Wir danken Dr. JL. Galzi (UMR7242 CNRS, Illkirch, Frankreich) für seine Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der CNRS, INSERM, Université de Strasbourg, Alsace BioValley und durch Zuschüsse aus Conectus, Agence Nationale de la Recherche (ANR 08 EBIO 014.02) unterstützt Conseil Régional d&#39;Alsace (Pharmadol), Stadtgemeinschaft Straßburg (Pharmadol) ICFRC (Pharmadol), OSEO (Pharmadol), Direction Générale des Entreprises (Pharmadol).

Alle Versuche wurden in strikter Übereinstimmung mit den europäischen Richtlinien für die Pflege von Labortieren (Richtlinie 86/609/ECC Europäischen Gemeinschaften Rates) und die ethischen Richtlinien für die Untersuchung von experimentellen Schmerz in 13 wachen Tieren durchgeführt. Männlich C57BL6 / N-Tac-Mäusen (10 Wochen, 25 bis 30 g) wurden in einem institutionellen Tieranlage mit einer Pflegepersonal zuständig für den Betrieb der Anlage in der Einhaltung von Umweltstandards untergebracht. Die Tiere wurden in Gruppen gehalten werden (maximal fünf Mäusen pro Käfig) unter einer 12 h / 12 h Licht / Dunkel-Zyklus bei einer konstanten Temperatur (21 ± 1 ° C) mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser. Alle Versuche wurden in der gleichen Zeit des Tages (10.00 Uhr bis 04.00 Uhr) mit einem Kollektiv von 16 Mäusen durchgeführt. Spezielle Materialien und Geräte sind in der Tabelle angegebenen Materialien. Ein Fünf-Schritt-Verfahren zu Morphin-induzierte Hyperalgesie und Toleranz zu überwachen Das Protokoll istüber einen Zeitraum von 15 Tagen 1 in fünf aufeinanderfolgenden Schritten (AE) unterteilt. . 1 Mäuse Behandlung (Stufe A, D-7 bis D-5) <ol><li> Griff Mäusen und gewöhnen sie sich frei in den Restrainer eingeben. Diese Vorstufe reduziert Stress - und damit jede Verwechslung mit Stress-induzierte Analgesie zu minimieren - und lässt die Tiere, um die Ermittler gewöhnt werden, Handhabung und Manipulation in die Maus Rainer. Jede Maus wird sanft für 5 min jeden Tag behandelt. </li></ol> . 2 Basal nozizeptive Reaktion (Schritt B, D-4 bis D-1) <ol><li> Messen Schwanzrückzugslatenzen mit dem Schwanz Tauchtest (TIT): <ol><li> Stellen Sie den Thermostat auf 48 ° C </li><li> Die Maus vorsichtig einführen in die Restrainer. Tauchen Sie den hervorstehenden 03.02 Ende seines Schwanzes in das Wasserbad und starten Sie die Chronometer. </li><li> Den Zeitmesser stoppen, sobald die Maus zieht seinen Schwanz aus dem heißen Wasser und notieren Sie die Latenzzeit (in Sekunden). In thE Fehlen einer nozizeptiven Reaktion wird ein 25 Sekunden cut-off verwendet, um Gewebeschäden zu verhindern. </li><li> Ersetzen Sie die Maus in seinem Käfig und testen Sie die nächsten ein bis zum Ende der Serie. </li><li> Wiederholen Sie die nozizeptiven Antwort-Messungen zwei weitere Male, die Messungen von den Tieren in der gleichen Reihenfolge. Das nozizeptive Reaktion Latenz (sek) für jede Maus wird als Mittelwert von drei aufeinanderfolgenden Bestimmungen bestimmt. </li></ol></li><li> Messen mechanischer Antworten mit der Heck Pressure Test (TPT) <ol><li> Sie vorsichtig die Maus in den Restrainer vorstellen und positionieren den Schwanz unter der Kegelspitze der analgesimeter. </li><li> Drücken Sie den Fußschalter gleichmäßig zunehmenden Druck auf den proximalen Teil des Schwanzes bis zum ersten nozizeptiven Reaktion (kämpfen, Quietschen) tritt anzuwenden. Im Moment ist das Tier reagiert, notieren Sie die aktuelle Kraft (in Gramm), die die nozizeptiven Reaktion hervorruft. In der Abwesenheit einer Reaktion wird eine 600 g Grenzwert verwendet, um t zu vermeidenAusgabe Schäden. </li><li> Wiederholen dieser Maßnahme auf die mittlere und distale Teile des Schwanzes der gleichen Maus. Ein Abstand von mindestens 30 Sekunden zwischen Maßnahmen auf einem bestimmten Maus, um die Anpassung oder Verzerrungen zu vermeiden Stress beobachtet. Ersetzen Sie die Maus in seinem Käfig und testen Sie das nächste Tier bis zum Ende der Serie (dh alle Mäuse getestet). Die nozizeptiven Wert (g) für jede Maus wird als Mittelwert von drei Messungen (dh proximalen, mittleren und distalen Teile des Schwanzes jedes Tieres) aufgenommen. </li></ol></li><li> Wiederholen nozizeptiven Prüfung (alle Verfahren unter Schritt 2 beschrieben) an den nachfolgenden Tagen, d-3 d-1. </li></ol> . 3 Messung der Morphin Analgesie (Schritt C, d0) <ol><li> Definieren Sie die beste Kombination von Tieren, die die Auswahl der zwei Gruppen (n = 8 pro Gruppe) von Mäusen mit stabilen und vergleichbare durchschnittliche nozizeptiven Werte, je nachdem, welcher nozizeptiven Modalität (TIT oder TPT) betrachtet werden können. Dieser Wert wird als Grund entnommen werdennozizeptiven Reaktion der Referenz für zukünftige &quot;Saline&quot; und &quot;Morphine&quot;-Gruppen. </li><li> Messung der Körpergewicht jedes Tieres. </li><li> Vorbereitung einer Morphin-Lösung (0,5 mg Morphin pro ml) in einer sterilen physiologischen Kochsalzlösung (NaCl 0,9%) für die subkutane Verabreichung (5 mg Morphin pro kg Körpergewicht des Tieres). </li><li> Messen Sie die nozizeptiven Latenz (als Zeitpunkt 0 genommen) für jede Maus sowohl von &quot;Saline&quot; und &quot;Morphine&quot; Gruppen in der TIT (alle Schritte unter 2.1 oben). Dann messen Schmerzempfindung in der TPT (alle Schritte unter 2.2 oben). </li><li> Spritzen subkutan Morphin (in der Regel 0,25 ml einer 0,5 mg / ml Morphin-Lösung pro 25 g Maus Gewicht) und Kochsalzlösung (0,25 ml pro 25 g Maus Gewicht) auf die &quot;Morphium&quot; und &quot;Kochsalzlösung&quot;-Gruppe. </li><li> Messen Sie nozizeptiven Werte auf der TIT und TPT (alle oben unter 2.1 beschriebenen Verfahren die Schritte bzw. 2.2) über einen Zeitverlauf (bei 30 min interval) zu beurteilen Morphin (5 mg / kg) induzierte Analgesie: <ol><li> Nach 30 min nach der Injektion, messen Sie die nozizeptiven Antwort (Einzelbestimmung) für jede Maus der &quot;Saline&quot; und &quot;Morphine&quot; Gruppen, mit der TIT dann die TPT. </li><li> Dann bei allen Mäusen messen nozizeptiven Reaktion Werte (TIT und TPT) zu den Zeitpunkten (in Std.): 3,5 1-1.5-2-2.5-3 und Nacheinspritzung. </li></ol></li></ol> 4 Chronische Behandlung mit Morphin - Morphin-induzierte Hyperalgesie. (Schritt D, D1 bis D6) <ol><li> Am Tag: d1 <ol><li> Messen nozizeptiven Reaktion Werte auf der TIT und TPT, wie oben beschrieben (Schritte 2.1 und 2.2). Sorgfältig mit Anmerkungen versehen Rückzugslatenzen und Druckgrenzen für jedes Tier. </li><li> Eine frische Morphin-Lösung, wie in Schritt 3.2 beschrieben. </li><li> Spritzen subkutan Morphin (5 mg / kg KG) auf die gesamte &quot;Morphine&quot;-Gruppe und physiologischer Kochsalzlösung (0,25 ml pro 25 g Maus Gewicht) auf die &quot;Saline&quot;-Gruppe. Lassen the Tiere ruhen, bis zum nächsten Tag. </li></ol></li><li> Am Tage: D2, D3, D4, D5 und D6, die unter Abschnitt 4.1 beschriebenen Vorgänge wiederholen </li></ol> . 5 Beweise für Schmerztoleranz (Schritt E; d7) <ol><li> Bewerten Morphin-induzierte Analgesie nach dem bereits in Abschnitt 3 dargelegt Zeitverlauf Paradigma. </li></ol> 6. Datenerfassung und statistische Analysen <ol><li> Bewertung der Basal Nozizeptive Antwortwerte (Stufe B) <ol><li> Berechnen für jeden Tag (über den D-4 bis D-1 Periode) die Durchschnittswerte ± SEM (n = 8) für die basale nozizeptiven Reaktionen ab TIT und TPT in dem &quot;Saline&quot; und &quot;Morphin-Gruppen ergab. </li><li> Grundstück bedeuten basalen nozizeptiven Werte als Funktion der Zeit (Tag) für beide Gruppen Abbildung 2. </li></ol></li><li> Analyse von Morphin Analgesie Zeit-Gänge-Days d0 (Schritt C) und D7 (Schritt E) <ol><li> Berechnen Sie, zu jedem Zeitpunkt nach MorphinInjektion, die Durchschnittswerte ± SEM (n = 8) für nozizeptiven Reaktionen ab TIT (in sec) und in jeder Gruppe lieferte TPT (in g). </li><li> Grundstück bedeuten nozizeptiven Reaktion Werte als Funktion der Zeit für die &quot;Saline&quot; und &quot;Morphine&quot; Gruppen am Tag 0 Abbildung 3 und Abbildung 5 7 Tage. </li></ol></li><li> Entwicklung von Morphin-induzierten Hyperalgesie (Schritt D) <ol><li> Berechnen für jeden Tag (im d0-d7 Behandlungsperiode) die Durchschnittswerte ± SEM (n = 8) für die basale nozizeptiven Reaktion Werte von TIT und TPT in dem &quot;Saline-behandelten&quot; und &quot;Morphin behandelten Gruppen ergab. </li><li> Grundstück bedeuten basalen nozizeptiven Reaktion Werte als Funktion der Zeit (Tag) für die &quot;Saline-behandelten&quot; und &quot;Morphin behandelten Gruppen Abbildung 4. </li></ol></li><li> Beweise für Analgesic Tolerance (Schritte C und E) <ol><li> Bestimmen Sie aus dem Morphin Zeitverlauf experiment durchgeführt bei d0 Abbildung 3 der Zeitwert (oder Zeitbereich) für Morphin erforderlich, um eine maximale analgetische Reaktion zu induzieren. </li><li> Nehmen Sie diesen Wert (in der Regel 30 min) als die Referenzzeit auf d7 Abbildung 5 schätzen die Schmerzempfindung Baseline-Wert (Kochsalzlösung behandelten Gruppe) und der tatsächlichen analgetische Reaktion (Morphin behandelten Gruppe), um akute Morphin. </li><li> Nozizeptive Werte zum Zeitpunkt 30 min von Morphin Zeitverlauf Experimente an d0 und d7 für die Kochsalzlösung behandelten und Morphin behandelten Gruppen durchgeführt genommen, so dargestellt, als Histogramme Abbildung 6. </li><li> Statistik: Analysieren von Daten mit Einweg-ANOVA mit wiederholten Messungen. Die Faktoren der Veränderung waren Behandlung (zwischen Subjekten) und Zeit (im Betreff). Um die Unterschiede in den einzelnen Gruppen separat zu prüfen, wurde ANOVA mit wiederholten Messungen durchgeführt. Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurden mit ungepaarten t-Test oder gepaarten t-Test, wenn angemessen. </li></ol></li><li> Das Signifikanzniveau bei p &lt;0,05 festgelegt. Alle Statistische Analysen werden mit Hilfe der StatView Software. </li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

