Die Arbeit, die zu dieser Veröffentlichung hat die Finanzierung aus dem Marie-Curie-Programm COFUND &quot;U-Mobility&quot;, die von der Universität von Malaga und der Europäischen Union 7. Rahmenprogramm (FP7/2007-2013) unter GA Nr. 246550 kofinanziert erhalten. Die Arbeit in unserem Labor wird durch Zuschüsse von NIH, USDA / NIFA, NSF, BARD, und BSF VC unterstützt

1. Die Proteinexpression <ol><li> Wahl des Expressionssystems System auswählen, das heißt, Vektoren und Vektorfreisetzungsverfahren am besten geeignet für die Expression des Proteins von Interesse in der spezifischen Modellorganismus / Zelle. Beachten Sie, dass unser Assay erfordert die Expression der untersuchten Proteine ​​in leicht nachweisbaren Mengen, die am besten durch eine transiente Transformation einer großen Anzahl von Zellen erreicht wird. In Pflanzen, zum Beispiel, ist diese mit binären Plasmide als Expressionsvektoren und Agrobacterium als Abgabesystem am besten erreicht. </li><li> Bau von binären Expressionsvektoren Klonierung der kodierenden Sequenz (en) des Proteins (e) von Interesse in einen Expressionsvektor entweder allein oder in translationale Fusion an ein Epitop-Tag. Verwenden Vektoren passend zum gewählten Expressionssystem und molekularbiologischen Standardverfahren für die Gen-Klonen. Für Agrobacterium-vermittelten Gentransfer beschäftigen binäre Vektoren und führen sie, auch mit Standard Protokolle in einen Agrobacterium-Stamm EHA 105, wie für die nachfolgende Inokulation von Pflanzengeweben. </li><li> Auswahl der Pflanzenarten Aus den Pflanzen in dem das Protein (e) von Interesse exprimiert wird. Beachten Sie, dass, während alle Pflanzenarten anfällig für Agrobacterium-vermittelte genetische Transformation verwendet werden kann, unser Pflanzenarten der Wahl ist Nicotiana benthamiana, die leicht gewachsen ist, sehr anfällig für Agrobacterium und hat große Blätter, die leicht eingeimpft werden. </li><li> Das Pflanzenwachstum Wachsen einer Pflanze für 4 bis 6 Wochen in einem Topf mit Pro-Mix BX in einem Topf (20 cm x 20 cm x 20 cm) unter umweltkontrollierten Bedingungen (z. B. Wachstumskammer) des langen Tag (dh 16 h von 130 uE -150 m-2 s-1 Licht bei 23 ° C und 8 h Dunkelheit bei 20 ° C) und 40-65% relativer Luftfeuchtigkeit. 1.5.2 Düngung gelegentlich mit handelsüblichen Produkten pro Herstellers. Sobald die Pflanze angebaut wird, wählen SieBlätter mit der Größe von 50 mm x 70 mm oder größer (diese Längenmessungen beinhalten nicht die Blattstiel), Agrobacterium Impfung. </li><li> Inokulation mit Agrobacterium Wachsen Agrobacterium-Stamm, der das binäre Konstrukt getestet Protein (e) von Schritt 1.3 über Nacht bei 28 º C in YEP-Medium (1% Pepton, 1% Hefeextrakt und 0,5% NaCl) mit geeigneten Antibiotika (z. B. 100 mg ergänzt exprimieren / l Streptomycin und 10 mg / l Rifampicin pPZP-RSC2-basierte Vektoren 24-25). 1.6.2 Zentrifugation der Zellen, resuspendiert in Puffer Infiltration OD 600 = 0,5 [10 mM MgCl 2, 10 mM MES (pH 5,6), 100 &amp;mgr; M Acetosyringon] und Inkubation für 2 h bei Raumtemperatur. Infiltrieren die Kultur in der unterseits von einem Blatt, mit einer 1 ml-Spritze ohne Nadel, beachten Sie, dass die Blätter in situ angeimpft, während der Pflanze verbunden ist. 1.6.3 Nach der Infiltration, wachsen die Anlage für 72 h unter dem Lichtregime von 16 h 130-150 &amp;Nr. 181, E m-2 s-1 Licht bei 23 ° C / 8 h Dunkelheit bei 20 ° C vor der Ernte. </li><li> Die Anwendung der proteasomalen Inhibitoren Um die Vorstellung, dass die getesteten Protein (e) über einen Proteasom-Weg abgebaut unterstützt, verwenden spezifische Proteasom-Inhibitoren MG132 und Lactacystin 28-29, die reduzieren oder sogar blockieren Abbau sollte. Vier Stunden vor der Ernte (siehe Schritt 2.1), infiltrieren die Agrobacterium geimpften Blattflächen mit 10 uM MG132 (EMD Millipore) oder 10 uM Lactacystin (Sigma-Aldrich) oder Modelle behandeln das Blatt mit den jeweiligen Lösemittel, dh 0,1% DMSO oder destilliertes