Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Gesellschaft (KMD, BD, AWM, TB, TBB, DJM und WK), des Exzellenzclusters Frankfurt &quot;Makromolekulare Komplexe&quot; von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (WK) und einem Postdoc-EMBO Long-Term finanziert unterstützt Fellowship (VAMG).

1. Herstellung von Mitochondrien aus Zellen oder Gewebe durch differentielle Zentrifugation Dieser Abschnitt beschreibt ein allgemeines Verfahren für die Isolierung von intakten Mitochondrien aus verschiedenen eukaryotischen Organismen. Die genaue Pufferkomponenten und Zentrifugation Geschwindigkeiten müssen für jedes Gewebe optimiert werden / Arten untersucht. <ol><li> Brechen Zellen in isotonischen Puffer (zB 250 mM Saccharose, 10 mM HEPES pH 7,4), unter Verwendung eines Glasperlenmühle (Pilzmyzel) 28, enzymatische Verdauung der Zellwand (Saccharomyces cerevisiae) 29, ein Kugellager Homogenisator (Einzel -cell Eukaryoten / Kultur Zellen / Nematoden) 30 oder ein Mixer (tierischen oder pflanzlichen Geweben) 31. </li><li> Entfernen von Zelltrümmern durch Filtration durch Mull, gefolgt von Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (2.000 × g, 4 ° C, 10 min). </li><li> Sammeln Stand und Pellet Mitochondrien durch Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation (9.000 × g, 4 ° C, 10 min). </li><li> Wo erforderlich, verwenden Sie eine isotonische Dichte Stufengradienten für zusätzliche Reinigung der mitochondrialen Fraktion 32. </li></ol> 2. Herstellung von Mitochondrien für Cryo-Electron-Tomographie Der folgende Abschnitt beschreibt, wie tiefgefrorenen Proben für Kryo-ET zu erhalten. HINWEIS: Die Methode beinhaltet die Verwendung von sehr kalten flüssigen Stickstoff und Ethan, die schwere Verbrennungen verursachen kann. Schutzbrille und Schutzhandschuhe Cryo-getragen werden. Flüssiges Ethan, das auch brennbar ist, muss in einem Abzug gehandhabt werden. <ol><li> Sedimentierte Mitochondrien in 250 mM Trehalose, 10 mM HEPES-Puffer bei pH 7,4 auf eine Konzentration von etwa 5 mg / ml Gesamtprotein. </li><li> Gasentladungs ​​löchrigen Kohlen EM-Gitter, Carbon Seite nach oben in einer Vakuumvorrichtung nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Verflüssigen einige Milliliter von Ethan, indem ein Strom von Ethan Gas auf der Innenseite einer mit flüssigem Stickstoff kühlened Aluminiumbehälter. </li><li> Mischen Protein A-konjugierten Goldbezugs Suspension 1: 1 mit Mitochondrien-Suspension und 3 ul sofort zu einer Glimmentladung EM Gitter in Pinzette anzuwenden. </li><li> Platzieren der Pinzette in einem Verglasungseinrichtung, beispielsweise ein hausgemachter Guillotine. Tupfen Sie das überschüssige Flüssigkeit mit einem Keil von Filterpapier (~ 5 Sekunden oder bis keine Flüssigkeit mehr Spreizung) und sofort tauchen die Gitter in flüssigem Ethan durch Loslassen des Auslösers. </li><li> Übertragen Sie das Gitter aus flüssigem Ethan in flüssigen Stickstoff. Während der Übertragung überschüssiges Ethan aus dem Netz mit Filterpapier. Setzen Sie die Spitze einer keilförmigen Stück Filterpapier in die Flüssigkeit Ethan. Da die Flüssigkeit Ethan steigt sanft ziehen Sie das Gitter bis das Filterpapier aber halten Sie es unter die Flüssigkeitsfront. Flüssiges Ethan vom Netz durch Kapillarwirkung entfernt und einmal alle flüssigem Ethan entfernt worden ist, das Netz sofort in flüssigem Stickstoff übertragen. </li><li> Legen Sie die Steingitter in eine Grid-Storage-Box, einend unter flüssigem Stickstoff zu speichern zur späteren Verwendung als angemessen. </li></ol> 3. Aufnahme von Tomographische Tilt Series Der folgende Abschnitt beschreibt, wie Sie und sammeln ein Tomographie Kippserie eines Mitochondrium mit einem Polara Elektronenmikroskop mit einer post-Spalte Energiefilter und CCD-Kamera ausgestattet. Ähnliche Protokolle werden mit allen Kryo-Elektronen Mikroskope mit CCD-oder direkte Elektronendetektor-Kameras eingesetzt wird. <ol><li> Richten Sie das Mikroskop <ol><li> Legen Prüfling zB Graphit und Gold-Inseln auf löchrigen Kohlenstoff-Film. </li><li> Wählen Sie den Suchmodus in Low-Dose-System des Mikroskops. </li><li> Bringen Probe euzentrischen Höhe. Dies ist der Punkt der minimalen XY-Bewegung beim Kippen der Probenhalter. Zentrieren Sie einen Punkt von Interesse bei 0 ° Neigung, kippen die Bühne, um 20 ° und neu zu zentrieren den Punkt durch den z-Höhe zu verändern. Zurück auf 0 ° und wiederholen, bis seitliche Versatz minimiert wird. </li><li> WählenBelichtungsmodus. Wählen Sie die gewünschte Vergrößerung zum Sammeln einer Schichtaufnahme (zB 25,000X auf Detektor ≈ 0,6 nm Pixelgröße Proben). </li><li> Wählen Sie einen kleinen Kondensator Blende (50-70 mm), und wählen Sie eine Punktgröße und Strahlintensität, so dass der Strahl nur breiter als die bildgebenden Gerät und gibt eine Pixel Lesen von E 60 - / Pixel (CCD) oder 14 E - / Pixel / sec (direkte Elektronendetektor, Zählen Modus). </li><li> Zentrum Kondensorapertur. </li><li> Finden Gauß-Schwerpunkt zB Punkt minimal Kontrast. Reset Mikroskop Defokussierung Lesen und richtige Drehpunkte und Drehbearbeitungszentrum nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Zifferblatt in gewünschte Unschärfe-Tomogramm für die Aufnahme. Hinweis: Hohe Defokussierung (8 um) erhöht den Kontrast, sondern reduziert Auflösung, während niedrige Unschärfe-(2-4 um) erhöht Auflösung auf Kosten der Kontrast. </li><li> Über einem leeren Loch, erzeugen eine neue Verstärkungsreferenz und richten Energiefilter nach