<html> Kritische Schritte Wahl des Tiermodells für Nozizeption Messungen Variabilität in nozizeptiven und analgetische Sensibilität der Mausstämme wurde (Bewertungen 14-16) Bewertungen mit verschiedenen Schmerzmodellen, die sich in ihrer Genese untersucht (nozizeptiven, entzündlichen, neuropathischen), Modalität (thermische, chemische, mechanische), Dauer (akut, Tonic, chronisch) und Ort der Verabreichung (kutane, subkutane, viszerale). Im Vergleich zu anderen Stämmen C57BL/6J (&quot;J&quot; für Jackson Laboratory) Mäusen wurde ein beliebtes Tiermodell für die Schmerzstudien, da sie eine hohe Grundempfindlichkeit nozizeptiven 17,18 und eine moderate analgetische Reaktion auf Opiate 14,19 ausstellen. Nach chronischer Morphinbehandlung, sie entwickeln auch signifikante analgetische Toleranz 20,21, 21,22 Hyperalgesie und Abhängigkeit 20,23. nt &quot;&gt; Hier wurden Experimente an Mäusen durchgeführt C57BL/6N Tac (&quot; N &quot;für National Institute of Health und&quot; Tac &quot;für Taconics Bauernhof), die mit einem separaten Zweig der Linie B6 gehören. Obwohl C57BL / 6 Mäuse wurden lange als austauschbar betrachtet Neuere Studien weisen signifikante Unterschiede im Verhalten zwischen C57BL/6J und C57BL/6N Stämme 24. Insbesondere die geringere Empfindlichkeit der drei C57BL/6N Subkulturen (einschließlich eines Tac), um thermische akuten Schmerzen können als eine angesehen werden, Vorteil für die Prüfung dieser Phänotyp. Männliche Mäuse wurden als die überwiegende Mehrheit der Schmerzstudien ausgewählt, mit Mäusen als Tiermodell, sind auf jugendliche Männer 25 durchgeführt. In unseren Händen, sofern sie robuste und reproduzierbare Daten, wenn von den Schmerzmitteln oder Hyperalgesie Punkten untersucht. Gelegentlich, bemerkten wir eine Tendenz für C57BL/6N Weibchen variabler Antworten sowohl in den TIT und TPT Tests liefern. Obwohl diese Beobachtungreflektieren natürliche Schwankungen an den Hormonstatus der Frauen verbunden, Gesamt Mechanismen, die Geschlechtsunterschiede in Schmerz und Analgesie nach wie vor umstritten. Einige Aspekte dieser heiße Debatte wird kurz in den nächsten &quot;Einschränkungen der Technik&quot; Abschnitt vorgestellt werden. Tier Gewöhnung Die Mäuse wurden zunächst erlaubt während einer Woche daran gewöhnt, die Tierhaltung zu bekommen. Ähnlich wie bei jedem anderen Verhaltensstudie, Test wurde nach einer 3-tägigen Eingewöhnungszeit-(Abbildung 1, Schritt A) durchgeführt. Wie nozizeptiven Tests sind empfindlich auf Stress, kann zunächst Maßnahmen mehr Latenzen als die folgenden zu geben, vor allem in nicht-Mäusen gewöhnt 26,27. Die Gewöhnung Schritt ermöglicht auch die Gewinnung von stabiler nozizeptiven Reaktion Werte innerhalb des gleichen Tages und zwischen den Tagen 2 und 4. Um zirkadiane Effekte auf nozizeptiven und analgetische reduzieren28,29 Empfindlichkeit wurden alle Prüfungen von 10.00 Uhr bis 04.00 Uhr durchgeführt. Auswahl des nozizeptiven Tests Nozizeptive Tests verwenden entweder thermische, mechanische, chemische oder elektrische Reize (26,27,30 Kritik. Ihre Wahl ist entscheidend, da verschiedene nozizeptiven Modalitäten kann durch verschiedene Nozizeptoren und Fasern 18,31,32 verarbeitet werden. Wir haben uns für den Schwanz Tauchprüfung (TIT) 33, eine modifizierte Version des klassischen Tail-flick-Test von D&#39;amour und Smith 34 entwickelt und den Schwanz Druckprüfung (TPT), von Randall und Selitto 35 angepasst, als Beispiele für thermische und mechanische Modalitäten zu Morphin-induzierte Analgesie, Hyperalgesie und Toleranz in Mäusen untersucht. Beide Tests wurden häufig bei Ratten verwendet. Eine Sperrzeit systematisch definiert, zu vermeiden oder zu begrenzen das Risiko von Gewebeschäden. Morphin-Induktioned Analgesie, Hyperalgesie und Toleranz Morphine, die prototypische mu-Opiat-Agonist, wurde hier sowohl bei Menschen und Mäusen 1,2,36 ausgewählt, da es ein starkes Schmerzmittel und OIH-Induktor. Morphine analgetische Potenz ist bekannt, dass mit Mausstämme, Verabreichungswege und nozizeptiven Modalitäten variieren. In C57BL / 6 Mäusen wird eine zuverlässige Analgesie in der Regel nach der subkutanen Injektion von Morphin in der 1-20 mg / kg Dosisbereich 14,21 erhalten. Dementsprechend haben wir uns zu einer akuten Analgesie studieren nach einer einzelnen Anwendung (sc) von Morphin bei 5 mg / kg, in der Nähe seiner ED 50-Wert (7-20 mg / kg) aus der thermischen Nozizeption 19,21 bewertet. Morphinverabreichung wiederholt wird oft mit analgetischen Toleranz und Hyperalgesie (eine verschlimmert Empfindlichkeit auf schmerzhafte stimul (entweder von einer Rechtsverschiebung der Dosis-Wirkungs-Kurve oder einer Abnahme analgetische Reaktion Amplitude oder Dauer belegt) begleiteti belegt von einer Abnahme der basalen nozizeptiven Wert). Beide unerwünschte Erscheinungen hängen von Nagerarten, der Art des Opiat-Verbindung, die ausgewählt wird, und die Dosierung auf die Behandlungsdauer und nozizeptiven Modalitäten 21. Beispielsweise experimentellen Paradigmen Toleranz und Hyperalgesie studieren bestehen tägliche Verabreichung von hohen und konstanten (20 bis 40 mg / kg pro Tag) 22 oder eskalierenden (bis zu 50 oder sogar 200 mg / kg) 20,21 Morphindosen. Dementsprechend gefördert wir die Entwicklung von Hyperalgesie und Toleranz in C57BL / 6 Mäusen durch tägliche Verabreichung Morphin (5 mg / kg; sc) über eine 8-Tage-Frist. Diese moderate Dosis Morphin wurde über höhere, besser zu imitieren Klinikeinsatz bevorzugt. Aus TIT Betriebs Fenster Set Eine mögliche Fallstrick in TIT vielleicht die Rolle der Schwanz in der Thermoregulation von Nagetieren 26,37 bezogen werden. Als Umgebungstemperatur ist ein wichtiger Faktor in nociceptive Reaktion Variationen sollte konstant über Experimente 38 gehalten werden (hier 21 ° C). Intensität der Wärme wird in der Regel bis zu einer nozizeptiven Reaktion innerhalb von 5 bis 10 Sek. 27 erkennen gesetzt. Tatsächlich kann das Risiko größer Latenzzeiten für die Überwachung Tierbewegungen nicht mit dem nozizeptiven Reiz zu erhöhen, wohingegen kürzere kann die Differenzleistung des Tests zu reduzieren. Wir führten TIT Messungen bei einer festen Temperatur von 48 ° C. Schwanzrückzugslatenzen waren knapp 9 Sek. (basal nozizeptiven Wert) und variierte von 4 Sek. (Hyperalgesie), um 25 Sekunden (maximal Analgesie; abgeschnitten). Neben praktischen Gründen Messungen nozizeptiver Ansprechwerte bei einer festen Temperatur kann von vornherein um das gleiche Repertoire von Nozizeptoren und Schaltungen, wodurch die Interpretation der Daten zu erleichtern. Mögliche Änderungen Optimierung der TIT Betriebsfenster für Analgesie und OIH MeasureMents Konzentriert man sich auf eine analgetische Reaktion können niedrige Ausgangswerte (höhere Wärmeintensität) den Nachweis einer Verzögerung in der Reaktion begünstigen. Im Gegenzug, um die Folge einer schmerzhaften Reiz oder die Entwicklung von OIH, höhere Ausgangswerte (untere Wärmeintensität, hier 48 ° C) berücksichtigt aber die Detektion von schneller Antworten zu erleichtern Abbildung 4. Obwohl wir gefunden Morphin bei 5 mg / kg eine günstige Dosis, um eine robuste analgetische Reaktion Abbildung 3 zu induzieren und zu fördern (nach wiederholter Verabreichung) erhebliche Hyperalgesie Abbildung 4 kann die Dosierung angepasst wie zuvor (Critical Schritt genannt werden: Morphin-induzierte Analgesie, Hyperalgesie und Toleranz). Zum Beispiel können niedrigere Dosen verwendet werden, um Analgesie Amplitude (und damit die Vermeidung von Cut-off-Grenzen) zu reduzieren, während höhere Dosen gewählt, um Hyperalgesie Beginn beschleunigen und ihre Amplitude werden kann. OveRall, Optimierung der &quot;nozizeptiven Fenster&quot; sollte auf den genetischen Hintergrund von Mäusen untersuchten angepasst werden und berücksichtigen die Möglichkeit der Beteiligung der unterschiedlichen Anordnungen von Nozizeptoren und Schaltungen. Alternative Opiat-Agonisten (Fentanyl, Remifentanil) Obwohl die meisten klinisch verwendeten Opiate Ziel der mu-Opioid-Rezeptor als Agonisten, unterscheiden sie sich deutlich in Bezug auf ihre pharmakologischen Eigenschaften in vitro und in vivo. Zum Beispiel, Remifentanil und Fentanyl, ganz im Gegensatz zu Morphin, so verhalten, als volle Agonisten und zu fördern Internalisierung der mu-Opioid-Rezeptoren 39. Opiat-Analgetika wie Morphin und Fentanyl haben Halbwertszeiten im Bereich von 40 Stunden, während Remifentanyl hat ein ultra-kurzen Halbwertszeit von mehreren Minuten 41. Beim Menschen ist beste Beweis für OIH von Patienten, die während der Operation Opiate erhalten, darunter kurzwirksamen compounds wie Remifentanil 2,42. So kann Fentanyl und Remifentanil wertvolle Werkzeuge zu sein, die Entwicklung von Hyperalgesie und Toleranz in Mäusen unter TIT und TPT Paradigmen zu studieren. Alternative Formen der Induktion von OIH (chronische vs akute Verabreichung) OIH wird bei Menschen und Tiermodellen als Folge der Opiat-Verwaltung zu sehen, ob bei sehr niedrigen oder extrem hohen Dosierungen 1,2. Wir berichten hier über OIH Entwicklung nach chronischer Behandlung von Mäusen mit moderaten Dosen von Morphin. Mehrere Tage der Behandlung von C57BL/6N Mäuse waren notwendig, eine klare und reproduzierbare hyperalgetische Zustand Abbildung 4 Tagesmorphiumspritzen adäquat mit implantierten Morphin Pellets ersetzt werden Beweis:. Bei ihrer Entfernung, sowohl thermische Hyperalgesie und mechanischer Allodynie wurden bereits in Mäusen berichtet 43. Infusion von Opiaten durch eine osmotische Mikropumpe ist eine weitere Möglichkeit,<html> 44. Bei Nagetieren langlebige Hyperalgesie ist auch erreichbar nach akuter Verabreichung von Fentanyl unter Verwendung eines Protokolls imitiert die Verwendung dieser mu-Opioid-Agonisten in der Humanchirurgie 36,45,46. Grenzen der Technik Tierarten und Modelle für Schmerzen Vergleichende Untersuchungen von zahlreichen Mausstämme legte Beweise für große Schwankungen in nozizeptiven Reaktionen auf schmerzhafte Reize 17,31,47 und in OIH Spiegel nach 4 Tagen Behandlung mit Morphin-22. Ob Mechanismen in Tiermodellen (Mäuse und Ratten) zugrunde liegenden Schmerzverarbeitung und Modulation sind für Patienten mit chronischen Schmerzen relevant bleibt ein grundlegendes und öffnete Frage. So sollte viel Vorsicht in der Interpretation der Tierdaten und ihre prognostische Validität für den Menschen 16 bezahlt werden. Geschlechtsunterschiede in Schmerz und Analgesie ntent &quot;&gt; Die präklinischen Studien an Tiermodellen für Schmerzen haben, auf die männliche Nagetiere 16,25,48 durchgeführt worden. Trotz dieser Selektionsbias, war der Blick auf die aufstrebenden Männer als besser Responder zu Opiatanalgetika 49,50, weniger anfällig betrachten, um Opioid entwickeln Hyperalgesie 51,52 und toleranter gegen Morphinanalgesie 53 als ihre weiblichen Kollegen (Review 54). jedoch Geschlechtsunterschiede im Hinblick auf die Schmerzwahrnehmung und Schmerzmitteln Wirksamkeit nicht so wieder &#39;eine one size fits all &quot;-Paradigma. Tat eine Fülle von Daten nun an, dass zahlreiche Variablen kann die Größe und Richtung des Geschlechts Unterschiede wie Opioid Wirksamkeit und Selektivität, nozizeptiven Assay genetischen Hintergrund, Alter, Gonado-hormonelle Status oder soziale Interaktion 48,54 beeinflussen. Beim Menschen, der klinischen Schmerz ist bei Frauen häufiger, aber ob diese Tatsache spiegelt tatsächlichen Geschlechtsunterschiede bleibt umstritten 48,55,56. For Beispiel globale Analyse von fünfzig klinischen Studien zeigte keine signifikanten Unterschiede in der analgetischen Eigenschaften zwischen den Geschlechtern in der Erwägung, Meta-Analysen auf die Patienten-kontrollierten Probanden zeigte auf eine deutlich größere Opioid Wirksamkeit bei Frauen 57. Letztere Beobachtung, die deutlich kontrastiert mit dem, was war bei Nagetieren gefunden, stellt sich erneut mehrere Fragen über den Ursprung für solche Abweichungen 16,48,55,57. Insgesamt Geschlechtsunterschiede in Analgesie existieren und Verdienst weiter konzentrieren sich auf zugrunde liegende Mechanismen und klinische Implikationen. Über nozizeptiven Tests Die Schwanzrückzugstest ist eine Wirbelsäulenreflex aber es kann unter supraspinalen Einflüsse 58 sein. TIT ist relativ leicht, an Ratten durchzuführen, erfordert aber mehr Erfahrung bei Mäusen. Eine mögliche Schwierigkeit ist es, die Maus in eine richtige Körperhaltung ohne eine unerwünschte Belastung zu erhalten. Das vorgeschlagene Protokoll kann entsprechend eingestellt werden,Kohortengröße. 16 Tiere (8 Kontrolle und 8 behandelt) werden leicht so weit wie Messung ihrer basalen nozizeptiven Reaktion Werte (mit TIT, dann TPT für die gesamte Serie von Mäusen) unter Sorge verwaltet. Überwachung Analgesie Zeitkurse erfordert die Einrichtung einer genauen Zeitplan und die Auswertung der maximalen Anzahl der Tiere, die getestet werden können (TIT, dann TPT) im verliehene Zeitintervall (hier 30 min). Die ganze Gruppe von Tieren kann somit in Untergruppen unterteilt werden, damit die Versuchs kinetische Einschränkungen zu beachten. Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehender / Alternativmethoden OIH bei Ratten im Vergleich zu Maus Die Ratten wurden intensiv genutzt, um Opioid-Analgesie, Hyperalgesie und Toleranz zu studieren, nach akuter oder chronischer Opiat-Verwaltung 46,59-61. In der Tat, für einige praktische Gründe, können sie überlegen betrachtet werdenMäuse als Tiermodell für die Schmerzexperimente 16,61. Bis vor kurzem die Erzeugung von gentechnisch veränderten Ratten war jedoch kein einfaches Verfahren. Wie zahlreiche gentechnisch veränderte Mausstämme sind bereits verfügbar, bietet unser Modell die Möglichkeit, den Beitrag der einzelnen Gene in zahlreichen OIH und Toleranzentwicklung in Mäusen untersucht. TIT und TPT im Vergleich zu anderen nozizeptiven Tests TIT ist eine Variante der Tail-flick-Test, der offensichtlichste Unterschied ist die Stimulationsbereich. Im Gegensatz zu Strahlungswärme, Eintauchen des Schwanzes in heißes Wasser führt zu einer schnellen und gleichmäßigen Erhöhung seiner Temperatur. Im Vergleich zu anderen Formen der thermischen Nozizeption Tests (Hot-Platte oder Hargreaves-Tests), bietet TIT ziemlich reproduzierbare Ergebnisse zwischen und innerhalb der Themen. TPT ist ein sehr beliebter Test für die Untersuchung der mechanischen Schmerzempfindung 26,27,35, die wahrscheinlich beinhaltetdeutliche nozizeptiven Fasern und Molekularwandler dann TIT 32. Es bietet schnelle und verlässliche Messungen 59, sondern erfordert einige Erfahrung aus der Experimentator-und Großtier Kohorten. Als Alternative zu der analgesimeter in der vorliegenden Studie, andere Verfahren oder eine Vorrichtung verwendet, die sich auf Dehnungsmessstreifen nicht vorhanden sind (Überprüfung 27). TPT ist am besten geeignet für die Untersuchung mechanischer Hyperalgesie wohingegen von Frey Filamente werden in der Regel übernommen, um mechanische Allodynie (27 Bewertungen) zu bewerten. Zukünftige Anwendungen oder Anfahrt nach Beherrschung dieser Technik Die experimentelle OIH / Toleranz Modell wir hier kann ähnlich genetisch veränderte Mäuse, um die Rolle einzelner Gene in der Modulation von Schmerz bewerten angepasst werden. Es bietet auch eine Modellsystem, um die Wirksamkeit von potentiellen therapeutischen Mitteln zu untersuchen, um chronische Schmerzen zu lindern.

