Die Arbeit, die zu dieser Veröffentlichung hat die Finanzierung aus dem Marie-Curie-Programm COFUND &quot;U-Mobility&quot;, die von der Universität von Malaga und der Europäischen Union 7. Rahmenprogramm (FP7/2007-2013) unter GA Nr. 246550 kofinanziert erhalten. Die Arbeit in unserem Labor wird durch Zuschüsse von NIH, USDA / NIFA, NSF, BARD, und BSF VC unterstützt

1. Die Proteinexpression <ol><li> Wahl des Expressionssystems System auswählen, das heißt, Vektoren und Vektorfreisetzungsverfahren am besten geeignet für die Expression des Proteins von Interesse in der spezifischen Modellorganismus / Zelle. Beachten Sie, dass unser Assay erfordert die Expression der untersuchten Proteine ​​in leicht nachweisbaren Mengen, die am besten durch eine transiente Transformation einer großen Anzahl von Zellen erreicht wird. In Pflanzen, zum Beispiel, ist diese mit binären Plasmide als Expressionsvektoren und Agrobacterium als Abgabesystem am besten erreicht. </li><li> Bau von binären Expressionsvektoren Klonierung der kodierenden Sequenz (en) des Proteins (e) von Interesse in einen Expressionsvektor entweder allein oder in translationale Fusion an ein Epitop-Tag. Verwenden Vektoren passend zum gewählten Expressionssystem und molekularbiologischen Standardverfahren für die Gen-Klonen. Für Agrobacterium-vermittelten Gentransfer beschäftigen binäre Vektoren und führen sie, auch mit Standard Protokolle in einen Agrobacterium-Stamm EHA 105, wie für die nachfolgende Inokulation von Pflanzengeweben. </li><li> Auswahl der Pflanzenarten Aus den Pflanzen in dem das Protein (e) von Interesse exprimiert wird. Beachten Sie, dass, während alle Pflanzenarten anfällig für Agrobacterium-vermittelte genetische Transformation verwendet werden kann, unser Pflanzenarten der Wahl ist Nicotiana benthamiana, die leicht gewachsen ist, sehr anfällig für Agrobacterium und hat große Blätter, die leicht eingeimpft werden. </li><li> Das Pflanzenwachstum Wachsen einer Pflanze für 4 bis 6 Wochen in einem Topf mit Pro-Mix BX in einem Topf (20 cm x 20 cm x 20 cm) unter umweltkontrollierten Bedingungen (z. B. Wachstumskammer) des langen Tag (dh 16 h von 130 uE -150 m-2 s-1 Licht bei 23 ° C und 8 h Dunkelheit bei 20 ° C) und 40-65% relativer Luftfeuchtigkeit. 1.5.2 Düngung gelegentlich mit handelsüblichen Produkten pro Herstellers. Sobald die Pflanze angebaut wird, wählen SieBlätter mit der Größe von 50 mm x 70 mm oder größer (diese Längenmessungen beinhalten nicht die Blattstiel), Agrobacterium Impfung. </li><li> Inokulation mit Agrobacterium Wachsen Agrobacterium-Stamm, der das binäre Konstrukt getestet Protein (e) von Schritt 1.3 über Nacht bei 28 º C in YEP-Medium (1% Pepton, 1% Hefeextrakt und 0,5% NaCl) mit geeigneten Antibiotika (z. B. 100 mg ergänzt exprimieren / l Streptomycin und 10 mg / l Rifampicin pPZP-RSC2-basierte Vektoren 24-25). 1.6.2 Zentrifugation der Zellen, resuspendiert in Puffer Infiltration OD 600 = 0,5 [10 mM MgCl 2, 10 mM MES (pH 5,6), 100 &amp;mgr; M Acetosyringon] und Inkubation für 2 h bei Raumtemperatur. Infiltrieren die Kultur in der unterseits von einem Blatt, mit einer 1 ml-Spritze ohne Nadel, beachten Sie, dass die Blätter in situ angeimpft, während der Pflanze verbunden ist. 1.6.3 Nach der Infiltration, wachsen die Anlage für 72 h unter dem Lichtregime von 16 h 130-150 &amp;Nr. 181, E m-2 s-1 Licht bei 23 ° C / 8 h Dunkelheit bei 20 ° C vor der Ernte. </li><li> Die Anwendung der proteasomalen Inhibitoren Um die Vorstellung, dass die getesteten Protein (e) über einen Proteasom-Weg abgebaut unterstützt, verwenden spezifische Proteasom-Inhibitoren MG132 und Lactacystin 28-29, die reduzieren oder sogar blockieren Abbau sollte. Vier