Wasser. </li></ol> 2. Herstellung von zellfreien Extrakten <ol><li> Blatternte Ernte der inokulierten Bereichen des Blattes, üblicherweise ca. 200-400 mg Frischgewicht, und schleifen sie in ein feines Pulver in flüssigem Stickstoff. Alternativ schlagen die Wulst-Gewebe, mit jeder Wulst-Schläger (zB Biospec) oder eine Zahn amalgamator (zB TPC Erweiterte<html> Technologies) direkt in der Abbaupuffer (siehe Schritt 2.2). </li><li> Proteinextraktion Vorbereitung Gesamtproteinextrakt durch Anordnen des Grundgewebes in 500 ul Puffer Abbau [50 mM Tris-HCL (pH 7,5), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl 2, 5 mM DTT, 5 mM Adenosin-5&#39;-Triphosphat, und 1x Protease-Inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich)]. Beachten Sie, dass der Protease-Inhibitor-Cocktail betrifft hauptsächlich Serin, Cystein, Asparaginsäure, und Metalloproteasen und nicht mit dem 26S-Protease beeinträchtigen. Der Extrakt wird durch zwei aufeinanderfolgende Zentrifugationen bei 12.000 × g für 5 min. </li><li> Protein-Abbaureaktion Übertragen gleichen Volumina Extrakte, normalerweise 20 &amp;mgr; l, um Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren bei Raumtemperatur zur Erhöhung Zeiträume. Typischerweise Probe zum Zeitpunkt Null und 5, 10, 15, 20 und 30 min Zeitpunkten. Stopp-Reaktionen durch Kochen in SDS-Gel-Probenpuffer, und analysieren sie durch Western-Blot. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 3. Erkennen Proteinabbau durch Immunoblotting <ol><li> Gel-Elektrophorese 3.1.1 Auflösen von Proteinproben durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese und Elektrotransfer der aufgetrennten Proteine ​​auf eine Nitrocellulosemembran nach dem Standardprotokoll 30. 3.1.2 Bestimmen der Proteinkonzentration mit der Bradford-Methode (Bio-Rad), und laden 50-80 ug Gesamtprotein pro Spur. Stellen Sie sicher, dass alle Proben gleich geladen. Zum Laden steuert, zu vergleichen, Intensitäten einer ubiquitäres Protein-Arten, wie putative RuBisCo großen Ketten, die als eine Hauptbande mit einer relativen elektrophoretischen Beweglichkeit von etwa 50 kDa wandern, sie können auf Coomassie-Blau-gefärbten Gelen oder Ponceau S-oder erfasst werden Fluoreszenz SYPRO Rubin-gefärbten Nitrozellulosemembranen. </li><li> Blockierung Blockieren der Membran mit 5% Magermilch in TBST (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) für 1 h bei Raumtemperatur. </li&gt; <li> Primärer Antikörper Verdünnte primäre anti-Epitop-Antikörpers in 1% Magermilch in TBST auf die vom Hersteller empfohlene Konzentration und Inkubation mit dem blockierten Membran für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 º C unter leichtem Schütteln. </li><li> Spülung Spülen der Membran in 20 ml TBST für 15 Minuten wieder abgespült und zweimal für 5 min bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. </li><li> Sekundäre Antikörper Verdünnte sekundäre Antikörper (zB Anti-Kaninchen-IgG) mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) in 1% Magermilch in TBST konjugiert, wie vom Hersteller empfohlen, und Inkubation mit der Membran für 1 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. </li><li> Entdeckung Spülen der Membran wieder wie in Schritt 3.4 beschrieben. Nach dem letzten Spülvorgang in TBST, Visualisierung der Proteine ​​von Interesse mit einem HRP chemilumineszierendes Substrat, meist unter Verwendung eines ECL-Kits. </li></ol>

