Da derzeit eine Vielzahl innovativer Therapien zur Behandlung chronischer Schmerzen untersucht wird, liefert unser Protokoll entscheidende Konzepte für die Standardisierung von Operationen, die erforderlich sind, um neuropathische Schmerzen zu induzieren. Die partielle Ischiasnervligatur (PSNL) ist ein vorteilhaftes Modell zur Untersuchung neuropathischer Schmerzen, da sie viele Symptome reproduziert, die bei Menschen mit neuropathischen Schmerzen beobachtet werden. Da PSNL viele Symptome reproduziert, die bei Menschen mit neuropathischen Schmerzen beobachtet werden, bietet dieses Protokoll entscheidende Konzepte für die Untersuchung und Entwicklung neuer Schmerztherapien.
Das Verfahren wird von Kevin Cheng, einem MD-Doktoranden in meinem Labor, demonstriert. Gewöhnen Sie die Mäuse zunächst vor dem Test eine Stunde lang an das Von-Frey-Testgerät, indem Sie sie in durchsichtige Plexiglasboxen auf einem Drahtgeflecht im selben Raum wie den Testraum legen. Tragen Sie eine Reihe kalibrierter feiner Monofilamente senkrecht auf die Pflanzoberfläche der PSNL-ipsilateralen Hinterpfote der Tiere auf, die in hängenden Maschendrahtkäfigen gehalten werden.
Bestimmen Sie die Rückzugsschwelle, indem Sie die Reizstärke entsprechend der Größe des Filaments nacheinander erhöhen oder verringern. Erhöhen Sie die Größe des Filaments, wenn die Reaktion negativ ist, und verringern Sie die Größe des Filaments, wenn das Tier seine Pfote zurückzieht. Melden Sie negative und positive Antworten im Datenblatt und testen Sie dieselbe Pfote viermal mit verschiedenen Filamenten nach der ersten positiven Antwort.
Gewöhnen Sie die Mäuse vor dem Test eine Stunde lang an das Hargreaves-Testgerät, indem Sie sie in durchsichtige Plexiglasboxen im selben Raum wie den Testraum legen. Ermitteln Sie die grundlegenden Pfotenentzugslatenzen mit dem Hargreaves-Gerät. Fokussieren Sie eine Strahlungswärmequelle auf die Pflanzfläche der Hinterpfote ipsilateral zum PSNL und beginnen Sie mit der Stimulation.
Wenn das Tier seine Pfote zurückzieht, warten Sie, bis ein Bewegungsmelder den Reiz stoppt und den Timer stoppt. Passen Sie die Intensität der Wärmequelle an, um eine Basislinie der Pfotenentzugslatenz von ca. 10 Sekunden zu erhalten. Notieren Sie als Nächstes die Auszahlungszeit in einer Tabelle.
Stellen Sie die Kochplatte auf 52 Grad Celsius ein. Legen Sie das Tier in die Testkammer und starten Sie einen Chronometer. Achten Sie auf nozifensives Verhalten und stoppen Sie den Chronometer, sobald nozifensives Verhalten beobachtet wird.
Entfernen Sie dann das Tier aus der Kammer und notieren Sie die Latenz zu diesem Verhalten. Achten Sie darauf, das Gerät zwischen den einzelnen getesteten Tieren von jeglichem Urin zu reinigen, um eine Beeinträchtigung der Temperatur des Hitzereizes zu vermeiden. Reinigen Sie die Testkammer mit 70% Ethanol zwischen den Tieren, um die Auswirkungen von Gerüchen auf das Verhalten zu reduzieren.
Um einen Nervenglashaken herzustellen, schalten Sie den Bunsenbrenner ein. Halten Sie ein Ende des Glasstabes in einer Hand gegen das Feuer. Wenn dieser Glasstab schmilzt, verwenden Sie einen anderen Glasstab in der anderen Hand, um das schmelzende Glas am ersten Stab zu führen und zu ziehen.
Nehmen Sie den ersten Glasstab vom Feuer und lassen Sie das Ende des geschmolzenen Teils auf natürliche Weise nach innen rollen, um mit dem zweiten Glasstab eine kleine Kugelform zu bilden. Kneifen Sie die Zehen einer Hinterpfote mit einer Pinzette zusammen, um sicherzustellen, dass kein Pfotenreflex vorhanden ist, und überprüfen Sie den Hornhautblinzelreflex, bevor Sie eine gleitende Augensalbe auftragen. Wenn Sie sich für eine Seite entscheiden, auf der die Operation durchgeführt werden soll, formen Sie das Hinterbein des Tieres um die Oberschenkelregion, nach unten zur Patella, nach oben zur Hüfte und über den Oberschenkelknochen.