Stunden vor der Ernte (siehe Schritt 2.1), infiltrieren die Agrobacterium geimpften Blattflächen mit 10 uM MG132 (EMD Millipore) oder 10 uM Lactacystin (Sigma-Aldrich) oder Modelle behandeln das Blatt mit den jeweiligen Lösemittel, dh 0,1% DMSO oder destilliertes Wasser. </li></ol> 2. Herstellung von zellfreien Extrakten <ol><li> Blatternte Ernte der inokulierten Bereichen des Blattes, üblicherweise ca. 200-400 mg Frischgewicht, und schleifen sie in ein feines Pulver in flüssigem Stickstoff. Alternativ schlagen die Wulst-Gewebe, mit jeder Wulst-Schläger (zB Biospec) oder eine Zahn amalgamator (zB TPC Erweiterte<html> Technologies) direkt in der Abbaupuffer (siehe Schritt 2.2). </li><li> Proteinextraktion Vorbereitung Gesamtproteinextrakt durch Anordnen des Grundgewebes in 500 ul Puffer Abbau [50 mM Tris-HCL (pH 7,5), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl 2, 5 mM DTT, 5 mM Adenosin-5&#39;-Triphosphat, und 1x Protease-Inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich)]. Beachten Sie, dass der Protease-Inhibitor-Cocktail betrifft hauptsächlich Serin, Cystein, Asparaginsäure, und Metalloproteasen und nicht mit dem 26S-Protease beeinträchtigen. Der Extrakt wird durch zwei aufeinanderfolgende Zentrifugationen bei 12.000 × g für 5 min. </li><li> Protein-Abbaureaktion Übertragen gleichen Volumina Extrakte, normalerweise 20 &amp;mgr; l, um Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren bei Raumtemperatur zur Erhöhung Zeiträume. Typischerweise Probe zum Zeitpunkt Null und 5, 10, 15, 20 und 30 min Zeitpunkten. Stopp-Reaktionen durch Kochen in SDS-Gel-Probenpuffer, und analysieren sie durch Western-Blot. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 3. Erkennen Proteinabbau durch Immunoblotting <ol><li> Gel-Elektrophorese 3.1.1 Auflösen von Proteinproben durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese und Elektrotransfer der aufgetrennten Proteine ​​auf eine Nitrocellulosemembran nach dem Standardprotokoll 30. 3.1.2 Bestimmen der Proteinkonzentration mit der Bradford-Methode (Bio-Rad), und laden 50-80 ug Gesamtprotein pro Spur. Stellen Sie sicher, dass alle Proben gleich geladen. Zum Laden steuert, zu vergleichen, Intensitäten einer ubiquitäres Protein-Arten, wie putative RuBisCo großen Ketten, die als eine Hauptbande mit einer relativen elektrophoretischen Beweglichkeit von etwa 50 kDa wandern, sie können auf Coomassie-Blau-gefärbten Gelen oder Ponceau S-oder erfasst werden Fluoreszenz SYPRO Rubin-gefärbten Nitrozellulosemembranen. </li><li> Blockierung Blockieren der Membran mit 5% Magermilch in TBST (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) für 1 h bei Raumtemperatur. </li&gt; <li> Primärer Antikörper Verdünnte primäre anti-Epitop-Antikörpers in 1% Magermilch in TBST auf die vom Hersteller empfohlene Konzentration und Inkubation mit dem blockierten Membran für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 º C unter leichtem Schütteln. </li><li> Spülung Spülen der Membran in 20 ml TBST für 15 Minuten wieder abgespült und zweimal für 5 min bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. </li><li> Sekundäre Antikörper Verdünnte sekundäre Antikörper (zB Anti-Kaninchen-IgG) mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) in 1% Magermilch in TBST konjugiert, wie vom Hersteller empfohlen, und Inkubation mit der Membran für 1 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. </li><li> Entdeckung Spülen der Membran wieder wie in Schritt 3.4 beschrieben. Nach dem letzten Spülvorgang in TBST, Visualisierung der Proteine ​​von Interesse mit einem HRP chemilumineszierendes Substrat, meist unter Verwendung eines ECL-Kits. </li></ol>