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R., Shirasu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+ubiquitination+in+the+regulation+of+plant+defence+against+pathogens.">Role of ubiquitination in the regulation of plant defence against pathogens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 6, 307-311 (2003).</li><li>Itoh, H., Matsuoka, M., Steber, C. 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Cell. 4, 799-812 (2003).</li><li>Magori, S., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+counteracts+host-induced+degradation+of+its+F-box+protein+effector.">Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector.</a> Sci. Signal. 4, (2011).</li><li>Margottin-Goguet, F., Hsu, J. Y., Loktev, A., Hsieh, H. M., Reimann, J. D., Jackson, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prophase+destruction+of+Emi1+by+the+SCFbTrCP/Slimb+ubiquitin+ligase+activates+the+anaphase+promoting+complex+to+allow+progression+beyond+prometaphase.">Prophase destruction of Emi1 by the SCFbTrCP/Slimb ubiquitin ligase activates the anaphase promoting complex to allow progression beyond prometaphase.</a> Dev. Cell. 4, 813-826 (2003).</li><li>Tzfira, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pSAT+vectors:+a+modular+series+of+plasmids+for+fluorescent+protein+tagging+and+expression+of+multiple+genes+in+plants.">pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants.</a> Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).</li><li>Goderis, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+set+of+modular+plant+transformation+vectors+allowing+flexible+insertion+of+up+to+six+expression+units.">A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units.</a> Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).</li><li>Lee, L. Y., Gelvin, S. 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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dieser Assay beruht auf der Expression der untersuchten Proteine ​​in Pflanzengeweben, so tritt offensichtlich das Potential proteasomalen Abbau Verfahren bereits in den lebenden Geweben. Wir untersuchen Protein Destabilisierung jedoch nur in den Extrakten, mit der Zeitnullprobe als erste Bezugspunkt dient. Daher definieren wir als zellfreie Assays. Ein wichtiger Aspekt für den Erfolg dieses Assays ist die richtige Wahl des Expressionsvektors aus dem das Protein getestet (n) erzeugt. Es...

Die Ubiquitin/26S Proteasom-Weg wird als weit verbreitete Mechanismus zur Steuerung der verschiedenen biologischen Reaktionen, einschließlich Transkriptionsregulation, Zellzyklusprogression und Signaltransduktion, Rezeptor-Down-Regulation oder Endozytose ua verarbeitet 1-4 Schwellen. In diesem Weg wird das Zielprotein durch Ubiquitin-Reste, die zunächst über eine Thiolester-Bindung an Ubiquitin-aktivierendes Enzym E1 befestigt sind und dann zu einem Cystein-Aminosäurerest von Ubiquitin-Konjugation Enzym E2 transloziert markiert, und schließlich in Wechselwirkung mit E2 E3-Ubiquitin-Ligase , was Polyubiquitinierung des Proteinsubstrats. Schließlich werden die polyubiquitiniert Proteine ​​durch das 26S-Proteasom erkannt und abgebaut. Bei diesem Mechanismus, der E3-Enzym spezifiziert das Substrat und fungiert als regulatorische Schlüsselkomponente des Ubiquitin/26S Proteasom-System (UPS). E3-Ligasen können unabhängig wie RING-Domäne-Ligasen, oder als Teil eines Multiunter SCF (S handeln,kp1/Cullin/F-box Protein)-Komplex, wie F-Box-Domäne-Ligasen. SCF-vermittelten proteasomalen Abbauwege sind in die Regulation der Transkription, Zellzyklus, Signaltransduktion 5-10 und vielen anderen wichtigen Zellfunktionen beteiligt. Neben diesen kritischen Rolle bei der Regulation von zellulären Prozessen, UPS nimmt die zentrale Bühne in vielen Pflanzen-Pathogen-Interaktionen. Zum Beispiel zunehmende Hinweise darauf, dass verschiedene Pflanzenkrankheitserreger, einschließlich Agrobacterium tumefaciens, verlassen sich auf die Host-USV für die Infektionsprozess 11 zu erleichtern. Agrobacterium entlockt neoplastischen Wucherungen an Pflanzen, die ihren natürlichen Wirten repräsentieren, und es kann auch verwandeln eine breite Palette von anderen Eukaryoten aus Pilzen 1,2 auf menschliche Zellen 12,13. Während der Infektion, Agrobacterium exportiert eine DNA-Element (T-DNA) und mehrere Virulenz (Vir)-Proteine ​​in die Wirtszelle 12-13. Eines dieser Proteine ​​ist VirF die erste F-Box-Protein gefundenvon einem prokaryotischen Genom 14 codiert werden. Im Rahmen der