HerstellerAnweisungen. </li><li> Richten Suche und Belichtungsarten. In Belichtungsmodus zu zentrieren einen Punkt von Interesse und wechseln in den Suchmodus. Wählen Vergrößerung der 1,500X (0,033 um / Pixel Probe auf-Detektor) und Defokussierung von 100 um (für erhöhten Kontrast). Bringen Sie von Interesse zurück zum Zentrum mit Bildverschiebung Spulen. </li><li> Im Suchmodus einstellen Punktgröße und Strahlintensität, so dass der Strahl nur breiter als die bildgebenden Gerät und gibt eine Pixel Lesen von ~ 20 e - / Pixel (CCD) oder ~ 8 e - / Pixel / sec (direkter Elektronendetektor, Zählen Modus). </li></ol></li><li> Das Finden eines guten Probenraum <ol><li> Legen Sie das Gitter mit tiefgefrorenen Mitochondrien in das Elektronenmikroskop bei Temperatur von flüssigem Stickstoff (siehe EM Herstellers). </li><li> Im Suchmodus finden Sie in der Startaufstellung für Bereiche entsprechende Eisdicke und Probenqualität. Werfen Sie einen 6 Sek Suche Bild von vielversprechenden Bereichen um die Eignung für Tomogramm Sammlung zu bestimmen. Both der inneren und äußeren Membran der Mitochondrien sollte bei dieser Vergrößerung sichtbar. </li></ol></li><li> Aufnahme eines Tomographische Tilt Series <ol><li> Sobald eine gute Probenraum gefunden wird, kippen die Bühne ± 60 °, um den maximalen Neigungsbereich, die verfügbar ist, ohne Behinderung der Ermittlung der Belichtung oder Fokus-Bereich durch Gitterstäbe oder Klumpen Eis. </li><li> Auf einem nahe gelegenen Eis gefüllte Loch von ähnlichem Aussehen, um Belichtungsmodus ändern und die Strahlintensität oder Bildaufnahmezeit, so dass jedes aufgezeichnete Bild hat eine Elektronendosis von 30-50 E - / Pixel für CCDs oder 6-8 E - / Pixel / s direkten Elektronendetektoren, Zählen Modus. </li><li> Berechnung der Dosisverteilungsverhältnis (I 0 / I 60) durch Teilen der Elektronenzahl für 1 Sekunde Bild bei 0 ° mit der eines Bild 60 ° erfasst. Dieses Verhältnis beschreibt die Zunahme der Belichtungszeit erforderlich ist, um eine konstante Elektronenzahl pro Bild mit zunehmendem Neigungswinkel (Belichtungszeit = 1 / C zu haltenOS (α) n (I 0 / I 60) = 2 n). Das Verhältnis dient auch als guter Indikator für die Eisdicke. Gute Tomogramme von Mitochondrien in der Regel mit einem I 0 / I 60 = 2,3-2,6 aufgezeichnet. </li><li> Über einem leeren Loch, erwerben eine 1 sec Belichtungsmodus in Bild und beachten Sie die Elektronenzahl pro Å 2. Unter Berücksichtigung der Dosisverteilung Verhältnis, die Berechnung der Gesamtzahl der Bilder, die für einen bestimmten Gesamtelektronendosis aufgenommen werden können (zB &lt;40 E - / A 2 für die Strukturbestimmung &amp; ~ 160 E - / A 2 für Morphologie). </li><li> Bestimmung der geeigneten Neigungsintervall für Tomogramm Sammlung, indem die Gesamtneigungsbereich (zB 120 ° ± 60 ° für) durch die Gesamtzahl der Bilder in 3.3.4 berechnet. </li></ol></li><li> Einrichten und Aufzeichnen einer Schichtaufnahme mit den oben mit geeigneten automatischen Datenerfassungs-Software 3 ermittelten Parameter3, 34. Tilt-Serie sind in der Regel bei ± 20 ° gestartet und gehen durch 0 ° vor Erreichen hoher kippt, um die Informationsinhalte von Low-Neigungs Bilder, die durch die Erhöhung Elektronendosis zerstört wird, zu maximieren. </li></ol> 4. Erstellung und Segmentierung von Tomographische Volumes In diesem Abschnitt wird beschrieben, wie tomographischen Volumen von Mitochondrien aus Kippserie und wie die Volumina für die allgemeine Betrachtungs vorhanden sind erzeugt. <ol><li> Speichern Sie die tomographischen Kippserie zu einem geeigneten Verzeichnis. Generieren eines Bildstapels und die Umwandlung in eine geeignete Dateiformat mit Open-Source-Software wie dm2mrc oder tif2mrc (IMOD-Paket), die .dm3, .dm4 oder TIF-Dateien zu konvertieren MRC-Stacks. MRC-Stacks für tomographische Rekonstruktion mit IMOD 35 erforderlich. Andere Pakete erfordern unterschiedliche Formate. </li><li> Richten Sie die Bilder und erzeugen ein Tomogramm indem Sie die Schritte in der Anleitung beschrieben IMOD ( <ahref=&quot;http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html&quot;&gt;http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ). </li><li> Erhöhen den Kontrast des Schnittbildes mit Hilfe der nicht-linearen anisotropen Diffusionsfilter mit IMOD verteilt. Dieser Filter eignet sich gut für Membranen und Membran-assoziierten Teilchen, wie die ATP-Synthase. </li><li> Zur Visualisierung, manuell Segment das Tomogramm mit kommerziell erhältlichen Programme zB Amira. Zuweisen Voxel entsprechend der inneren oder äußeren Membran und erzeugen eine Oberfläche. Verwendung des Clicker-Option in der EM-Paket-Plugin für AMIRA 36 markieren die Lage der ATP-Synthase-Partikel. </li></ol> 5. Subtomogram Mittelung von ATP-Synthase Dimere und Montage von X-Ray-Strukturen Der folgende Abschnitt beschreibt, wie subtomogram Durchschnittswerte der ATP-Synthase-Dimere erhalten werden kann. <ol><li> Mit den markierten Partikel als Eingabe und einer entsprechenden Software-Paket wie die &quot;Partkel Schätzung für Elektronen-Tomographie-Programm, berechnen subtomogram Durchschnitt. </li><li> Antrag Schätzung vergleichen zwei unabhängig bestimmt subtomogram Durchschnitte durch Fourier-Shell-Korrelation 37. </li><li> Falls verfügbar, Dock bekannten Röntgenstrukturen in den subtomogram Durchschnitt von starren Körper anliegend, entweder manuell oder mit Hilfe der automatischen sequentiellen Docking-Routinen, wie sie im Programm 38 