Als nächstes dreimal mit Chlorhexidin in eine Richtung mit drei separaten Gazen abwechselnd mit warmer steriler Kochsalzlösung abwischen. Schieben Sie dann das Bein durch einen Schlitz aus einem 10 mal 10 Zentimeter großen sterilen Tuch, um ein steriles Feld um das Bein Ihrer Wahl zu schaffen. Machen Sie mit einer feinen chirurgischen Schere einen kleinen Zwei-Millimeter-Schnitt der Haut in der Mittellinie der seitlichen Seite des Oberschenkels.
Schieben Sie die Schere in kreisenden Bewegungen unter die Haut, um die Faszie zu durchbrechen und einen Freiraum zu schaffen, der den Schnittraum vergrößert. Als nächstes wird mit einer Bindezange ein scharfer, ein Zentimeter tiefer Einschnitt vertikal in einem 90-Grad-Winkel in die Oberschenkelmuskulatur aufgenommen. Führen Sie dann die feine kleine Schere ebenfalls im 90-Grad-Winkel in denselben Schnitt ein und spreizen Sie sie vorsichtig auf, um die Muskeln zu trennen, bis der Ischiasnerv sichtbar wird.
Lokalisieren Sie den Ischiasnerv, der parallel zum vertikalen Oberschenkel in Richtung Hüfte bis Knie verläuft. Entfernen Sie die Schere in der Bindezange vom Körper, bevor Sie fortfahren. Verwenden Sie die extra feine Pinzette im Nervenglashaken, um den Nerv von unten zu isolieren.
Befreien Sie die Nerven vorsichtig vom umgebenden Bindegewebe an einer Stelle in der Nähe des Trochanters des Femurs, der der Hüfte am nächsten und am weitesten vom Knie entfernt ist. Lassen Sie den Nerv auf dem Glasstab ruhen und achten Sie darauf, dass das Ende des Stabes verhindert, dass der Nerv abrollt. Platzieren Sie einen chirurgischen Knoten, um ein Drittel der Breite des Ischiasnervs mit einer Nylonnaht von neun Null zu binden, bevor er sich in die gemeinsamen Peroneal-, Tibia- und Suralnervenäste teilt.
Ziehen Sie den Nerv vorsichtig vom Glasstab ab, sobald der Knoten vollständig ist, und stecken Sie ihn wieder an die ursprüngliche Stelle auf Höhe unter den getrennten Muskeln. Als nächstes nähen Sie den Muskelschnitt mit einer resorbierbaren polyglykolischen Fünf-Null-Naht. Nähen Sie die Haut separat mit einer nicht resorbierbaren Polypropylen-Sechs-Null-Naht.
Notieren Sie dann die Operations- und Anästhesiestoppzeit. Lassen Sie die Maus alleine in einem Bergungskäfig aufwachen, bevor Sie sie in einen neuen, sauberen Käfig zurückbringen. Verwenden Sie den Von-Frey-, Hargreaves- oder Heizplattentest, um sowohl die thermische als auch die mechanische Überempfindlichkeit und ihre mögliche Umkehrung zu bewerten.
Mäuse, die sich einer PSNL-Operation unterzogen, zeigten im Vergleich zu Scheintieren über 28 Tage niedrigere Schwellenwerte für mechanische Reize. Ähnliche Ergebnisse wurden bei der Bewertung der thermischen Überempfindlichkeit erzielt. Die Pfotenentzugslatenzen nach Exposition gegenüber Strahlungswärmereiz waren bei PSNL-Tieren sowie die Entzugslatenzen erhöht, wenn die Tiere auf eine 52-Grad-Celsius-Platte gelegt wurden.
Gruppen, denen zwei verschiedene Dosen Morphin injiziert wurden, zeigten eine Umkehrung der Überempfindlichkeit, die ein bis zwei Stunden dauerte. Die mechanische Überempfindlichkeit kehrte vier Stunden nach der Injektion von Morphin zum Ausgangswert zurück. Wenn den Mäusen zwei verschiedene Dosen von Ibuprofen intraperitoneal verabreicht wurden, zeigten die Ergebnisse eine verringerte mechanische Überempfindlichkeit im Vergleich zu Mäusen, denen Kochsalzlösung injiziert wurde.
Die Begrenzung zusätzlicher Schäden am Nerv ist wichtig, da sie die sensorischen Schwellenwerte des Schmerzes beeinflussen können. Der Experimentator sollte besonders aufmerksam sein und den Glashaken verwenden, um unbeabsichtigte Schäden zu reduzieren Nach diesem Verfahren kann dieses Modell des chronischen neuropathischen Schmerzes verwendet werden, um die antinozizeptive Wirkung von Medikamenten zu identifizieren und zu charakterisieren, was zur Entwicklung neuer Schmerztherapien führt.
