Die Autoren möchten biolitec Research GmbH (Jena, Deutschland) für die freundliche Bereitstellung uns mit dem liposomalen mTHPC-Formulierung, mit besonderem Dank an Susanna Gräfe und Arno Wiehe für ihre Hilfe und technisches Know-how danken. Wir möchten auch an Kerstin Reidy, der einen großen Teil der Ergebnisse generiert und war mitverantwortlich für seine Veröffentlichung 11 danken. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Schweizerischer Verein Balgrist, der Universität Zürich, der Krebsliga Zürich sowie durch einen Zuschuss aus dem Walter L. und Johanna Wolf-Stiftung, Zürich, Schweiz und einen Zuschuss aus EuroNanoMed ERA-NET / SNF unterstützt Schweizer National Science Foundation 31NM30-131004/1. Diese Arbeit wurde auch von der HSM (Hochspezialisierte Medizin)-Programm für Muskuloskelettale Onkologie der Kanton Zürich unterstützt.

1. Vergleich der Aufnahme von mTHPC in den jeweiligen Nieder-und Hoch Metastatische HOS und 143B OS-Zelllinien <ol><li> Vorbereitung Zellkulturmedium, das DMEM, Ham F12 und hitzeinaktiviertem fetalem Kälberserum in einem Verhältnis 4.5:4.5:1. Hinweis: Die liposomale Formulierung der PS mTHPC wurde in Wasser in einer Endkonzentration von 1,5 mg / ml mTHPC gelöst. </li><li> Platte 0,2 x 10 6 HOS und 143B Zellen / Well in 6-Well-Platten (dreifacher Ausführung für jede Bedingung) und lassen die Zellen über Nacht halten. Hinweis: Die Nummer muss auf einzelne Zelllinien eingestellt werden. Eine Konfluenz von 80-90% am meisten zu der Zeit des Versuchs geeignet. </li><li> Am folgenden Tag, Inkubation der Zellen mit einer festen Konzentration von mTHPC für verschiedene Zeiträume (zeitabhängige Aufnahme) oder mit steigenden Konzentrationen von mTHPC während einer festen Zeitperiode (Dosis abhängige Aufnahme). </li><li> Die Zellen mit mTHPC inkubieren bestimmten Zeit punkte oder Konzentrationen von mTHPC. Anmerkung: In dieser Studie wurden sowohl die HOS und 143B Zelllinien mit 0,6 &amp;mgr; g / ml inkubiert mTHPC für 0, 2,5, 5 oder 10 Stunden, oder mit 0, 0,6, 2,5 und 10 ug / ml mTHPC 5 Stunden. Die angewandten Zeiträume und Dosierungen können in Abhängigkeit von der Zelllinie, die verwendet wird, variieren. </li><li> Denken Sie daran, immer im Dunkeln oder bei gedimmten Lichtverhältnissen arbeiten, um Licht Exposition der Zellen zu verhindern. </li><li> Nach Inkubation der Zellen bei den angegebenen Bedingungen absaugen Medium und die Zellen werden dreimal mit PBS. Als nächstes lösen Sie die Zellen mit 0,5 ml Trypsin / EDTA und zählen Sie die Zellen. </li><li> Nach dem Ablösen Zentrifugation der Zellen bei 400 × g für 5 min, saugt den mittleren und Resuspendieren der Zellen in PBS auf eine endgültige Dichte von 200.000 Zellen / ml. </li><li> Je 100 &amp;mgr; l der erhaltenen Zellsuspension (dh 20.000 Zellen) in einer 96-well-Platte und Messen der Fluoreszenz dieser Zellen in einem Fluoreszenz-Spektralphotometer. Die Einstellungs für mTHPC Fluoreszenzmessungen sind: 417 nm für die Anregung und 652 nm für die Emission. </li><li> Um die Menge des pro Zelle internalisierten mTHPC berechnen, normalisieren die relative Fluoreszenzeinheit (RFU) für die Zellzahl und Zellvolumen, wie folgt: </li><li> Bereiten Sie eine Standardkurve mit verschiedenen Konzentrationen von mTHPC in PBS von 0-4 pg / ml (Verwendung Dreifachmessungen). Je 100 ul jeder Verdünnung in eine 96-Well-Platte und messen die Fluoreszenz der Brunnen mit den unter Schritt 1.6 beschriebenen Einstellungen. </li><li> Teilen die RFU (20.000 Zellen) erhalten durch die Steigung der linearen Standardkurve von mTHPC, die die Konzentration von mTHPC (in ug / ml) in dem Schacht gibt. </li><li> Teilen diese mTHPC Konzentration von 10, um die Gesamtmenge der mTHPC in einer Vertiefung (in &amp;mgr; g, die 100 