Chimera. </li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die hier vorgestellten Protokoll bietet eine Einführung in Cryo-ET und subtomogram Lung von Mitochondrien, aber im Wesentlichen die gleiche Vorgehensweise kann zu jeder anderen Zellkompartiment oder einer Membran aufgetragen werden. Um die bestmöglichen Daten zu erhalten, kritische Schritte während des Verfahrens sind die Probenvorbereitung, die Tauchgefrierprozess und Datenakquisitionsstrategie. Probenqualität, die für den Erfolg entscheidend ist, hängt von einer optimierten Gefrierprotokoll an geeignete Eisdicke, die aus guten Bildkontrast größter Bedeutung ist zu gewährleisten. Die optimale Datenakquisitionsstrategie hängt von dem Instrument und der Probe. Parameter, die optimiert werden können, umfassen Elektronendosis pro Bild, Neigung und Unschärfe-Schema. Erwerb eine gute Schnittbild eines guten Proben macht alle weiteren Verarbeitungsschritte einfacher und sorgt für ein zufriedenstellendes Endergebnis. Cryo-ET mit subtomogram Mittelung und Atommodell passend kombiniert bietet Details, wie Protein-Komplexe sind in th angeordnetEIR nativen Zellumgebung. Die Technik ist gleichermaßen geeignet für die Untersuchung der Struktur von großen Membranproteinkomplexen, wie Atmungskette-Super (1,7 MDa), ATP-Synthase-Dimere (2x500 kDa), bzw. des Kernporenkomplexes (~ 120 MDA) 8, 9, 17. Die Organisation der ATP-Synthase-Dimere in Zeilen kann nicht durch hochauflösende Techniken wie Röntgenkristallographie, NMR oder Einzelpartikel-Kryo-EM beobachtet werden, da die Dimer-Reihen durch Detergens-Extraktion, die ein notwendiger Schritt bei der Isolierung gestört und Reinigung der Membranproteinkomplexen. Die Anordnung der ATP-Synthase, die in Reihen von Dimeren entlang Cristae Rippen ist ein universelles Organisationsprinzip der Mitochondrien in allen Arten. Die Protonen-Pumpen-Komplexe der Elektronentransportkette, insbesondere Komplex I (NADH-Dehydrogenase), sind in den Membranflächen zu beiden Seiten der Reihen 8 angeordnet,9. Diese Organisation der Atmungskette hat tiefgreifende Auswirkungen auf die mitochondriale Bioenergetik. Wenn die Dimer-Reihen nicht auf das Fehlen von Dimer-spezifische Protein-Untereinheiten bilden, die Zellen aufweisen Generationszeiten länger und reduzierten zellulären Fitness, wie in der in Figur 3 41 gezeigt Hefe-Mutante beobachtet. Mit dem wachsenden Interesse an mitochondrialer Erkrankungen, eine detaillierte Verständnis der molekularen Grundlagen über mitochondrialen Ultrastruktur und Funktion ist von größter Bedeutung. Elektronen Kryo-Tomographie eine Verbindung zwischen Proteinstruktur durch hochauflösende Methoden bestimmt, und die Verteilung und Anordnung dieser Proteine ​​in der Membran in der Größenordnung von Nanometern. Dies macht Kryo-ET ein wesentliches Instrument für das Verständnis der mitochondrialen Struktur und Funktion in Gesundheit und Krankheit. Weitere technische Entwicklungen und Verbesserungen in der Kryo-ET sind Protein-Markierungsstrategien, um die Position zu ermitteln protein Untereinheiten in makromolekulare Komplexe oder die Lage der kleinere oder weniger ausgeprägten Proteine ​​(&lt;0,5 MDa) in Zellen. Darüber hinaus haben Hybrid-EM Verarbeitungsmethoden, die subtomogram Mittelung mit Einzelpartikelanalyse oder Wendel Rekonstruktion kombinieren kürzlich bestimmt Proteinstrukturen zu ~ 8 Å 42, 43. Diese Verarbeitungsverfahren sind derzeit auf gereinigte Proteine, die gut in Eis getrennt sind oder bilden spiralförmigen Baugruppen und sind derzeit nicht für überfüllten zellulären Umgebungen wie Mitochondrien und Cristae Membranen beschränkt. Für die Datenerhebung werden neue Computer-und Hardware-Tools entwickelt, um die automatische Schnittbild Erwerb zu ermöglichen, erhöhen den Bildkontrast und reduzieren insgesamt benötigte Elektronendosis. Die einzige grundlegende Einschränkung in Kryo-ET Strahlung Schädigung der Probe durch den Elektronenstrahl. Dies bedeutet, dass nur sehr geringe Elektronendosen verwendet werden, um jedes Bild einer tomographischen Kippserie aufzuzeichnen, was zu einem schlechten Signal-t werdeno-Rausch-Verhältnis, die letztlich begrenzt die erreichbare Auflösung. Die neue direkte Elektronendetektoren, veröffentlicht weniger als vor einem Jahr, revolutionieren derzeit den Bereich des Einzelpartikel-Kryo-EM 44, 45. Diese neuen Detektoren höheren Kontrast und eine bessere Auflösung bei niedrigeren Elektronendosen. Für Kryo-Elektronentomographie bedeutet dies, dass Kippserie mit kleineren Schrittweiten oder auch Doppelachsenschnittbilder ohne übermäßig hohe Strahlenschäden (ein CCD-Bild entspricht in Elektronendosis bis 5 direkten Elektronendetektor Bilder) gesammelt werden. Die riesigen Datenmengen, die von diesen Detektoren erzeugten ihre eigenen Herausforderungen im Umgang mit Daten, Verarbeitung und Lagerung, die es zu überwinden werden. Außerdem Phasenplatten, die auf ähnlichen Prinzipien wie die routinemäßig in der Lichtmikroskopie verwendet zu arbeiten, um Phasenkontrast zu erhöhen, werden derzeit für die Transmissionselektronenmikroskopie 46, 4 entwickelt7. Damit sollte Schichtaufnahmen näher gesammelt, um zu fokussieren und damit mit einer höheren Auflösung, während zur gleichen Zeit die Erhaltung niedriger Auflösung bietet für die Ausrichtung und Interpretation der tomographischen Mengen notwendig. Zusammengenommen werden diese technologischen Fortschritte stark erweitern die Palette der biologischen Fragen, die durch Kryo-ET angesprochen werden können.