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	<li>Patton, E. E., Willems, A. R., Tyers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+control+in+ubiquitin-dependent+proteolysis:+don&#8217;t+Skp+the+F-box+hypothesis.">Combinatorial control in ubiquitin-dependent proteolysis: don&#8217;t Skp the F-box hypothesis.</a> Trends Genet. 14, 236-243 (1998).</li><li>Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCF+and+cullin/ring+H2-based+ubiquitin+ligases.">SCF and cullin/ring H2-based ubiquitin ligases.</a> Annu. Rev. Cell Biol. 15, 435-467 (1999).</li><li>Callis, J., Vierstra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+degradation+in+signaling.">Protein degradation in signaling.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 3, 381-386 (2000).</li><li>Hellmann, H., Estelle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+development:+regulation+by+protein+degradation.">Plant development: regulation by protein degradation.</a> Science. 297, 793-797 (2002).</li><li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+system.">The ubiquitin system.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 425-479 (1998).</li><li>Dharmasiri, S., Estelle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+regulated+protein+degradation+in+auxin+response.">The role of regulated protein degradation in auxin response.</a> Plant Mol. Biol. 49, 401-409 (2002).</li><li>Devoto, A., Muskett, P. R., Shirasu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+ubiquitination+in+the+regulation+of+plant+defence+against+pathogens.">Role of ubiquitination in the regulation of plant defence against pathogens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 6, 307-311 (2003).</li><li>Itoh, H., Matsuoka, M., Steber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+ubiquitin-26S-proteasome+pathway+in+gibberellin+signaling.">A role for the ubiquitin-26S-proteasome pathway in gibberellin signaling.</a> Trends Plant Sci. 8, 492-497 (2003).</li><li>Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+26S+proteasome+system+in+the+signaling+pathways+of+TGF-beta+superfamily.">The 26S proteasome system in the signaling pathways of TGF-beta superfamily.</a> Front. Biosci. 8, 1109-1127 (2003).</li><li>Pagano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+DNA+synthesis+and+mitosis+by+the+Skp2-+p27-Cdk1/2+axis.">Control of DNA synthesis and mitosis by the Skp2- p27-Cdk1/2 axis.</a> Mol. Cell. 14, 414-416 (2004).</li><li>Magori, S., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hijacking+of+the+host+SCF+ubiquitin+ligase+machinery+by+plant+pathogens.">Hijacking of the host SCF ubiquitin ligase machinery by plant pathogens.</a> Front. Plant Sci. 2, 87 (2011).</li><li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+plant+transformation:+the+biology+behind+the+&amp;#34;gene-jockeying&amp;#34;+tool.">Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the &amp;#34;gene-jockeying&amp;#34; tool.</a> Microbiol. Mol Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).</li><li>Lacroix, B., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+bacterial+and+host+plant+factors+in+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation.">The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation.</a> Int. J. Dev. Biol. 57, (2013).</li><li>Schrammeijer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+the+virulence+protein+VirF+of+Agrobacterium+tumefaciens+with+plant+homologs+of+the+yeast+Skp1+protein.">Interaction of the virulence protein VirF of Agrobacterium tumefaciens with plant homologs of the yeast Skp1 protein.</a> Curr. Biol. 11, 258-262 (2001).</li><li>Zaltsman, A., Krichevsky, A., Loyter, A., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+induces+expression+of+a+plant+host+F-box+protein+required+for+tumorigenicity.">Agrobacterium induces expression of a plant host F-box protein required for tumorigenicity.</a> Cell Host Microbe. 7, 197-209 (2010).</li><li>Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+targeted+proteolysis+in+plant+genetic+transformation+by+Agrobacterium.">Involvement of targeted proteolysis in plant genetic transformation by Agrobacterium.</a> Nature. 431, 87-92 (2004).</li><li>Zaltsman, A., Lacroix, B., Gafni, Y., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disassembly+of+synthetic+Agrobacterium+T-DNA-protein+complexes+via+the+host+SCFVBF+ubiquitin-ligase+complex+pathway.">Disassembly of synthetic Agrobacterium T-DNA-protein complexes via the host SCFVBF ubiquitin-ligase complex pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 169-174 (2013).