ul der Zellsuspension) erhalten und teilt diesen Wert durch das Volumen von 20.000 Zellen. </li><li> Berechnen Sie das Volumen mit der Formel für eine Kugel: (4/3 x π) xr 3. Erhalten des Radius r durch Messen des Durchmessers von 20 trypsiniert Zellen unter einem Mikroskop, und Dividieren dieses Werts durch 2. </li><li> Schließlich normalisieren alle Werte mit denen für HOS-Zellen nach 10 h Inkubation (dosisabhängige Aufnahme) oder mit 10 ug / ml mTHPC (Zeit abhängige Aufnahme), die auf 100% gesetzt wurden behandelt worden sind. </li></ol> 2. Die Messung der Phototoxizität von PS In-vitro- <ol><li> Seed 3.000 Zellen / Well in einer 96-Well-Platte (dreifacher Ausführung für jede Konzentration der mTHPC verwendet) und lassen Sie sie über Nacht zu halten. Ebenso bereiten eine zusätzliche 96-Well-Platte und Behandlung der Zellen, wie unten beschrieben, aber dann legte sie beiseite für Phasenkontrast-Bildgebung. Anmerkung: Die Anzahl muss für jede einzelne Zelllinie eingestellt werden. Eine Konfluenz von 50-60% zum Zeitpunkt des Experiments ist ideal. <ol><li> Denken Sie daran, die entsprechende Dunkeltoxizität Kontrolle von Zellen für jedes der mTHPC-Konzentrationen hinzufügen. Diese sind Zellen, die in Abwesenheit oder in Gegenwart von ausgewählten Konzentrationen mTHPC inkubiert werden, wird aber nicht ausgeleuchtet werden. </li></ol></li><li> Am folgenden Tag, Inkubation der Zellen mit je nach Zelllinien verschiedenen Konzentrationen von mTHPC (0, 0,0001, 0,001, 0,01, 0,03, 0,075, 0,15, 0,3, 0,6, 1,25, 2,5, 5 und 10 ug / ml) und halten sie in der Dunkelheit für 5 Stunden. <ol><li> Siehe Abschnitt 1.3.2 Hinweis: Die Inkubationszeit vor der Bestrahlung hängt von der Zelllinie und der PS verwendet, daher ist es ratsam, den verschiedenen Konzentrationen und zu verschiedenen Zeitpunkten in getrennten Experimenten getestet. </li></ol></li><li> Nach der Inkubation für den angegebenen Zeitraum, waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und neue frisches Medium ohne mTHPC. </li><li> Beleuchten Sie die Zellen mit einem 652 nm Diodenlaser, die spezifisch für die mTHPC Absorptionsspektrum (siehe Abbildung 1). <ol><li> Stellen Sie den Laser, um 21.88 mW / cm 2 Leistung bei einer Höhe von 13,5 cm distaNOA aus den Zellen, um eine Energiedosis von 5 J / cm 2 erhalten. Beleuchten Sie die Zellen für 230 sek. Beleuchten Sie nicht die Dunkeltoxizität Kontrollzellen (mit und ohne mTHPC). Hinweis: Tragen Sie immer eine Brille, die Augen von der zur Anregung der PS verwendet Laserlicht zu schützen. </li></ol></li><li> Nach der Beleuchtung, halten die Zellen im Dunkeln bei 37 º C für 24 Stunden. Anschließend fügen wasserlösliche Tetrazoliumsalz (WST-1)-Reagenz (10 μl/100 ul Medium). </li><li> Drei Stunden nach der Zugabe des WST-1-Reagens wird die Extinktion der einzelnen Vertiefungen der Platte mit 96 Vertiefungen bei 415 nm auf. </li><li> Um den Prozentsatz der überlebenden Zellen zu berechnen, setzen Sie den Mittelwert der für die nicht behandelten Zellen mTHPC für jede Bedingung zu 100% (dh beleuchtet, ohne mTHPC und nonilluminated, ohne mTHPC) erhaltenen Werte. </li></ol> 3. Schätzung der Anzahl von Zellen durch Zellzählung <ol><li> Seed 20.000 Zellen / wirll in einer 24-Well-Platte und lassen Sie sie über Nacht zu halten. </li><li> Inkubieren der Zellen für 5 h mit mTHPC (0,001, 0,003, 0,15, 0,6 und 1,25 ug / ml) und beleuchten sie wie oben beschrieben. </li><li> Sammeln Sie das Medium, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS, trypsinize sie und sammeln sie durch Zentrifugation bei 400 g für 5 min. </li><li> Nach der Zentrifugation saugen Sie den mittel-und Resuspendieren der Zellen in 200 ml frisches Medium. </li><li> Zählen Sie die Zellen in einer Neubauer-Kammer. </li></ol>