Mitochondrien sind die Kraft-Häuser der Zelle. Durch Umwandeln eines elektrochemischen Protonengradienten über die innere Mitochondrienmembran in chemische Bindungsenergie erzeugt der mitochondrialen ATP-Synthase meisten der ATP, die zellulären Prozesse steuert. Um die Mechanismen der mitochondrialen Energieumwandlung zu verstehen, müssen wir die Struktur des ATP-Synthase in situ zu bestimmen, und um herauszufinden, wie es angeordnet ist und in der inneren mitochondrialen Membran verteilt. Obwohl hochaufgelösten Strukturen der meisten mitochondrialen ATP-Synthase-Komponenten 1-3 und niedriger Auflösung die Karten der ganzen Komplex 4 zur Verfügung stehen, ist es wichtig, die Struktur und die Konformation des Arbeits Enzym in der Membran zu etablieren. Die Verteilung der ATP-Synthase in der inneren mitochondrialen Membran wurde weithin angenommen, zufällig zu sein, aber ein frühes Auffinden 5 und eigenen ersten Ergebnisse 6 angegeben, dass dies nicht ter Fall ist. Nachfolgende Studien von unserer Gruppe und andere 7 bestätigt, dass die ATP-Synthase wird in langen Reihen von Dimeren entlang der eng gekrümmten Rippen der inneren Mitochondrienmembran Cristae 8 angeordnet, während die Protonenpumpen der Elektronentransportkette erscheinen auf beiden Seiten angeordnet sein der Reihen 9. Diese Anordnung hat wichtige Implikationen für die Mechanismen der mitochondrialen Energieumwandlung. Die Technik, die wir verwendet haben, um diese Anordnung zu bestimmen, ist Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET). Kryo-ET ist derzeit die einzige Möglichkeit, die genaue dreidimensionale (3D) Volumen der Zellen, Zellkompartimente und Organellen führt bei Molekularauflösung. Kryo-ET ist besonders geeignet für die Untersuchung großer Komplexe in biologischen Membranen, weil die Membranen scheinen mit gutem Kontrast und sind leicht in 3D-Tomographievolumen verfolgen. Andere Methoden die 3D-Struktur von Zellen oder Organelle, um zu studierenes bieten keine molekularen Detail. Super-Resolution Lichtmikroskopie 10, 11 ist hervorragend bei der Entdeckung der Position oder Abstände zwischen Leucht Etiketten auf Proteine ​​von Interesse mit einer Genauigkeit von zehn nm angebracht, aber es zeigt nicht die Struktur des Proteins selbst, auch bei niedriger Auflösung . Transmissionselektronenmikroskopie von Serienschnitten 12 oder Block-face-Bildgebung mittels Rasterelektronenmikroskopie 13 aus Kunststoff eingebetteten biologischen Proben mit niedriger Auflösung bieten Aussicht auf Zellvolumen, aber ebenfalls nicht verraten molekularen Detail. Rasterkraftmikroskopie 14 kann im Prinzip liefern molekularen oder sogar atomare Auflösung, aber nur an der Oberfläche der Objekte auf einem atomar glatten, festen Träger. Schließlich ist 16 unwahrscheinlich, dass die Struktur von großen, komplexen aperiodischen Objekte wie ganze Zellen oder Zellorganellen in m zeigen Röntgentomographie 15 oder Streuung von intensiven Röntgenpulse von Freie-Elektronen-LaserMOLEKULARE Auflösung in absehbarer Zeit. So werden derzeit gibt es keine Alternative zu Cryo-ET für Studien der 3D-Struktur von Zellen oder Zellorganellen auf der Nanometerauflösung. Kryo-ET ist die Methode der Wahl zur Untersuchung der Struktur und Konformation von Membran-assoziierten Protein Anordnungen des Kernporenkomplexes 17, die Influenza Spike-Komplexe 18 und die Flagellen Motorproteine ​​22, 23, sondern auch die Organisation des gesamten Bakterienzellen 19 und Eingabe von pathogenen Viren, wie HIV in den Zellen 20-23. Kryo-ET ist von unschätzbarem Wert für die Visualisierung filamentöse Proteine ​​und deren Interaktionen in der Zelle, einschließlich der Aktinfilamente 24 oder 25 axonemes. Die Auflösung kann bis 2 nm oder besser durch subtomogram durchschnittlich 26, wobei Teilvolumina der wiederholten, regelmäßigen Zügen sind aus einem tomographischen Volumen von Single-Particle Image Pro Cut und gemittelt verbessert werdenVerarbeitung Techniken. Kryo-ET ist der Erwerb einer Reihe von Projektionsbildern eines dünnen Probe (&lt;250 nm) bei verschiedenen Neigungswinkeln in einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) aufgenommen. Die Probe muss dünn sein, so daß Elektronen, die stark mit Materie wechselwirken, sind nicht mehr als einmal gestreut. Mehrfachstreuung macht die resultierenden Bilder schwer zu interpretieren und verringert den Kontrast. Bilder der ausgewählten Probenbereich relativ zueinander aufeinander ausgerichtet und projiziert in einen 3D-Raum durch ein geeignetes Computerprogramm, Erzeugen eines 3D-Volumens der Probe. Die Ausrichtung der Bilder wird durch Goldbezugsmarkierungen, die mit der Probe vor dem Einfrieren gemischt werden unterstützt. Idealerweise 10 oder mehr gleichmäßig verteilt Bezugsmarkierungen sollte in jedem Bild, eine gute Ausrichtung zu erreichen. Um molekulare Detail zu beobachten, sind Proben Sprung gefroren in flüssigem Ethan, die ihre Mutter hydrierten Zustand bewahrt. Einfrieren in flüssigemEthan ist so schnell (~ 10 5 ° C / s) 27, die Wasser nicht kristallisiert, sondern bleibt in einer verglasten, glasartigen Zustand. Bildung von Eiskristallen Schäden empfindlichen biologischen Strukturen. Da biologische Proben leiden Strahlenschäden, gibt es eine Grenze für die Gesamtanzahl von Streuereignissen kann die Probe zu tolerieren. Bilder werden somit in Niedrigdosis-Modus erworben: Ein Bereich von Interesse ist bei geringer Vergrößerung (1,500X) mit einer Elektronendosis unter 1 e identifiziert - / nm 2 (Suchmodus). Das Bild wird dann bei einer höheren Vergrößerung fokussiert, aus dem Bereich von Interesse (Fokusmodus). Nur wenn ein Bild aufgenommen wird, wird der Bereich von Interesse mit einer höheren Elektronendosis (Belichtungsmodus) bestrahlt. Hier präsentieren wir einen Überblick, wie die Erfassung und Verarbeitung Kryo-Elektronenschichtaufnahmen mit ATP-Synthase-Dimere in der inneren Mitochondrienmembran als Beispiel. Das folgende Protokoll beschreibt, wie Mitochondrien für Kryo-ET vorbereiten, wie Sieund Sammeln eines Neigungs Reihe mit einer bestimmten Gesamt-Elektronendosis, und wie die Neigung Reihe mit einem 3D-Volumen des Bereichs von Interesse zu erhalten, zu verarbeiten. Ein Überblick über das Verfahren ist in Abbildung 1 dargestellt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="961">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Sucrose</td>