Opioid-induzierte Hyperalgesie (OIH) und analgetische Toleranz begrenzen die klinische Wirksamkeit von Opiaten bei Tieren und Menschen 3.1. Die Beteiligung von pro-inflammatorischen 4,5 oder von pro-nozizeptiven (Anti-Opioid) 6,7 Systeme werden derzeit erforscht Hypothesen. Die Aufklärung der Mechanismen OIH und Toleranz zugrundeliegenden erfordert eine Kombination von in-vivo-und in vitro-Methoden unter Verwendung geeigneter Tiermodelle, Versuchsprotokolle und molekularen Werkzeugen. Verhaltenspharmakologie ist der dominierende Paradigma zu überwachen und zu quantifizieren, analgetische und Hyperalgesie-Staaten bei Labortieren (Ratten, Mäuse). Die Anwendung einer schädlichen Reiz (thermische, mechanische oder chemische) zu einem bequemen Körperteil (Hinterpfote, Schwanz) des Tieres führt zu einem Rückzug nozifensiven, die leicht erzielt werden kann. Wir schlagen hier einen methodischen Ansatz zur Induktion, Aufnahme und Quantifizierung OIH undToleranz in Wildtyp-Mäusen, mit den Schwanz-Immersions-und Heckdruckprüfungen. Das Verfahren ermöglicht eine einfache, empfindliche und reproduzierbare Bestimmung der thermischen und mechanischen nozizeptiven Reaktionswerte bei Mäusen. Wie im Video gezeigt, Protokoll, C57BL / 6 Mäuse erleben signifikante Hyperalgesie nach chronischer Morphin Verwaltung und Aufrechterhaltung dieser für mehrere Tage. Beide thermischen und mechanischen nozizeptiven Werte werden deutlich reduziert, im Vergleich zur Baseline-Messungen auf naive Tiere. Darüber hinaus ermöglicht unsere Versuchsaufbau zu überwachen, die neben der Entwicklung von OIH, dem Niedergang der analgetische Reaktion auf Morphin (Toleranz). Präsentiert Daten unterstützen die Ansicht, dass Hyperalgesie und Toleranz kann es sich um gemeinsame zelluläre und molekulare Mechanismen 8,9, obwohl dies in der Literatur 1,10-12 umstritten. Schließlich kann dieses Protokoll ähnlich wie bei gentechnisch veränderten Mäusen, um die Rolle einzelner Gene in der Modulation angepasst werden bewertention von Schmerzen. Es bietet auch eine Modellsystem, um die Wirksamkeit von potentiellen therapeutischen Mitteln auszuwerten Opiat analgetische Wirkung zu verbessern.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="879">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="34" rowspan="2" style="height:34px;width:220px;">Name</td>
			<td rowspan="2" style="width:231px;">Company</td>
			<td rowspan="2" style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td rowspan="2" style="width:291px;">Comments/description</td>
		</tr>
		<tr height="17">
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">C57BL/6N Tac mice</td>
			<td style="width:231px;">Taconic, Ry, Denmark</td>
			<td style="width:139px;">C57BL/6N Tac B6-M</td>
			<td style="width:291px;">Male mice (25-30g)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Morphine hydrochloride</td>
			<td style="width:231px;">Francopia, Paris, France</td>
			<td style="width:139px;">CAS n&#176; 52-26-6</td>
			<td style="width:291px;">Delivered with special authorization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Syringes (Terumo)</td>
			<td style="width:231px;">Dutscher, Brumath, France</td>
			<td style="width:139px;">050000</td>
			<td style="width:291px;">Polypropylene; Sterile; Volume : 1 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Needles (Terumo)</td>
			<td style="width:231px;">Dutscher, Brumath, France</td>
			<td style="width:139px;">050101</td>
			<td style="width:291px;">G26 &#189; (Terumo reference : NN2613RO1)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Mouse restrainer</td>
			<td style="width:231px;">Home-made</td>
			<td style="width:139px;">-</td>
			<td style="width:291px;">Two metallic grids (5x11cm) assembled with adhesive tape and staples.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Thermostated water bath GR150</td>
			<td style="width:231px;">Grant Instruments, Cambridge, UK</td>
			<td style="width:139px;">GP 0540003</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Analgesimeter</td>
			<td style="width:231px;">Panlab, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:139px;">LE 7306</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:220px;">Kaleidagraph software</td>
			<td style="width:231px;">Synergy software, Reading, PA, USA</td>
			<td style="width:139px;">Kaleidagraph 4.03&#160;</td>
			<td style="width:291px;">Scientific graphing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">STATview software</td>
			<td style="width:231px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:291px;">Free download; Statistics</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of morphine-induced hyperalgesia and analgesic tolerance in mice using thermal and mechanical nociceptive modalities