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	<li>Juarranz, A., Jaen, P., Sanz-Rodriguez, F., Cuevas, J., Gonzalez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+of+cancer.+Basic+principles+and+applications.">Photodynamic therapy of cancer. Basic principles and applications.</a> Clin. Transl. Oncol. 10, 148-154 (2008).</li><li>Agostinis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+of+cancer:+an+update.">Photodynamic therapy of cancer: an update.</a> CA Cancer. 61, 250-281 (2011).</li><li>D'Adamo, D. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photophysical+parameters,+photosensitizer+retention+and+tissue+optical+properties+completely+account+for+the+higher+photodynamic+efficacy+of+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin+vs+Photofrin.">Photophysical parameters, photosensitizer retention and tissue optical properties completely account for the higher photodynamic efficacy of meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin vs Photofrin.</a> Photochem. Photobiol. 81, 849-859 (2005).</li><li>Ma, L., Moan, J., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+new+photosensitizer,+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin,+for+use+in+photodynamic+therapy:+a+comparison+of+its+photobiological+properties+with+those+of+two+other+photosensitizers.">Evaluation of a new photosensitizer, meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin, for use in photodynamic therapy: a comparison of its photobiological properties with those of two other photosensitizers.</a> Int. J. Cancer. 57, 883-888 (1994).</li><li>Reidy, K., Campanile, C., Muff, R., Born, W., Fuchs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTHPC-mediated+photodynamic+therapy+is+effective+in+the+metastatic+human+143B+osteosarcoma+cells.">mTHPC-mediated photodynamic therapy is effective in the metastatic human 143B osteosarcoma cells.</a> Photochem. Photobiol. 88, 721-727 (2012).</li><li>Triesscheijn, M., Ruevekamp, M., Aalders, M., Baas, P., Stewart, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+sensitivity+of+microvascular+endothelial+cells,+fibroblasts+and+tumor+cells+after+in+vitro+photodynamic+therapy+with+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin.">Comparative sensitivity of microvascular endothelial cells, fibroblasts and tumor cells after in vitro photodynamic therapy with meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin.</a> Photochem. Photobiol. 80, 236-241 (2004).</li><li>Triesscheijn, M., Baas, P., Schellens, J. H., Stewart, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+in+oncology.">Photodynamic therapy in oncology.</a> Oncologist. 11, 1034-1044 (2006).</li><li>Burch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+canine+osseous+tumors+with+photodynamic+therapy:+a+pilot+study.">Treatment of canine osseous tumors with photodynamic therapy: a pilot study.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 467, 1028-1034 (2009).</li></ol>

Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder Interessenkonflikte.