			<td style="width:235px;">ROTH</td>
			<td style="width:119px;">4621.2</td>
			<td style="width:379px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Trehalose</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">HEPES</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Zymolase</td>
			<td style="width:235px;">biomol</td>
			<td style="width:119px;">Z1000.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Density gradient medium</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D1556 or P1644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Protein A gold</td>
			<td style="width:235px;">Aurion</td>
			<td style="width:119px;">810.111</td>
			<td>10 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Ethane</td>
			<td style="width:235px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:119px;">P0502S02R0A001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Nitrogen</td>
			<td style="width:235px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:119px;">I4150RG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Consumables</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Filter paper</td>
			<td style="width:235px;">Whatman, GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">1004 090</td>
			<td>Nr 4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Tweezers</td>
			<td style="width:235px;">Dumont</td>
			<td style="width:119px;">T506</td>
			<td>Non-magnetic, pattern #5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">EM combined test grid</td>
			<td style="width:235px;">Plano GmbH</td>
			<td style="width:119px;">S142</td>
			<td>grapite and gold islands on holey carbon film</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Holey carbon grids</td>
			<td style="width:235px;">Quantifoil Micro Tools GmbH or C-flat</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>R2/2 300 Cu mesh&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Cryo grid boxes</td>
			<td style="width:235px;">Plano GmbH</td>
			<td style="width:119px;">160-42</td>
			<td>Alternative home-made metal boxes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Equipment</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Potter</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blender</td>
			<td style="width:235px;">Waring</td>
			<td style="width:119px;">8011S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Glass bead mill - bead beater</td>
			<td style="width:235px;">BioSpec Products</td>
			<td style="width:119px;">1107900-105</td>
			<td>Including 0.5 mm beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Ball-bearing (Balch) homogeniser</td>
			<td style="width:235px;">isobiotec</td>
			<td style="width:119px;">H8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:235px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">46915</td>
			<td>Sorvall RC6+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Glow-discharge apparatus</td>
			<td style="width:235px;">Bal-Tec A.G.</td>
			<td style="width:119px;">CTA 010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Grid vitrification device</td>
			<td style="width:235px;">FEI, Gatan or Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Alternative home-made plunger</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Transmission electron microscope</td>
			<td style="width:235px;">FEI or Jeol</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>300 keV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Direct electron detector (CMOS)</td>
			<td style="width:235px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>4k x 4k pixels, counted mode</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Charge coupled device</td>
			<td style="width:235px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>4K x 4K pixels (alternative to Direct electron detector)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Energy filter</td>
			<td style="width:235px;">Gatan or Jeol</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Software</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:235px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Tomogram acquisition software</td>
			<td style="width:235px;">Gatan, FEI, USCF, or UC-Boulder</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>4 alternatives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Tomogram processing software</td>
			<td style="width:235px;">FEI, UCSF or UC-Boulder</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>3 alternatives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Subtomogram averaging software</td>
			<td style="width:235px;">UC-Boulder, or University of Basel</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>2 alternatives</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Tomogram visualisation software</td>
			<td style="width:235px;">UC-Boulder, FEI, or University of Utah</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>3 alternatives</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">visualisation software plugin</td>
			<td style="width:235px;">Goethe university</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Structure visualisation software</td>
			<td style="width:235px;">UCSF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Numerical calculation software</td>
			<td style="width:235px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.mathworks.de/academia/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of atp synthase dimers in mitochondria by electron cryo-tomography