Opioid-induzierte Hyperalgesie und Toleranz wesentlich beeinflussen, die klinische Wirksamkeit von Opiaten, wie Schmerzmittel bei Tieren und Menschen. Die molekularen Mechanismen, die beide Phänomene sind nicht gut verstanden und ihre Erläuterung soll aus der Studie von Tiermodellen und von der Gestaltung der entsprechenden experimentellen Protokolle nutzen. Wir beschreiben hier einen methodischen Ansatz zur Induktion, Erfassung und Quantifizierung von Morphin-induzierte Hyperalgesie sowie Nachweis analgetische Toleranz, mit den Schwanz-Immersions-und Heckdrucktests in Wildtyp-Mäusen. Wie im Video gezeigt wird, wird das Protokoll in fünf aufeinanderfolgenden Stufen unterteilt. Handhabung und Gewöhnungsphasen ermöglichen eine sichere Bestimmung der basalen nozizeptiven Reaktion der Tiere. Chronische Morphinverabreichung induziert signifikante Hyperalgesie, wie durch einen Anstieg sowohl thermische und mechanische Empfindlichkeit dargestellt, während der Vergleich der Analgesie Zeit-Kurse nach akuter oder repeated Morphinbehandlung zeigt deutlich die Toleranzentwicklung durch einen Rückgang der analgetische Reaktion Amplitude manifestiert. Dieses Protokoll kann in ähnlicher Weise genetisch veränderte Mäuse, um die Rolle einzelner Gene in der Modulation der Nozizeption und Morphinanalgesie bewerten angepasst werden. Es bietet auch eine Modellsystem, um die Wirksamkeit von potentiellen therapeutischen Mitteln untersuchen Opiat analgetische Wirksamkeit zu verbessern.