</li><li>Zhou, P., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+and+degradation+of+the+substrate+recognition+subunits+of+SCF+ubiquitin-protein+ligases.">Ubiquitination and degradation of the substrate recognition subunits of SCF ubiquitin-protein ligases.</a> Mol. Cell. 2, 571-580 (1998).</li><li>Galan, J. M., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-dependent+degradation+of+multiple+F-box+proteins+by+an+autocatalytic+mechanism.">Ubiquitin-dependent degradation of multiple F-box proteins by an autocatalytic mechanism.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 9124-9129 (1999).</li><li>Ayad, N. G., Rankin, S., Murakami, M., Jebanathirajah, J., Gygi, S., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tome-1,+a+trigger+of+mitotic+entry,+is+degraded+during+G1+via+the+APC.">Tome-1, a trigger of mitotic entry, is degraded during G1 via the APC.</a> Cell. 113, 101-113 (2003).</li><li>Guardavaccaro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+meiotic+and+mitotic+progression+by+the+F+box+protein+b-Trcp1+in+vivo.">Control of meiotic and mitotic progression by the F box protein b-Trcp1 in vivo.</a> Dev. Cell. 4, 799-812 (2003).</li><li>Magori, S., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+counteracts+host-induced+degradation+of+its+F-box+protein+effector.">Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector.</a> Sci. Signal. 4, (2011).</li><li>Margottin-Goguet, F., Hsu, J. Y., Loktev, A., Hsieh, H. M., Reimann, J. D., Jackson, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prophase+destruction+of+Emi1+by+the+SCFbTrCP/Slimb+ubiquitin+ligase+activates+the+anaphase+promoting+complex+to+allow+progression+beyond+prometaphase.">Prophase destruction of Emi1 by the SCFbTrCP/Slimb ubiquitin ligase activates the anaphase promoting complex to allow progression beyond prometaphase.</a> Dev. Cell. 4, 813-826 (2003).</li><li>Tzfira, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pSAT+vectors:+a+modular+series+of+plasmids+for+fluorescent+protein+tagging+and+expression+of+multiple+genes+in+plants.">pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants.</a> Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).</li><li>Goderis, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+set+of+modular+plant+transformation+vectors+allowing+flexible+insertion+of+up+to+six+expression+units.">A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units.</a> Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).</li><li>Lee, L. Y., Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-DNA+binary+vectors+and+systems.">T-DNA binary vectors and systems.</a> Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).</li><li>Dafny-Yelin, M., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+multiple+transgenes+to+plant+cells.">Delivery of multiple transgenes to plant cells.</a> Plant Physiol. 145, 1118-1128 (2007).</li><li>Yang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+the+Arabidopsis+26+S+proteasome:+biochemical+and+molecular+analyses+revealed+the+presence+of+multiple+isoforms.">Purification of the Arabidopsis 26 S proteasome: biochemical and molecular analyses revealed the presence of multiple isoforms.</a> J. Biol. Chem. 279, 6401-6413 (2004).</li><li>Fenteany, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+proteasome+activities+and+subunit-specific+amino-terminal+threonine+modification+by+lactacystin.">Inhibition of proteasome activities and subunit-specific amino-terminal threonine modification by lactacystin.</a> Science. 268, 726-731 (1995).</li><li>Ausobel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (1987).</li><li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ. , (1997).</li><li>Kim, J. H., Kim, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+RING+E3+ubiquitin+ligase+AtAIRP3/LOG2+participates+in+positive+regulation+of+high+salt+and+drought+stress+responses).">The Arabidopsis RING E3 ubiquitin ligase AtAIRP3/LOG2 participates in positive regulation of high salt and drought stress responses).</a> Plant Physiol. 162, 1733-1749 (2013).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dieser Assay beruht auf der Expression der untersuchten Proteine ​​in Pflanzengeweben, so tritt offensichtlich das Potential proteasomalen Abbau Verfahren bereits in den lebenden Geweben. Wir untersuchen Protein Destabilisierung jedoch nur in den Extrakten, mit der Zeitnullprobe als erste Bezugspunkt dient. Daher definieren wir als zellfreie Assays. Ein wichtiger Aspekt für den Erfolg dieses Assays ist die richtige Wahl des Expressionsvektors aus dem das Protein getestet (n) erzeugt. Es...