Um eine optimale Zytotoxizität in Reaktion auf die PDT zu erreichen, ist es entscheidend, die richtigen Laser Lichteinstellungen und Inkubationszeiten zu wählen. Die hier beschriebenen Verfahren sind konsistent und effizient zu PS-Aufnahme zu bestimmen und PDT induzierte Zytotoxizität in vitro zu quantifizieren. Verwendung der spezifischen Absorptionswellenlängen der PS mTHPC kann die zelluläre Aufnahme PS in direkter Weise bestimmt werden, und die PS kann aktiviert werden, um zytotoxische reaktive Sauerst...

Der heutige Stand der Technik Behandlung von Osteosarkom (OS), eine primäre Knochentumor, umfasst eine Kombination von neo adjuvante Chemotherapie und Chirurgie. Dieses Behandlungsschema ergab eine Erhöhung der Überlebensrate von Patienten mit lokalisierter Erkrankung von etwa 20% vor der Verwendung der Chemotherapie zu Zeit zwischen 60-70% 3, 4. Doch in den letzten zwei Jahrzehnten hat sich die Gesamtüberlebenszeit von Patienten mit OS lokale Erkrankung Plateau 4, 5. Außerdem 30-40% dieser Patienten einen Rückfall innerhalb von 3 Jahren nach der Diagnose und bei Patienten mit metastatischen Erkrankung weiterhin eine schlechte Überleben von 20-30% 4, 6, 7 aufweisen. Um die Ergebnisse dieser Patienten zu verbessern, müssen neue therapeutische Strategien entwickelt werden. Photodynamische Therapie (PDT), eine ziemlich neuartige Antikrebstherapie verwendet Licht einer bestimmten Wellenlänge zur Anregung eines phototizer (PS), die nach der Injektion in den Blutstrom in den Tumorzellen akkumuliert. Laserlichtanregung der PS erzeugt Sauerstoffradikale in Gegenwart von Sauerstoff, die zytotoxische Reaktion in Tumorzellen und Zelltod induzieren. Neben dieser Hauptmechanismus, zwei zusätzliche PDT hervorgerufen biologische Prozesse tragen zu reduziertem Tumorwachstum: PDT verursacht Vasokonstriktion und Thrombosebildung des Tumors Mikrovaskulatur und damit lokale Hypoxie und Anoxie im Tumor, was zu Tumorinfarkt. Schließlich verletzt PDT und sterbenden Tumorzellen auslösen, eine lokale Immunantwort, eine ziemlich einzigartige Merkmal der PDT. Dies beinhaltet das Komplementsystem und die Aktivierung von Antigen-präsentierenden dendritischen Zellen 8. Somit sind die Bedingungen für die Präsentation von Tumorantigenen mit anschließender Aktivierung lymphoider Zellen erzeugt, was zu tumorspezifischen Immunität. So weit, PDT wurde verwendet, um verschiedene Arten von Weichteiltumoren und hyperpl behandelnAsiens, wie aktinische Keratose, Barrett-Ösophagus, Endobronchialtumor, Blasenkrebs, Basaliome und palliative Behandlung von Kopf-und Halskrebs 2. Die Behandlung ist bekannt, lokal, Groß Nekrose mit wenig Nebenwirkungen zu induzieren, und hat damit das Potenzial, Tumorgewebe selektiv zu beseitigen. Trotz dieser Vorteile bleibt die Anwendung der PDT technisch anspruchsvoller als die Verabreichung von Chemotherapeutika. Um die maximale Wirksamkeit, die PS-Konzentration, Belichtungszeit und Gesamtlichtenergieübertragung zu erreichen müssen optimiert werden. Dies kann in in vivo-Experimenten gemacht werden, aber aufgrund der relativ großen Anzahl von Parametern, die optimiert werden müssen, ist es effizienter, um optimale Bedingungen in vitro zunächst bestimmen. In den unten beschriebenen Experimenten testeten wir die in vitro Wirksamkeit der PDT mit der PS 5,10,15,20-Tetrakis-(meta-hydroxyphenyl)-chlOrin, abgekürzt