Genauigkeit sehr nützlich sein kann, um die TF-DNA-Bindung für das gesamte System oder für alle Arten von Interaktionen besser zu verstehen.