Die Ubiquitin/26S Proteasom-Weg wird als weit verbreitete Mechanismus zur Steuerung der verschiedenen biologischen Reaktionen, einschließlich Transkriptionsregulation, Zellzyklusprogression und Signaltransduktion, Rezeptor-Down-Regulation oder Endozytose ua verarbeitet 1-4 Schwellen. In diesem Weg wird das Zielprotein durch Ubiquitin-Reste, die zunächst über eine Thiolester-Bindung an Ubiquitin-aktivierendes Enzym E1 befestigt sind und dann zu einem Cystein-Aminosäurerest von Ubiquitin-Konjugation Enzym E2 transloziert markiert, und schließlich in Wechselwirkung mit E2 E3-Ubiquitin-Ligase , was Polyubiquitinierung des Proteinsubstrats. Schließlich werden die polyubiquitiniert Proteine ​​durch das 26S-Proteasom erkannt und abgebaut. Bei diesem Mechanismus, der E3-Enzym spezifiziert das Substrat und fungiert als regulatorische Schlüsselkomponente des Ubiquitin/26S Proteasom-System (UPS). E3-Ligasen können unabhängig wie RING-Domäne-Ligasen, oder als Teil eines Multiunter SCF (S handeln,kp1/Cullin/F-box Protein)-Komplex, wie F-Box-Domäne-Ligasen. SCF-vermittelten proteasomalen Abbauwege sind in die Regulation der Transkription, Zellzyklus, Signaltransduktion 5-10 und vielen anderen wichtigen Zellfunktionen beteiligt. Neben diesen kritischen Rolle bei der Regulation von zellulären Prozessen, UPS nimmt die zentrale Bühne in vielen Pflanzen-Pathogen-Interaktionen. Zum Beispiel zunehmende Hinweise darauf, dass verschiedene Pflanzenkrankheitserreger, einschließlich Agrobacterium tumefaciens, verlassen sich auf die Host-USV für die Infektionsprozess 11 zu erleichtern. Agrobacterium entlockt neoplastischen Wucherungen an Pflanzen, die ihren natürlichen Wirten repräsentieren, und es kann auch verwandeln eine breite Palette von anderen Eukaryoten aus Pilzen 1,2 auf menschliche Zellen 12,13. Während der Infektion, Agrobacterium exportiert eine DNA-Element (T-DNA) und mehrere Virulenz (Vir)-Proteine ​​in die Wirtszelle 12-13. Eines dieser Proteine ​​ist VirF die erste F-Box-Protein gefundenvon einem prokaryotischen Genom 14 codiert werden. Im Rahmen der SCF-Ubiquitin-Ligase-Komplex, VirF, und seine funktionellen Homolog Host VBF 15, erleichtern Agrobacterium-Infektion über die USV-vermittelten Proteinabbau, die vermutlich erleichtert Uncoating der bakteriellen Invasion T-DNA aus Bakterien-und der dazugehörigen Wirtsproteine, VirE2 VIP1 und jeweils 16,17. Interessanterweise sind viele F-Box-Proteine, einschließlich VirF, intrinsisch instabil aufgrund ihrer eigenen Proteolyse, die durch autoubiquitination Aktivität 18,19 oder durch andere E3-Ligasen, für das F-Box-Proteine ​​können als Substrate dienen 20-23 vermittelt wird. Bei der Untersuchung von biochemischen Aktivitäten von F-Box-Proteine, andere Ubiquitin-Ligasen, und / oder ihre Substrate, wäre es sehr nützlich, um einen einfachen und zuverlässigen Test für den proteasomalen Abbau zu verwenden. Hier beschreiben wir ein solches Protokoll für die Analyse der Proteinstabilität in einer ZelleFreies System. In diesem Assay wird die Stabilität des UPS Substrat in Gegenwart oder Abwesenheit eines der wesentlichen Bestandteile des proteasomalen Abbau-Weges, wie ein F-Box-Protein, in einem zellfreien System untersucht. Generell sprechen wir die getestet Protein (e) in Pflanzengeweben, bereiten zellfreien Extrakten aus diesen Geweben und überwachen die Mengen des Proteins (e) von Interesse durch Western-Blot. Die USV-abhängigen Mechanismus des Proteinabbaus wird durch die Aufnahme von spezifischen Proteasom-Inhibitoren und / oder mit Koexpression von dominant-negative Form eines SCF-Komponente Cullin demonstriert. Während wir veranschaulichen diesen Test unter Verwendung proteasomalen Abbau des Arabidopsis VIP1 17 Protein durch die F-Box-Protein VBF 15, kann es verwendet werden, um die Stabilität der anderen proteasomalen Substraten zu untersuchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="662">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Protein assay kit</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">500-0001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Proteinase inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Mini-Protean system</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">165-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Semi-dry western blotting SD electrotransfer system</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Affinity Purified Rabbit Anti-Ha</td>
			<td style="width:129px;">icllab</td>
			<td>RHGT-45A-Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate</td>
			<td style="width:129px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">31460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane</td>
			<td style="width:129px;">Pall Corportation</td>
			<td style="width:119px;">27377-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Immobilon western chemiluminescent HRP substrate</td>
			<td style="width:129px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">WBKL S0 050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">MG132</td>
			<td style="width:129px;">EMD Millipore</td>
			<td>474790-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Lactacystin</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate</td>
			<td style="width:129px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">35055</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assaying proteasomal degradation in a cell-free system in plants