Bewertung der Basal Nozizeptive Werte von Naive Mäuse (Stufe B) TIT und TPT wurden nacheinander auf die gesamte Gruppe von Mäusen (n = 16) aufgebracht, wodurch Durchschnittswerte nozizeptiven Reaktion. Beste Kombination von Tieren erlaubt eine nachträgliche Definition von zwei Gruppen (n = 8) von Mäusen, die als Saline und Morphine, die ähnliche und stabile Grund nozizeptiven Werte anzuzeigen Abbildung 2. Die Gleichwertigkeit der beiden Gruppen ist gültig unabhängig von der nozizeptiven Test ( TIT: 2A; TPT: Fig. 2B), die gewählt wurde. Zeitkurs für Morphin Analgesie an Tag 0 (Stufe C) Morphinanalgesie wurde nach einer einzelnen Injektion (sc), Morphin (5 mg / kg) in naive Mäuse mit sowohl TIT 3A und 3B TPT ausgewertet. In beiden Tests, statistische Analysen mit einer ANOVA mit wiederholten Messungen Reveal dass es eine signifikante Wechselwirkung zwischen Behandlung und Zeit für TIT (F (7, 98) = 72, p &lt;0,001) und TPT (F (7, 98) = 31, p &lt;0,001). TIT und TPT Datenanalysen mittels ANOVA mit wiederholten Messungen zeigen, dass es keine Wirkung der Salzinjektion (F (7, 49) = 0,49, p&gt; 0,05) und F (7, 49) = 1,85, p&gt; 0,05 für jeweils TIT und TPT Tests), während Morphininjektion induziert eine starke Analgesie bei Mäusen (F (7, 49) = 92,46, p &lt;0,001) und F (7, 49) = 34,37, p &lt;0,001 für jeweils TIT und TPT-Tests). Nach 30 min in TIT und nach 60 min in TPT im Vergleich zur Kochsalzlösung injiziert Kontrollgruppe (p &lt;0,001, ungepaarten t-Test) wurde die maximale analgetische Wirkung von Morphin erreicht. Wiederholte Morphine Verwaltungen induziert Hyperalgesie in Mäusen (Schritt D) Basal nozizeptiven Werte wurden jeden Tag gemessenvor Kochsalzlösung oder Morphinverabreichung (siehe Protokoll). Wie in Fig. 4 gezeigt ist, einmal täglich Morphin Verabreichungen über 6-Tage-Behandlungsperiode induzierte eine signifikante und progressive Absenkung der Wärme (F (7, 56) = 11,6, p &lt;0,001, ANOVA mit wiederholten Messungen, Fig. 4A) und mechanischen (F ( 7,56) = 15,55, p &lt;0,001, ANOVA mit wiederholten Messungen, Fig. 4B) nozizeptiven basalen Werte. Hyperalgesie entwickelt schnell wie es begonnen (p &lt;0,01, ungepaarter t-Test, im Vergleich zu mit Kochsalzlösung injizierten Kontrollen) signifikant am Tag 1 in TIT und am Tag 2 in TPT (p &lt;0,05, ungepaarter t-Test, verglichen mit Kochsalzlösung injizierten Kontrollen). Zeitkurs für Morphin Analgesie an Tag 7 nach Chronische Behandlung mit Morphin (Schritt E) Am Tag 7 wurden die Mäuse, die täglich Morphin oder Kochsalzlösung Injektionen über einen Zeitraum von 7 Tagen (d0 bis d6), die in T suchtIT Fig. 5A und 5B TPT ersten ihrer basalen nozizeptiven Werte und dann auf ihre analgetische Reaktion auf akute Morphin (5 mg / kg, sc.). In Übereinstimmung mit der Entwicklung der Hyperalgesie in Fig. 4 gezeigt, war die basale nozizeptiven Wert (Zeitpunkt 0) von Mäusen, die chronisch mit Morphin behandelt wurden, signifikant niedriger als die von Kochsalzlösung injiziert Kontrollmäusen (p &lt;0,001, ungepaarter t-Test). Nach einer akuten Morphin, die nozizeptive Reaktion des chronischen Morphin behandelten Gruppe signifikant erhöht, aber die basale nozizeptiven Wert mit Kochsalzlösung injizierten Kontrollmäusen gemessen bei 30 min in TIT und TPT (p &lt;0,01 bzw. p &lt;0,05, ungepaarter t nur geringfügig überschritten Test bezeichnet) und bei 60 min in TIT (p &lt;0,05; ungepaarten t-Test). 2 h nach der Morphiumbehandlung bis zum Ende des Experiments auf niedrigere Werte zurück nozizeptiven Reaktionen als die Kontrollmäuse (p&lt;0,001, ungepaarter t-Test). Vergleich der maximalen analgetischen Antworten von Mäusen zu Morphin vor (Tag 0) und nach chronischer Morphinbehandlung (Tag 7). Nozizeptiven in Fig. 6 dargestellt Schwellenwerte von TIT (A) und TPT (B) durchgeführt 30 min nach Kochsalzlösung oder Morphininjektion, wie in 3 (Tag 0) und 5 (Tag 7) dargestellt. Eine starke Abnahme der Morphinanalgesie wurde bei Mäusen nach chronischer Morphinbehandlung für 7 Tage im Vergleich mit ihrer anfänglichen Schmerzantwort am Tag 0 in beiden nozizeptiven Tests (p &lt;0,001 gepaarter t-Test) beobachtet. Diese Daten zeigen, dass Toleranz hat in Schmerz überempfindlich Tiere entwickeln. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51264/51264fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Ein Fünf-Stufen-Pro-Prozedur zu Morphin-induzierte Hyperalgesie und Toleranz zu überwachen. Das Protokoll wird über eine Gesamtdauer von 15 Tagen in fünf aufeinanderfolgenden Schritten (AE) unterteilt. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51264/51264fig2highres.jpg" width="500" /> . Abbildung 2 Definition der basalen nozizeptiven Antwortwerte (Schritt B, d-4-d-1). Schwanz Immersion (TIT) (A) und Schwanz Druck (TPT) (B)-Tests werden auf der ganzen Reihe von Tieren angewendet um ihre basalen nozizeptiven Werte zu beurteilen. Danach wurden zwei Gruppen von Mäusen (n = 8), bezeichnet als &quot;Saline&quot; und &quot;Morphin-Gruppen, sind so definiert, dass sie stabil und weisen vergleichbare durchschnittliche nozizeptiven Werte, was die nozizeptiven Modalität, die betrachtet wird. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" src = &quot;/ files/ftp_upload/51264/51264fig3highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Abbildung 3. Zeitkurs für Morphinanalgesie am Tag 0 (Schritt C) in TIT (A) und TPT (B). Die basale nozizeptiven Antwortwert von Mäusen wurde alle 30 Minuten nach einmaliger Morphin (5 mg / kg, sc bestimmt. ) oder Kochsalzinjektionen. Daten werden als Mittelwert ± SEM, n = 8 Mäusen pro Gruppe. * P &lt;0,05, ** P &lt;0,01, *** P &lt;0,001, ungepaarter t-Test im Vergleich zur Kontrollgruppe. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51264/51264fig4highres.jpg" width="500" /> . Abbildung 4 Entwicklung der Hyperalgesie nach wiederholter Verabreichung Morphin (Schritt D, D1 bis D6). Die basale nozizeptiven Wert von Mäusen wurde durch TIT bestimmt (A) und TPT (B) einmal täglich vor Morphin (5 mg / kg,sc.) oder Kochsalzlösung Verwaltung. Die Daten sind ausgedrückt als Mittelwerte ± SEM, n = 8 Mäusen pro Gruppe. * P &lt;0,05, ** P &lt;0,01, *** p &lt;0,001 von ungepaarten t-Test, verglichen mit der Kochsalzlösung behandelten Kontrollgruppe. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51264/51264fig5highres.jpg" width="500" /> 5. Zeitverlauf für Morphinanalgesie in chronisch-Morphin behandelten Mäusen am Tag 7 (Schritt E) in TIT (A) und TPT (B). Mäuse, die chronisch mit Morphin (schwarze Punkte) oder Kochsalzlösung (weiße Dreiecke) behandelt wurden von Tag 0 bis Tag 6, erhielt am Tag 7 eine einzige Injektion von Morphin (5 mg / kg, sc). oder Kochsalzlösung auf. Die nozizeptiven Reaktion von Mäusen wurde alle 30 min nach Morphin oder Kochsalzinjektion bestimmt. Daten werden als Mittelwert ± SEM, n = 8 Mäusen pro Gruppe. * P &lt;0,05, ** P &amp; #60; 0,01 ungepaarten t-Test, verglichen mit der Kochsalzlösung behandelten Kontrollgruppe. Fehlerbalken, die Symbole Größe nicht überschreiten, werden ausgeblendet. <img alt="Fig. 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51264/51264fig6highres.jpg" width="500" /> 6. Vergleich der maximalen analgetischen Reaktionen von Mäusen, Morphin (5 mg / kg, sc). Vor (Tag 0) und nach chronischer Behandlung mit Morphin (Tag 7). Werte hier berichteten von Experimenten in 3 und 5 gezeigt. Nozizeptive Werte wurden mit TIT (A) und TPT (B) 30 Minuten nach der Injektion Morphium oder Kochsalzlösung gemessen. Daten werden als Mittelwert ± SEM, n = 8 Mäusen pro Gruppe. *** P &lt;0,001 von gepaarten t-Test.