mTHPC (Abbildung 1A). mTHPC ist der Wirkstoff in dem Arzneimittel Foscan, die derzeit in der Klinik für die palliative Behandlung von Kopf-und Halstumoren eingesetzt wird. Es ist eines der stärksten PS, Induktion massiven Zellschäden bereits bei niedrigen Konzentrationen, und es wurde gezeigt, besser als andere zu sein PS in Bezug auf Gewebepenetration 9, 10. Die Lichtabsorptionsspektrum (Abbildung 1B) zeigt zwei prominente Peaks, einen bei 417 nm und eine zweite bei 652 nm, die für die Gewebe Lokalisierung der anfall PS und für die PDT Induktion verwendet werden, auf. Derzeit ist eine liposomale Formulierung für mTHPC in der Entwicklung. Hier beschreiben wir die Verfahren für die Aufnahme von diesem liposomale Formulierung zu quantifizieren und PDT in zwei menschlichen Zelllinien OS durchzuführen; die niedrige metastasierendem HOS und die hohen metastatischen 143B-Zellen. Einige der hier vorgestellten Daten wurden zuvor 11 gemeldet. Thhier beschriebenen e-Ansatz ermöglicht es uns, die Wirkung einer metastatischen Phänotyp PDT Wirksamkeit zu untersuchen. 143B-Zellen, orthotop in die Hinterbeine von immundefizienten SCID-Mäusen injiziert verursachen intratibial metastasierenden Primärtumoren, ein Modell genau imitiert die menschliche metastasierende Erkrankung. So sind die vorgeschlagenen in vitro Experimente perfekt geeignet zur Beurteilung der optimalen Einstellungen PDT später in in vivo-Experimenten verwendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="955">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">DMEM</td>
			<td style="width:251px;">PAA GmbH, Freiburg, Germany</td>
			<td style="width:127px;">E15-883</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">HAM F12</td>
			<td>PAA GmbH, Freiburg, Germany</td>
			<td style="width:127px;">E15-817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">heat-inactivated fetal calf serum</td>
			<td>GIBCO, Basel, Switzerland</td>
			<td style="width:127px;">10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:291px;">mTHPC</td>
			<td style="width:251px;">biolitec research GmbH, Jena, Germany</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:287px;">As this liposomal formulation is originating from R &#38; D 
			no catalogue number is available at the moment. Stock: 1.5mg/ml; provided in a 9:1 mixture of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG; &#62;99% purity)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectramax Gemini XS plate reader</td>
			<td style="width:251px;">Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
			<td style="width:127px;">ID# 861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Microscope Zeiss Observer.Z1</td>
			<td style="width:251px;">Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Germany</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Ceralas PDT 652 nm Laser</td>
			<td style="width:251px;">Biolitec AG, Jena, Germany</td>
			<td style="width:127px;">LD652nm2W400u</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Water-soluble tetrazolium (WST) reagent</td>
			<td style="width:251px;">Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Switzerland</td>
			<td style="width:127px;">1644807</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cytotoxic efficacy of photodynamic therapy in osteosarcoma cells in vitro