Elektronen Kryo-Tomographie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, Strukturbiologie, der fähig ist die Visualisierung der dreidimensionalen Struktur von biologischen Proben, wie Zellen, Zellorganellen, Membranvesikel oder Viren molekularen Detail. Um dies zu erreichen, wird die wässrige Probe schnell in flüssigem Ethan, die es in einem nahe-zu-native, tiefgefrorenen Zustand bewahrt verglast. Im Elektronenmikroskop sind Kippserie bei Temperatur von flüssigem Stickstoff, aus dem 3D rekonstruierten Schichtbilder aufgezeichnet. Das Signal-zu-Rausch-Verhältnis des tomographischen Volumen inhärent niedrig. Erkennbar, wiederkehrende Funktionen werden von subtomogram Mittelung, von denen einzelne Teilvolumina werden ausgeschnitten, ausgerichtet und gemittelt, um Lärm zu reduzieren verbessert. Auf diese Weise Maps 3D mit einer Auflösung von 2 nm oder besser erhalten werden kann. Eine Anpassung der verfügbaren hochaufgelösten Strukturen auf die 3D-Volumen erzeugt dann Atommodelle von Proteinkomplexen in ihrer natürlichen Umgebung. Hier zeigen wir, wie wir mit Kryo-Elektronen tomography, um die in-situ-Organisation von großen Membran-Protein-Komplexe in den Mitochondrien zu untersuchen. Wir finden, dass die ATP-Synthase sind in Reihen entlang von Dimeren stark gekrümmten Scheitel der inneren Membran Cristae organisiert, während komplexe I zufällig in den Membranregionen auf beiden Seiten der Reihen verteilt. Durch Mittelung subtomogram eine Struktur der mitochondrialen ATP-Synthase-Dimeres erhalten wir innerhalb der Cristae-Membran.