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Assessment of Morphine-induced Hyperalgesia and Analgesic Tolerance in Mice Using Thermal and Mechanical Nociceptive Modalities

Wir beschreiben ein Protokoll, um die Entwicklung von Opioid-induzierte Hyperalgesie und Toleranz in Mäusen zu untersuchen. Basierend auf der Messung der thermischen und mechanischen nozizeptiven Reaktionen von naiven und Morphin-behandelten Tieren, erlaubt es, die Steigerung der Schmerzempfindlichkeit (Hyperalgesie) zu quantifizieren und Abnahme der Analgesie (Toleranz) mit chronischer Opiat-Verwaltung verbunden.

Bewertung von Morphin-induzierte Hyperalgesie und Schmerztoleranz in Mäuse mit Thermal-und Maschinen Nozizeptive Modalitäten

Opioid-induced hyperalgesia and tolerance severely impact the clinical efficacy of opiates as pain relievers in animals and humans. The molecular ...

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Drugs for Pain Management: Opioid Analgesics and General Anesthetics

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33.0K Aufrufe.  Université de Strasbourg.  Wir beschreiben ein Protokoll, um die Entwicklung von Opioid-induzierte Hyperalgesie und Toleranz in Mäusen zu untersuchen. Basierend auf der Messung der thermischen und mechanischen nozizeptiven Reaktionen von naiven und Morphin-behandelten Tieren, erlaubt es, die Steigerung der Schmerzempfindlichkeit (Hyperalgesie) zu quantifizieren und Abnahme der Analgesie (Toleranz) mit chronischer Opiat-Verwaltung verbunden. 