Der Ubiquitin-Proteasom-Weg für den Proteinabbau wurde als einer der wichtigsten Mechanismen für die Regulierung eines breiten Spektrums von Zellfunktionen in praktisch allen eukaryontischen Organismen entstanden. Insbesondere bei Pflanzen, die Ubiquitin/26S Proteasom-System (UPS) regelt Proteinabbau und trägt wesentlich zur Entwicklung einer Vielzahl von Prozessen, einschließlich Immunantwort, die Entwicklung und den programmierten Zelltod. Darüber hinaus zunehmende Hinweise darauf, dass zahlreiche Pflanzenkrankheitserregern wie Agrobacterium, nutzen die Host-UPS für eine effiziente Infektion, die Bedeutung der USV in Pflanzen-Pathogen-Interaktionen. Die Substratspezifität der USV wird von der E3-Ubiquitin-Ligase, die in Abstimmung mit den E1-und E2-Ligasen wirkt, um spezifische Protein-Moleküle, die für Abbau bestimmt, indem es an diese Ketten von Ubiquitin-Moleküle zu erkennen und zu kennzeichnen erreicht. Eine Klasse der E3-Ligasen ist der SCF (Skp1 / CUllin / F-Box-Protein)-Komplex, der spezifisch das UPS Substrate und richtet sie für Ubiquitinierung über seine F-Box-Protein-Komponente. Um eine mögliche Rolle des UPS in einem biologischen Prozess von Interesse zu untersuchen, ist es wichtig, ein einfaches und zuverlässiges Assay für UPS-vermittelte Proteinabbau zu entwickeln. Hier beschreiben wir einen solchen Assay unter Verwendung einer Pflanzenzelle freies System. Dieser Test kann für Studien über die Rolle der regulierten Proteinabbau in verschiedenen zellulären Prozessen angepasst werden, mit einem besonderen Fokus auf die F-Box-Protein-Substrat-Wechselwirkungen.