In den letzten Jahren gab es die Schwierigkeit, wirksamer Therapien gegen Krebs mit weniger systemische Nebenwirkungen. Daher Photodynamische Therapie ist ein neuer Ansatz für eine Tumor selektive Behandlung. Photodynamische Therapie (PDT), die Verwendung eines nicht-toxischen macht Photosensibilisators (PS), die bei Aktivierung mit Licht einer spezifischen Wellenlänge in Gegenwart von Sauerstoff, Sauerstoff-Radikale erzeugt, die eine zytotoxische Reaktion 1 hervorzurufen. Trotz seiner Zustimmung vor fast zwanzig Jahren von der FDA wird PDT heute nur noch verwendet, um eine begrenzte Anzahl von Krebsarten (Haut, Blase) und nononcological Erkrankungen (Psoriasis, aktinische Keratose) 2 zu behandeln. Der Hauptvorteil der Anwendung der PDT ist die Fähigkeit, eine lokale Behandlung, die systemischen Nebenwirkungen verhindert zuführen. Darüber hinaus ermöglicht es die Behandlung von Tumoren an empfindlichen Stellen (zB um Nerven oder Blutgefäße). Hier wird ein intraoperative Anwendung der PDT wird als in Osteosarkom (OS), einem Tumor des Knochens, um Primärtumor Satelliten gezielt in Tumor umgebende Gewebe nach chirurgischer Tumorentfernung hinter sich gelassen. Die Behandlung zielt auf die Verringerung der Anzahl von Wiederholungen und zur Verringerung der Gefahr für die (postoperativ) Metastasierung. In der vorliegenden Studie, in vitro PDT präsentieren wir Verfahren, um die optimalen Einstellungen für die PDT effektive Behandlung der weit verbreiteten OS-Zelllinien, die verwendet werden, um die menschliche Krankheit in etablierten intratibial OS Mausmodelle reproduzieren zu etablieren. Die Aufnahme des PS mTHPC wurde mit einem Spektrophotometer und Phototoxizität wurde mit Laserlichtanregung bei 652 nm mTHPC provoziert Zelltod mit einem WST-1-Assay und durch das Zählen der überlebenden Zellen beurteilt induzieren sucht. Die etablierten Techniken ermöglichen es uns, die optimalen Einstellungen PDT für zukünftige Studien in Tiermodellen zu definieren. Sie sind eine einfache und schnelle Werkzeug für die Bewertung der Wirksamkeit der PDT <em&gt; In vitro vor einer Anwendung in vivo.

Mit den hier berichteten Techniken untersuchten wir mTHPC-basierte PDT in menschlichen Zellen OS. Zuerst wurde die Zeit-und Dosis-abhängige Aufnahme von mTHPC im niedrigen metastatischen HOS und in den hoch metastatischen 143B OS Zelllinien untersucht. mTHPC Aufnahme kann durch Messung der Fluoreszenz des mTHPC mit einem Fluoreszenz-Spektrophotometer (Abbildung 2, mit freundlicher Genehmigung von Reidy et al. 11 wiedergegeben) beurteilt werden. 2A veranschaulicht di...

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Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

Das Protokoll ermöglicht die hier berichteten Bewertung der Wirksamkeit der photodynamischen Therapie (PDT) in Zelllinien und der Optimierung der PDT Einstellungen, bevor die Therapie in Tiermodellen.

Zytotoxische Wirksamkeit von Photodynamische Therapie in Osteosarkomzellen<em&gt; In-vitro-</em

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic ...

cytotoxic-efficacy-photodynamic-therapy-osteosarcoma-cells

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Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

12.7K Aufrufe.  Balgrist University Hospital, Zurich, Switzerland.  Das Protokoll ermöglicht die hier berichteten Bewertung der Wirksamkeit der photodynamischen Therapie (PDT) in Zelllinien und der Optimierung der PDT Einstellungen, bevor die Therapie in Tiermodellen. 