Serie: Assessment of Morphine-induced Hyperalgesia and Analgesic Tolerance in Mice Using Thermal and Mechanical Nociceptive Modalities

Assessment of Motor Balance and Coordination in Mice using the Balance Beam

Brain injury, genetic manipulations, and pharmacological treatments can result in alterations of motor skills in mice. Fine motor coordination and balance can be assessed by the beam walking assay. The goal of this test is for the mouse to stay upright and walk across an elevated narrow beam to a safe platform. This test takes place over 3 consecutive days: 2 days of training and 1 day of testing. Performance on the beam is quantified by measuring the time it takes for the mouse to traverse the beam and the number of paw slips that occur in the process. Here we report the protocol used in our laboratory, and representative results from a cohort of C57BL/6 mice. This task is particularly useful for detecting subtle deficits in motor skills and balance that may not be detected by other motor tests, such as the Rotarod.

Deficits in fine motor coordination can be assessed with the balance beam test. Performance on the beam is quantified by the speed at which the beam is traversed and the number of times the mouse slips on the beam.

Beurteilung der Motor Balance und Koordination in Mäuse mit dem Schwebebalken

Brain injury, genetic manipulations, and pharmacological treatments can result in alterations of motor skills in mice.  Fine motor coordination and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Rapid Determination of the Thermal Nociceptive Threshold in Diabetic Rats

Painful diabetic neuropathy (PDN) is characterized by hyperalgesia i.e., increased sensitivity to noxious stimulus, and allodynia i.e., hypersensitivity to normally innocuous stimuli1. Hyperalgesia and allodynia have been studied in many different rodent models of diabetes mellitus2. However, as stated by B&ouml;lcskei et al, determination of "pain" in animal models is challenging due to its subjective nature3. Moreover, the traditional methods used to determine behavioral responses to noxious thermal stimuli usually lack reproducibility and pharmacological sensitivity3. For instance, by using the hot-plate method of Ankier4, flinch, withdrawal and/or licking of either hind- and/or fore-paws is quantified as reflex latencies at constant high thermal stimuli (52-55 &deg;C). However, animals that are hyperalgesic to thermal stimulus do not reproducibly show differences in reflex latencies using those supra-threshold temperatures3,5. As the recently described method of B&ouml;lcskei et al.6, the procedures described here allows for the rapid, sensitive and reproducible determination of thermal nociceptive thresholds (TNTs) in mice and rats. The method uses slowly increasing thermal stimulus applied mostly to the skin of mouse/rat plantar surface. The method is particularly sensitive to study anti-nociception during hyperalgesic states such as PDN. The procedures described bellow are based on the ones published in detail by Alm&aacute;si et al 5 and B&ouml;lcskei et al 3. The procedures described here have been approved the Laboratory Animal Care and Use Committee (LACUC), Wright State University.

Here, we describe a rapid reliable and simple procedure to determine the lowest temperature at which rats or mice show nocifensive behavior, i.e. the thermal nociceptive threshold (TNT). This method applies a slowly increasing thermal stimulus allowing precise and reproducible estimation of TNTs with minimum, if any, stress to the animals.

Schnelle Bestimmung der Wärmeleistung und nozizeptiven Grenzwerts bei diabetischen Ratten

Painful diabetic neuropathy (PDN) is characterized by hyperalgesia i.e., increased sensitivity to noxious stimulus, and allodynia i.e., hypersensitivity ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

Eine einfache und kostengünstige Methode zur Bestimmung der Überempfindlichkeit auf Kälte und Anpassung an der Maus

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching variations of the neuronal dendrites within the hippocampus are implicated in cognition and memory formation. There are several approaches to Golgi staining, all of which have been useful for determining the morphological characteristics of dendritic arbors and produce a clear background. The present Golgi-Cox method, (a slight variation of the protocol that is provided with a commercial Golgi staining kit), was designed to assess how a relatively low dose of the chemotherapeutic drug 5-flurouracil (5-Fu) would affect dendritic morphology, the number of spines, and the complexity of arborization within the hippocampus. The 5-Fu significantly modulated the dendritic complexity and decreased the spine density throughout the hippocampus in a region-specific manner. The data presented show that the Golgi staining method effectively stained the mature neurons in the CA1, the CA3, and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. This protocol reports the details for each step so that other researchers can reliably stain tissue throughout the brain with high quality results and minimal troubleshooting.

Here we present a Golgi-Cox protocol in extensive detail. This reliable tissue stain method allows for a high-quality assessment of the cytoarchitecture in the hippocampus, and throughout the entire brain, with minimal troubleshooting.

Bewertung der Hippocampalen Dendritischen Komplexität bei gealterten Mäusen unter Verwendung der Golgi-Cox-Methode

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Assessment of Dopaminergic Homeostasis in Mice by Use of High-performance Liquid Chromatography Analysis and Synaptosomal Dopamine Uptake

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) neurotransmission is strongly associated with several central nervous system-associated diseases such as Parkinson&#39;s disease, attention-deficit-hyperactivity disorder and drug addiction1,2,3,4. Delineating disease mechanisms involving DA imbalance is critically dependent on animal models to mimic aspects of the diseases, and thus protocols that assess specific parts of the DA homeostasis are important to provide novel insights and possible therapeutic targets for these diseases.
Here, we present two useful experimental protocols that when combined provide a functional read-out of the DAergic system in mice. Biochemical and functional parameters on DA homeostasis are obtained through assessment of DA levels and dopamine transporter (DAT) functionality5. When investigating the DA system, the ability to reliably measure endogenous levels of DA from adult brain is essential. Therefore, we present how to perform high-performance liquid chromatography (HPLC) on brain tissue from mice to determine levels of DA. We perform the experiment on tissue from dorsal striatum (dStr) and nucleus accumbens (NAc), but the method is also suitable for other DA-innervated brain areas.
DAT is essential for reuptake of DA into the presynaptic terminal, thereby controlling the temporal and spatial activity of released DA. Knowing the levels and functionality of DAT in the striatum is of major importance when assessing DA homeostasis. Here, we provide a protocol that allows to simultaneously deduce information on surface levels and function using a synaptosomal6 DA uptake assay.
Current methods combined with standard immunoblotting protocols provide the researcher with relevant tools to characterize the DAergic system.

Synaptosomal dopamine uptake and high-performance liquid chromatography analysis represent experimental tools to investigate dopamine homeostasis in mice by assessing the function of the dopamine transporter and levels of dopamine in striatal tissue, respectively. Here we present protocols to measure dopamine tissue content and assess the functionality of the dopamine transporter.

Bewertung der dopaminergen Homöostase bei Mäusen durch Verwendung von High-Performance Liquid Chromatography Analyse und Synaptosomal Dopamin-Aufnahme

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) ...

Visual Evoked Potential Recordings in Mice Using a Dry Non-invasive Multi-channel Scalp EEG Sensor

For scalp EEG research environments with laboratory mice, we designed a dry-type 16 channel EEG sensor which is non-invasive, deformable, and re-usable because of the plunger-spring-barrel structural facet and mechanical strengths resulting from metal materials. The whole process for acquiring the VEP responses in vivo from a mouse consists of four steps: (1) sensor assembly, (2) animal preparation, (3) VEP measurement, and (4) signal processing. This paper presents representative measurements of VEP responses from multiple mice with a submicro-voltage signal resolution and sub-hundred millisecond temporal resolution. Although the proposed method is safer and more convenient compared to other previously reported animal EEG acquiring methods, there are remaining issues including how to enhance the signal-to-noise ratio and how to apply this technique with freely moving animals. The proposed method utilizes easily available resources and shows a repetitive VEP response with a satisfactory signal quality. Therefore, this method could be utilized for longitudinal experimental studies and reliable translational research exploiting non-invasive paradigms.