Fig. 1, von Zaltsman et al. 17 angepasst, veranschaulicht repräsentative Experimente zum Nachweis von proteasomalen Abbau in einem zellfreien System. Insbesondere zeigen wir, Destabilisierung einer Anlage Verteidigungs Protein VIP1 von der VBF F-Box-Protein über den SCF VBF Weg in N. benthamiana. Arabidopsis VBF-und HA-markierten VIP1 (HA-VIP1)-Proteine ​​wurden transient koexprimiert und HA-Protein innerhalb VIP1 Inhalt Extrakte der Blätter zum Au...

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Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

Gezielte Proteinabbau stellt einen wichtigen Regulationsmechanismus für die Zellfunktion. Es tritt über eine konservierte Ubiquitin-Proteasom-Weg, der Polyubiquitinketten an das Zielprotein, die dienen dann als molekulare &quot;Tags&quot; für die 26S-Proteasom isst. Hier beschreiben wir eine einfache und zuverlässige zellfreien Assays für den proteasomalen Abbau von Proteinen.

Untersuchen proteasomalen Abbau in einem zellfreien System in Pflanzen

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.3K Aufrufe.  Stony Brook University, State University of New York.  Gezielte Proteinabbau stellt einen wichtigen Regulationsmechanismus für die Zellfunktion. Es tritt über eine konservierte Ubiquitin-Proteasom-Weg, der Polyubiquitinketten an das Zielprotein, die dienen dann als molekulare "Tags" für die 26S-Proteasom isst. Hier beschreiben wir eine einfache und zuverlässige zellfreien Assays für den proteasomalen Abbau von Proteinen. 

Serie: Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

Maintaining Wolbachia in Cell-free Medium

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ascertain the viability of the purified Wolbachia and (3) maintain the now extracellular Wolbachia in cell-free medium.  Purified Wolbachia remain alive in the extracellular phase but do not replicate until re-inoculated into eukaryotic cells.  Extracellular Wolbachia purified in this manner will remain viable for at least a week at room temperature, and possibly longer.  Purified Wolbachia are suitable for micro-injection, DNA extraction and other applications. 


This video describes a method for purifying Wolbachia pipientis from an Anopheles gambiae cell line and then culturing the endosymbiont in cell-free medium. An assay for viability of the bacterium is demonstrated.

Die Aufrechterhaltung Wolbachia in zellfreien Medium

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ...

Forschung

Biologie

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

Untersuchen der Kinase-Aktivität von LRRK2 In-vitro-</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

Rekonstitution von β-Catenin-Abbau in<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main lysosome-dependent pathway is called autophagy, while the primary non-lysosomal method for protein catabolism is the ubiquitin-proteasome system. Recent studies in model organisms suggest that the activity of both autophagy and the ubiquitin-proteasome system is not constant across the day but instead varies according to a daily (circadian) rhythm. The ability to measure biological rhythms in protein turnover is important for understanding how cellular quality control is achieved and for understanding the dynamics of specific proteins of interest. Here we present a standardized protocol for quantifying autophagic and proteasomal flux in vivo that captures the circadian component of protein turnover. Our protocol includes details for mouse handling, tissue processing, fractionation, and autophagic flux quantification using mouse liver as the starting material.

We describe our protocol for measuring biological rhythms in protein catabolism via autophagy and the proteasome in mouse liver.

Messung von diurnalen Rhythmen in autophagischen und proteasomalen Flux

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main ...

A Simple Protocol for Mapping the Plant Root System Architecture Traits

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar tolerance to environmental challenges. An experimental protocol is presented for setting up the hydroponic system, plantlet growth, RSA spreading, and imaging. The approach used a magenta box-based hydroponic system containing polypropylene mesh supported by polycarbonate wedges. Experimental settings are exemplified by assessing the RSA of the plantlets under varying nutrient (phosphate [Pi]) supply. The system was established to examine the RSA of Arabidopsis, but it is readily adaptable to study other plants like Medicago sativa (Alfalfa). Arabidopsis thaliana (Col-0) plantlets are used in this investigation as an example to understand the plant RSA. Seeds are surface sterilized by treating ethanol and diluted commercial bleach, and kept at 4 &#176;C for stratification. The seeds are germinated and grown on a liquid half-MS medium on a polypropylene mesh supported by polycarbonate wedges. The plantlets are grown under standard growth conditions for the desired number days, gently picked out from the mesh, and submersed in water-containing agar plates. Each root system of the plantlets is spread gently on the water-filled plate with the help of a round art brush. These Petri plates are photographed or scanned at high resolution to document the RSA traits. The root traits, such as primary root, lateral roots, and branching zone, are measured using the freely available ImageJ software. This study provides techniques for measuring plant root characteristics in controlled environmental settings. We discuss how to (1) grow the plantlets, and collect and spread root samples, (2) obtain pictures of spread RSA samples, (3) capture the images, and (4) use image analysis software to quantify root attributes. The advantage of the present method is the versatile, easy, and efficient measurement of the RSA traits.