Elektronen Kryo-Tomogramme Mitochondrien zeigen deutlich die 3D-Morphologie des Organelle (Abbildung 2). Manuelle Segmentierung der Membranen in einer tomographischen Volumen veranschaulicht die Struktur der Cristae im Mitochondrium. Durch Abbilden Mitochondrien von Hefe verschiedenen Knockout-Stämme, die bestimmte Protein-Komponenten fehlen, kann die Wirkung dieser Proteine ​​auf Cristae Morphologie beurteilt durch. 3 zeigt ein Mitochondrium aus einem Hefestamm ohne ATP-Synthase-Untereinheit E. Für die Dimerisierung des mitochondrialen ATP-Synthase wird diese Komponente der ATP-Synthase-Komplex erforderlich ist. Mitochondrien aus diesem Stamm fehlt die normalen Lamellen Cristae Mitochondrien des Wildtyp (Figur 2) und eine Anzahl von inneren Kammern Membran anstelle enthalten. Diese Kammern sind entweder frei von Cristae oder geringe ballonförmigen Membran Einstülpungen (Abbildung 3). In tomograms mit gutem Kontrast, großer mitochondrialen Protein-Komplexe, in diesem Fall ATP-Synthase-Dimere, leicht sichtbar (Figur 4; Film 1). (; Movie 2 Abbildung 5) Die Strukturen der Komplexe können bei 2-3 nm Auflösung von subtomogram Mittelung bestimmt werden. (; Movie 3 6) die durchschnittlichen Volumina zurück in das Tomogramm, um die Organisation der einzelnen Komplexe relativ zueinander und zu anderen Protein-Komplexe in der Membran zu beurteilen platziert werden. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Flussdiagramm, das die Phasen der Elektronen Kryo-Tomographie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> Abbildung 2. Morphologie eines Mitochondrium aus Wildtyp-S. Cerevisiae. Zentral Scheibe durch einen tomographischen Volumen eines Wildtyp S. cerevisiae Mitochondrien (links) und entsprechende Oberfläche-Volumen gerendert (rechts). Die segmentierte Volumen der äußeren Membran wird grau dargestellt und die Volumina der inneren Grenze und Cristae Membranen in hellblau. Von Davies et al 8 angepasst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3. Mitochondrium von einer S. Cerevisiae-Stamm fehlt eine Untereinheit für erforderlichATP-Synthase-Dimerisierung. Scheibe durch tomographische Volumen (links) und oberflächen gemacht Volumen (rechts) einer Mitochondrium von einem Begleit S. Cerevisiae-Stamm fehlt das E für die ATP-Synthase Dimerisierung erforderlich Proteinuntereinheit. Wenn sie mit Figur 2 verglichen wird, das Mitochondrium aus dem mutierten Stamm fehlt die normalen Lamellen Cristae von Wildtyp-Mitochondrien. Stattdessen hat das Mitochondrium viele innere Membran Fächer entweder mit keinem oder Cristae ballonförmigen Cristae. Elektronen Kryo-Tomographie unterstreicht damit Veränderungen in Membranmorphologie durch Gen-Deletionen. Von Davies et al 8 angepasst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig4highres.jpg" width="500" /> Figure 4. Mitochondrium aus dem Pilz P. anserina. tomographischen durch Volumen (links) und die dazugehörigen Oberflächen gemacht Volumen (rechts) einer Mitochondrium vom Fadenpilz P. in Scheiben schneiden anserina. In diesem Schnittbild, werden die Zeilen von 10 nm-Partikel (gelb Pfeilspitzen) über stark gekrümmte Membranrücken in der inneren Membran Cristae (siehe Video 1). Diese Teilchen wurden als ATP-Synthase Dimere subtomogram Lung identifiziert. Von Davies et al. 9 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig5highres.jpg" width="500" /> Abbildung 5. Struktur und Organisation der mitochondrialen ATP-Synthase. Side und Top-Ansicht, die die Elektronendichte eines ATP-Synthase Dimer aus S. c<html> erevisiae wie subtomogram Mittelung mit Einbauatommodelle (links) bestimmt. Inneren Mitochondrienmembran-Vesikel, die die Organisation der ATP-Synthase-Dimere in Reihen (rechts). Die Figur wurde durch die Positionierung des subtomogram Durchschnitt der ATP-Synthase-Dimer in dem segmentierten Volumen der Membran-Vesikel, unter Verwendung der während der Mittelung berechneten Koordinaten erzeugt. Von Davies et al 8 angepasst. Atommodelle: F 1 / Rotor-Ring [PDB: 2WPD] 39 (blau und lila); Oligomycin empfindlich verleihen Protein-OCSP [PDB: 2BO5] 40 (grün); peripheren Stiel Fragment [PDB: 2CLY] 1 mit N-terminalen Reste von [PDB: 2WSS] 2 (gelb und rot) (siehe Video 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig6highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <html> _upload / 51228 / 51228fig6highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Abbildung 6. Isolierte Crista Vesikel aus einer P. anserina Mitochondrien. Scheiben von einem tomographischen Volumen (links) und die dazugehörigen Oberflächen gemacht Volumen (rechts) einer Crista Vesikel aus P. anserina. Proteindichten von der Membran vorsteht sind deutlich sichtbar. Die durch gelbe Pfeilspitzen markiert Dichten ATP-Synthase-Dimere, wie subtomogram Mittel identifiziert. Grüne Pfeilspitzen weisen auf Dichten von Antikörpermarkierung als NADH-Dehydrogenase identifiziert (Komplex 1; Details siehe 9). Segmentierung der Proteindichten zeigt die Organisation der Cristae, mit der ATP-Synthase-Dimere (rot und gelb) Bilden Reihen entlang der stark gekrümmten Cristae Rippen und den NADH-Dehydrogenase-Komplexen (grün) in die Membranbereiche auf beiden Seiten der Reihen (siehe Film 3). Von Davies et al 9.28 / 51228fig7highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Ansicht. Film 1. Kryo-Elektronen-Tomogramm eines P. anserina Mitochondrien. Der Film zeigt aufeinander folgende Scheiben durch eine tomographische Volumen eines Mitochondrium aus dem Fadenpilz P. genommen anserina. Reihen der ATP-Synthase durch gelbe Pfeilspitzen angezeigt. Das oberflächen gemacht, segmentierten Volumen zeigt die Lage der ATP-Synthase (gelbe Kugeln) in Bezug auf die 3D-Struktur Cristae. Außenmembran, grau; inneren Grenzmembran, transparent blau; Cristae-Membranen, opak blau. Von Davies et al 9. Siehe auch Abbildung 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie1.mp4" target="_blank">Klicken Sie hier, um Video anzusehen.</a> Film 2. Subtomogram Durchschnitt der mitochondrialen ATP-Synthase Dimer aus S. Cerevisiae mit Einbauatommodelle. Der Durchschnitt warvon 121 Teilvolumina berechnet. Die Dichte wird auf drei Ebenen Kontur angezeigt: 1s - Mesh, 2 s - Lichtgrau und 3s - dunkelgrau. Atommodelle wurden in der Dichte mit der sequentiellen fit Routine in Chimera ausgestattet. Atommodelle: F 1 / Rotor-Ring [PDB: 2WPD] 39 (blau und lila); Oligomycin empfindlich verleihen Protein-OCSP [PDB: 2BO5] 40 (grün); peripheren Stiel Fragment [PDB: 2CLY] 1 mit N-terminalen Reste von [PDB: 2WSS]. 2 (gelb und rot) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie2.mov" target="_blank">Klicken Sie hier, um Video anzusehen.</a> Von Davies et al 8 angepasst. Siehe auch Abbildung 5. Film 3. Isoliert Cristae Vesikel aus einer P. anserina Mitochondrium. Aufeinanderfolgende Schnitte durch das tomographische Volumen angezeigt, gefolgt von der Segmentoberfläche gerendert Volumen. Protein von der Membran Dichten hervorstehendene sind deutlich sichtbar. Rote und gelbe Dichten ATP-Synthase-Dimere. Gründichten sind NADH-Dehydrogenase (Komplex I), wie durch Antikörpermarkierung bestimmt. Von Davies et al 9. Siehe auch Abbildung 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie3.mpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um Video anzusehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography at JoVE.com