Serie: Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy and stem cell transplantations have become key therapeutic tools for treating blindness resulting from retinal degenerative diseases. Several forms of autologous transplantation for age-related macular degeneration (AMD), such as iris pigment epithelial cell transplantation, have generated encouraging results, and human clinical trials have begun for other forms of gene and stem cell therapies.2 These include RPE65 gene replacement therapy in patients with Leber's congenital amaurosis and an RPE cell transplantation using human embryonic stem (ES) cells in Stargardt's disease.3-4 Now that there are gene therapy vectors and stem cells available for treating patients with retinal diseases, it is important to verify these potential therapies in animal models before applying them in human studies. The mouse has become an important scientific model for testing the therapeutic efficacy of gene therapy vectors and stem cell transplantation in the eye.5-8 In this video article, we present a technique to inject gene therapy vectors or stem cells into the subretinal space of the mouse eye while minimizing damage to the surrounding tissue.

This surgical technique illustrates the injection of gene therapy vectors and stem cells into the subretinal space of the mouse eye.

Subretinalen Injektion von Vektoren für die Gentherapie und Stammzellen in die Maus Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

Forschung

Medizin

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

In vitro Anreicherung des Eierstockkrebs Tumor-initiierenden Zellen

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Studieren Bauchspeicheldrüsenkrebs Stammzelleigenschaften für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Depletion von Maus-Zellen aus menschlichem Tumorxenografte deutlich verbessert Downstream-Analyse von Zielzellen

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Forskolin-induzierte Quellung in Intestinale Organoide: Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay für Fibrosis Patienten in Cystic Drug Response-Beurteilung

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

Vorbereitung und<em&gt; In Vitro</em&gt; Charakterisierung von Magnetized miR-modifizierten Endothelzellen

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. It has become important to measure a person's activities in daily life, and not just measure their capacity for activity in the structured environment of a clinic or laboratory. A wearable sensor that is now enabling measurement of daily movement is the accelerometer. Accelerometers are commercially-available devices resembling large wrist watches that can be worn throughout the day. Data from accelerometers can quantify how the limbs are engaged to perform activities in peoples' homes and communities. This report describes a methodology to collect accelerometry data and turn it into clinically-relevant information. First, data are collected by having the participant wear two accelerometers (one on each wrist) for 24 h or longer. The accelerometry data are then downloaded and processed to produce four different variables that describe key aspects of upper limb activity in daily life: hours of use, use ratio, magnitude ratio, and the bilateral magnitude. Density plots can be constructed that visually represent the data from the 24 h wearing period. The variables and their resultant density plots are highly consistent in neurologically-intact, community-dwelling adults. This striking consistency makes them a useful tool for determining if upper limb daily performance is different from normal. This methodology is appropriate for research studies investigating upper limb dysfunction and interventions designed to improve upper limb performance in daily life in people with stroke and other patient populations. Because of its relative simplicity, it may not be long before it is also incorporated in clinical neurorehabilitation practice.

This protocol describes a method to quantify upper limb performance in daily life using wrist-worn accelerometers.

Ein Verfahren zur Quantifizierung der oberen Extremität Leistung im täglichen Leben Accelerometer Verwendung

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy

Photodynamic therapy (PDT) is a medical procedure that involves incubation of an exogenously applied photosensitizer (PS) followed by visible light photoactivation to induce cell apoptosis. The Federal Drug Administration has approved PDT for the treatment of actinic keratosis, and clinical guidelines recommend PDT as a treatment for certain non-melanoma skin cancers and acne vulgaris. PDT is an advantageous therapeutic modality as it is low cost, non-invasive, and associated with minimal adverse events and scaring. In the first step of PDT, a PS is applied and allowed to accumulate intracellularly. Subsequent light irradiation induces reactive oxygen species formation, which may ultimately lead to cell apoptosis, membrane disruption, mitochondrial damage, immune modulation, keratinocyte proliferation, and collagen turnover. Herein, we present an in vitro method to study PDT in an adherent cell line. This treatment protocol is designed to simulate PDT and may be adjusted to studying the use of PDT with various cell lines, photosensitizers, incubation temperatures, or photoactivation wavelengths. Squamous cell carcinoma cells were incubated with 0, 0.5, 1.0, and 2 mM 5-aminolevulinic acid (5-ALA) for 30 min and photoactivated with 417 nm blue light for 1,000 s. The primary outcome measure was apoptosis and necrosis, as measured by annexin-V and 7-aminoactinomycin D flow cytometry. There was a dose-dependent increase in cell apoptosis following thirty-minute incubation of 5-ALA. To achieve high inter-test validity, it is important to maintain consistent incubation and light parameters when performing in vitro PDT experiments. PDT is a useful clinical procedure and in vitro research may allow for the development of novel PSs, optimization of protocols, and new indications for PDT.