We use simple laboratory tools to examine the root system architecture (RSA) of Arabidopsis and Medicago. The plantlets are grown hydroponically over mesh and spread using an art brush to reveal the RSA. Images are taken using scanning or a high-resolution camera, then analyzed with ImageJ to map traits.

Ein einfaches Protokoll zur Kartierung der Architekturmerkmale des Pflanzenwurzelsystems

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar ...

Quantifizierung der Fettinfiltration der Skelettmuskulatur durch Dezellularisierung

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic disorders, and dystrophies. Clinically in human populations, fatty infiltration is assessed using noninvasive methods, including computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), and ultrasound (US). Although some studies have used CT or MRI to quantify fatty infiltration in mouse muscle, costs and insufficient spatial resolution remain challenging. Other small animal methods utilize histology to visualize individual adipocytes; however, this methodology suffers from sampling bias in heterogeneous pathology. This protocol describes the methodology to qualitatively view and quantitatively measure fatty infiltration comprehensively throughout intact mouse muscle and at the level of individual adipocytes using decellularization. The protocol is not limited to specific muscles or specific species and can be extended to human biopsy. Additionally, gross qualitative and quantitative assessments can be made with standard laboratory equipment for little cost, making this procedure more accessible across research laboratories.

Autor im Rampenlicht: Dezellularisierungsbasierte Quantifizierung der Fettinfiltration der Skelettmuskulatur  

The present study describes decellularization-based methodologies for visualizing and quantifying intramuscular adipose tissue (IMAT) deposition through intact muscle volume, as well as quantifying metrics of individual adipocytes that comprise IMAT.

Dezellularisierungsbasierte Quantifizierung der Fettinfiltration der Skelettmuskulatur

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic ...

Einbettung von CFPS-Reaktionen in eine Vielzahl von Hydrogel-Matrizen

Methods for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Macro-Scale Hydrogels

Synthetic gene networks provide a platform for scientists and engineers to design and build novel systems with functionality encoded at a genetic level. While the dominant paradigm for the deployment of gene networks is within a cellular chassis, synthetic gene networks may also be deployed in cell-free environments. Promising applications of cell-free gene networks include biosensors, as these devices have been demonstrated against biotic (Ebola, Zika, and SARS-CoV-2 viruses) and abiotic (heavy metals, sulfides, pesticides, and other organic contaminants) targets. Cell-free systems are typically deployed in liquid form within a reaction vessel. Being able to embed such reactions in a physical matrix, however, may facilitate their broader application in a wider set of environments. To this end, methods for embedding cell-free protein synthesis (CFPS) reactions in a variety of hydrogel matrices have been developed. One of the key properties of hydrogels conducive to this work is the high-water reconstitution capacity of hydrogel materials. Additionally, hydrogels possess physical and chemical characteristics that are functionally beneficial. Hydrogels can be freeze-dried for storage and rehydrated for use later. Two step-by-step protocols for the inclusion and assay of CFPS reactions in hydrogels are presented. First, a CFPS system can be incorporated into a hydrogel via rehydration with a cell lysate. The system within the hydrogel can then be induced or expressed constitutively for complete protein expression through the hydrogel. Second, cell lysate can be introduced to a hydrogel at the point of polymerization, and the entire system can be freeze-dried and rehydrated at a later point with an aqueous solution containing the inducer for the expression system encoded within the hydrogel. These methods have the potential to allow for cell-free gene networks that confer sensory capabilities to hydrogel materials, with the potential for deployment beyond the laboratory.

Autor im Rampenlicht: Ein neuartiger Ansatz zur Einbettung zellfreier Proteinsynthesereaktionen in Hydrogele 

Here, we present two protocols for embedding cell-free protein synthesis reactions in macro-scale hydrogel matrices without the need for an external liquid phase.

Methoden zur Einbettung zellfreier Proteinsynthesereaktionen in makroskalige Hydrogele

Synthetic gene networks provide a platform for scientists and engineers to design and build novel systems with functionality encoded at a genetic level. ...