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Wir präsentieren ein Protokoll, wie die Erfassung und Verarbeitung Kryo-Elektronenschichtaufnahmen von ganzen Mitochondrien. Die Technik liefert detaillierte Einblicke in die Struktur, Funktion und Organisation der großen Membranproteinkomplexen in nativen biologischen Membranen.

Visualisierung der ATP-Synthase-Dimere in den Mitochondrien durch Elektronen Cryo-Tomographie

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

visualization-atp-synthase-dimers-mitochondria-electron-cryo

Research

JoVE Journal

Biology

29.4K Aufrufe.  Max Planck Institute of Biophysics.  Wir präsentieren ein Protokoll, wie die Erfassung und Verarbeitung Kryo-Elektronenschichtaufnahmen von ganzen Mitochondrien. Die Technik liefert detaillierte Einblicke in die Struktur, Funktion und Organisation der großen Membranproteinkomplexen in nativen biologischen Membranen. 

Serie: Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Multi-Parameter-Messung der Durchlässigkeit Transition Pore Opening in isolierten Maus-Mitochondrien

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Forschung

Biologie

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

Die konfokale Bildgebung von Einzel Mitochondrial Super Blinkt Intact Herz oder<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Schnelle Isolierung und Reinigung von Mitochondrien für die Transplantation von Gewebe-Dissoziation und Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

Immundetektion von Außenmembranproteinen mittels Durchflusszytometrie von isolierten Mitochondrien

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in cell biology. Many phenomena cannot be explained by in vitro analysis in simplified systems and need additional structural information in situ, particularly in the range between 1 nm and 0.1 &#181;m, in order to be fully understood. Here, electron spectroscopic imaging, a transmission electron microscopy technique that allows simultaneous mapping of the distribution of proteins and nucleic acids, and an expression tag, miniSOG, are combined to study the structure and organization of DNA double-strand break repair foci.

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Visualisierung von miniSOG Tagged DNA Reparaturproteine ​​in Kombination mit Electron spektroskopischen Bildgebung (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecal Glucocorticoid-Analyse: Nicht-invasive Monitoring-Adrenal in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Here, we describe a procedure to visualize and quantify with high sensitivity the endogenous interactions between the endoplasmic reticulum and mitochondria in fixed cells. The protocol features an optimized in situ proximity ligation assay targeting the inositol 1,4,5-triphosphate receptor/glucose-regulated protein 75/voltage-dependent anion channel/cyclophilin D complex at the mitochondria-associated membrane interface.

Studie des endoplasmatischen Reticulum und Mitochondria Wechselwirkungen durch<em&gt; In Situ</em&gt; Nähe Ligatur Assay in fixierten Zellen

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

Visualisierung der DNA Verdichtung in Cyanobakterien durch Hochspannungs-Cryo-Elektron Tomographie

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Biologische Probenvorbereitung durch Hochdruck gefrieren, Mikrowellen-gestützte Kontrastverstärkung und minimale Harz einbetten für Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...