An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy

Photodynamic therapy (PDT) is a medical procedure that involves incubation of an exogenously applied photosensitizer (PS) followed by visible light photoactivation to induce apoptosis. We present an in vitro PDT protocol designed to simulate PDT that may be used to study differences in PS incubation and light treatment parameters.

Ein In-vitro- Ansatz zur Photodynamischen Therapie

Photodynamic therapy (PDT) is a medical procedure that involves incubation of an exogenously applied photosensitizer (PS) followed by visible light ...

Preparation Of Gushukang (GSK) Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang (GSK) granules, a marketed prescription in China, have bone-protective effects in treating POP. Before administration to the body, one standard preparation procedure is commonly required, which aims to promote the release of active constituents from raw herbs and enhance the pharmacological effects as well as therapeutic outcomes. This study proposes a detailed protocol for using GSK granules in in vivo and in vitro experimental assays. The authors first provide a detailed protocol to calculate the animal-appropriate dosages of granules for in vivo investigation: weighing, dissolving, storage, and administration. Second, this article describes protocols for micro-CT scanning and the measurement of bone parameters. Sample preparation, protocols for running the micro-CT machine and quantification of bone parameters were evaluated. Third, serum-containing GSK granules are prepared, and drug-containing serum is extracted for in vitro osteoclastogenesis and osteoblastogenesis. GSK granules were intragastrically administered twice per day to rats for three consecutive days. Blood was then collected, centrifuged, inactivated, and filtered. Finally, serum was diluted and used for performing osteoclastogenesis and osteoblastogenesis. The protocol described here can be considered a reference for pharmacological investigations of herbal prescription medicines, such as granules.

Preparation Of Gushukang GSK Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

This article provides a detailed protocol for preparing a working solution of Gushukang granules for animal studies and GSK granule containing serum for in vitro experiments. This protocol can be applied to pharmacological investigations of herbal medicines as well as prescriptions for both in vivo and in vitro experiments.

Vorbereitung von Gushukang (GSK) Granulat en for In Vivo und In Vitro Experiments

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang ...

Large Animal Model for Evaluating the Efficacy of the Gene Therapy in Ischemic Heart

Coronary artery disease is one of the significant causes of mortality and morbidity worldwide. Despite the progression of current therapeutics, a considerable proportion of coronary artery disease patients remain symptomatic. Gene therapy-mediated therapeutic angiogenesis offers a novel therapeutic method for improving myocardial perfusion and relieving symptoms. Gene therapy with different angiogenic factors has been studied in few clinical trials. Due to the novelty of the method, the progress of myocardial gene therapy is a continuous path from bench to bedside. Therefore, large animal models are needed for evaluating the safety and efficacy. The more the large animal model identifies the original disease and the endpoints used in clinics, the more predictable outcomes are from clinical trials. Here, we introduce a large animal model for evaluating the efficacy of the gene therapy in the ischemic porcine heart. We use clinically relevant imaging methods such as ultrasound imaging and 15H2O-PET. For targeting the gene transfers into the desired area, electroanatomical mapping is used. The aim of this method is: (1) to mimic chronic coronary artery disease, (2) to induce therapeutic angiogenesis at hypoxic areas of the heart, and (3) to evaluate the safety and efficacy of the gene therapy by using relevant endpoints.

Myocardial gene therapy for ischemic heart disease holds great promise for future therapeutics. Here, we introduce a large animal model for evaluating the efficacy of gene therapy in the ischemic heart.