We designed a dry-type 16 channel EEG sensor which is non-invasive, deformable, and re-usable. This paper describes the whole process from manufacturing the proposed EEG electrode to signal processing of visual evoked potential (VEP) signals measured on a mouse scalp using a dry non-invasive multi-channel EEG sensor.

Visuelle evozierte möglichen Aufnahmen bei Mäusen mit einer trockenen nichtinvasive Mehrkanal Scalp EEG Sensor

For scalp EEG research environments with laboratory mice, we designed a dry-type 16 channel EEG sensor which is non-invasive, deformable, and re-usable ...

Assessment of Sensory Thresholds in Dogs Using Mechanical and Hot Thermal Quantitative Sensory Testing

Quantitative sensory testing (QST) is used to evaluate the function of the somatosensory system in dogs by assessing the response to applied mechanical and thermal stimuli. QST is used to determine normal dogs&#39; sensory thresholds and evaluate alterations in peripheral and central sensory pathways caused by various disease states, including osteoarthritis, spinal cord injury, and cranial cruciate ligament rupture. Mechanical sensory thresholds are measured by electronic von Frey anesthesiometers and pressure algometers. They are determined as the force at which the dog exhibits a response indicating conscious stimulus perception. Hot thermal sensory thresholds are the latency to respond to a fixed or ramped temperature stimulus applied by a contact thermode.
Following a consistent protocol for performing QST and paying attention to details of the testing environment, procedure, and individual study subjects are critical for obtaining accurate QST results for dogs. Protocols for the standardized collection of QST data in dogs have not been described in detail. QST should be performed in a quiet, distraction-free environment that is comfortable for the dog, the QST operator, and the handler. Ensuring that the dog is calm, relaxed, and properly positioned for each measurement helps produce reliable, consistent responses to the stimuli and makes the testing process more manageable. The QST operator and handler should be familiar and comfortable with handling dogs and interpreting dogs&#39; behavioral responses to potentially painful stimuli to determine the endpoint of testing, reduce stress, and maintain safety during the testing process.

This work describes a standard protocol for mechanical and hot thermal quantitative sensory testing to evaluate the somatosensory system in dogs. Sensory thresholds are measured using an electronic von Frey anesthesiometer, pressure algometer, and hot contact thermode.

Beurteilung sensorischer Schwellenwerte bei Hunden mittels mechanischer und heißer thermischer quantitativer sensorischer Tests

Quantitative sensory testing (QST) is used to evaluate the function of the somatosensory system in dogs by assessing the response to applied mechanical ...

Recording Network Activity in Spinal Nociceptive Circuits Using Microelectrode Arrays

The roles and connectivity of specific types of neurons within the spinal cord dorsal horn (DH) are being delineated at a rapid rate to provide an increasingly detailed view of the circuits underpinning spinal pain processing. However, the effects of these connections for broader network activity in the DH remain less well understood because most studies focus on the activity of single neurons and small microcircuits. Alternatively, the use of microelectrode arrays (MEAs), which can monitor electrical activity across many cells, provides high spatial and temporal resolution of neural activity. Here, the use of MEAs with mouse spinal cord slices to study DH activity induced by chemically stimulating DH circuits with 4-aminopyridine (4-AP) is described. The resulting rhythmic activity is restricted to the superficial DH, stable over time, blocked by tetrodotoxin, and can be investigated in different slice orientations. Together, this preparation provides a platform to investigate DH circuit activity in tissue from na&#239;ve animals, animal models of chronic pain, and mice with genetically altered nociceptive function. Furthermore, MEA recordings in 4-AP-stimulated spinal cord slices can be used as a rapid screening tool to assess the capacity of novel antinociceptive compounds to disrupt activity in the spinal cord DH.

The combined use of microelectrode array technology and 4-aminopyridine-induced chemical stimulation for investigating network-level nociceptive activity in the spinal cord dorsal horn is outlined.

Aufzeichnung der Netzwerkaktivität in spinalen nozizeptiven Schaltkreisen unter Verwendung von Mikroelektrodenarrays

The roles and connectivity of specific types of neurons within the spinal cord dorsal horn (DH) are being delineated at a rapid rate to provide an ...

Mechanical Conflict-Avoidance Assay to Measure Pain Behavior in Mice

Pain comprises of both sensory (nociceptive) and affective (unpleasant) dimensions. In preclinical models, pain has traditionally been assessed using reflexive tests that allow inferences regarding pain's nociceptive component but provide little information about the affective or motivational component of pain. Developing tests that capture these components of pain are therefore translationally important. Hence, researchers need to use non-reflexive behavioral assays to study pain perception at that level. Mechanical conflict-avoidance (MCA) is an established voluntary non-reflexive behavior assay, for studying motivational responses to a noxious mechanical stimulus in a 3 chamber paradigm. A change in a mouse's location preference, when faced with competing noxious stimuli, is used to infer the perceived unpleasantness of bright light versus tactile stimulation of the paws. This protocol outlines a modified version of the MCA assay which pain researchers can use to understand affective-motivational responses in a variety of mouse pain models. Though not specifically described here, our example MCA data use the intraplantar complete Freund's adjuvant (CFA), spared nerve injury (SNI), and a fracture/casting model as pain models to illustrate the MCA procedure.

The mechanical conflict-avoidance assay is used as a non-reflexive readout of pain sensitivity in mice which can be used to better understand affective-motivational responses in a variety of mouse pain models.

Mechanischer Konfliktvermeidungstest zur Messung des Schmerzverhaltens bei Mäusen

Pain comprises of both sensory (nociceptive) and affective (unpleasant) dimensions. In preclinical models, pain has traditionally been assessed using ...

Assessment of Thermal Damage from Robot-Drilled Craniotomy for Cranial Window Surgery in Mice

Cranial window surgery allows for the imaging of brain tissue in live mice with the use of multiphoton or other intravital imaging techniques. However, when performing any craniotomy by hand, there is often thermal damage to brain tissue, which is inherently variable surgery-to-surgery and may be dependent on individual surgeon technique. Implementing a surgical robot can standardize surgery and lead to a decrease in thermal damage associated with surgery. In this study, three methods of robotic drilling were tested to evaluate thermal damage: horizontal, point-by-point, and pulsed point-by-point. Horizontal drilling utilizes a continuous drilling schematic, while point-by-point drills several holes encompassing the cranial window. Pulsed point-by-point adds a &#34;2 s on, 2 s off&#34; drilling scheme to allow for cooling in between drilling. Fluorescent imaging of Evans Blue (EB) dye injected intravenously measures damage to brain tissue, while a thermocouple placed under the drilling site measures thermal damage. Thermocouple results indicate a significant decrease in temperature change in the pulsed point-by-point (6.90 &#176;C &#177; 1.35 &#176;C) group compared to the horizontal (16.66 &#176;C &#177; 2.08 &#176;C) and point-by-point (18.69 &#176;C &#177; 1.75 &#176;C) groups. Similarly, the pulsed point-by-point group also showed significantly less EB presence after cranial window drilling compared to the horizontal method, indicating less damage to blood vessels in the brain. Thus, a pulsed point-by-point drilling method appears to be the optimal scheme for reducing thermal damage. A robotic drill is a useful tool to help minimize training, variability, and reduce thermal damage. With the expanding use of multiphoton imaging across research labs, it is important to improve the rigor and reproducibility of results. The methods addressed here will help inform others of how to better use these surgical robots to further advance the field.

Cranial windows have become a ubiquitously implemented surgical technique to allow for intravital imaging in transgenic mice. This protocol describes the use of a surgical robot that performs semi-automated bone drilling of cranial windows and can help reduce surgeon-to-surgeon variability and partially mitigate thermal blood-brain barrier damage.

Abschätzung der thermischen Schädigung durch robotergebohrte Kraniotomie bei der kranialen Fensterchirurgie bei Mäusen

Cranial window surgery allows for the imaging of brain tissue in live mice with the use of multiphoton or other intravital imaging techniques. However, ...