SCF-Ubiquitin-Ligase-Komplex, VirF, und seine funktionellen Homolog Host VBF 15, erleichtern Agrobacterium-Infektion über die USV-vermittelten Proteinabbau, die vermutlich erleichtert Uncoating der bakteriellen Invasion T-DNA aus Bakterien-und der dazugehörigen Wirtsproteine, VirE2 VIP1 und jeweils 16,17. Interessanterweise sind viele F-Box-Proteine, einschließlich VirF, intrinsisch instabil aufgrund ihrer eigenen Proteolyse, die durch autoubiquitination Aktivität 18,19 oder durch andere E3-Ligasen, für das F-Box-Proteine ​​können als Substrate dienen 20-23 vermittelt wird. Bei der Untersuchung von biochemischen Aktivitäten von F-Box-Proteine, andere Ubiquitin-Ligasen, und / oder ihre Substrate, wäre es sehr nützlich, um einen einfachen und zuverlässigen Test für den proteasomalen Abbau zu verwenden. Hier beschreiben wir ein solches Protokoll für die Analyse der Proteinstabilität in einer ZelleFreies System. In diesem Assay wird die Stabilität des UPS Substrat in Gegenwart oder Abwesenheit eines der wesentlichen Bestandteile des proteasomalen Abbau-Weges, wie ein F-Box-Protein, in einem zellfreien System untersucht. Generell sprechen wir die getestet Protein (e) in Pflanzengeweben, bereiten zellfreien Extrakten aus diesen Geweben und überwachen die Mengen des Proteins (e) von Interesse durch Western-Blot. Die USV-abhängigen Mechanismus des Proteinabbaus wird durch die Aufnahme von spezifischen Proteasom-Inhibitoren und / oder mit Koexpression von dominant-negative Form eines SCF-Komponente Cullin demonstriert. Während wir veranschaulichen diesen Test unter Verwendung proteasomalen Abbau des Arabidopsis VIP1 17 Protein durch die F-Box-Protein VBF 15, kann es verwendet werden, um die Stabilität der anderen proteasomalen Substraten zu untersuchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="662">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Protein assay kit</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">500-0001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Proteinase inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Mini-Protean system</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">165-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Semi-dry western blotting SD electrotransfer system</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Affinity Purified Rabbit Anti-Ha</td>
			<td style="width:129px;">icllab</td>
			<td>RHGT-45A-Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate</td>
			<td style="width:129px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">31460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane</td>
			<td style="width:129px;">Pall Corportation</td>
			<td style="width:119px;">27377-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Immobilon western chemiluminescent HRP substrate</td>
			<td style="width:129px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">WBKL S0 050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">MG132</td>
			<td style="width:129px;">EMD Millipore</td>
			<td>474790-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Lactacystin</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate</td>
			<td style="width:129px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">35055</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assaying proteasomal degradation in a cell-free system in plants

Der Ubiquitin-Proteasom-Weg für den Proteinabbau wurde als einer der wichtigsten Mechanismen für die Regulierung eines breiten Spektrums von Zellfunktionen in praktisch allen eukaryontischen Organismen entstanden. Insbesondere bei Pflanzen, die Ubiquitin/26S Proteasom-System (UPS) regelt Proteinabbau und trägt wesentlich zur Entwicklung einer Vielzahl von Prozessen, einschließlich Immunantwort, die Entwicklung und den programmierten Zelltod. Darüber hinaus zunehmende Hinweise darauf, dass zahlreiche Pflanzenkrankheitserregern wie Agrobacterium, nutzen die Host-UPS für eine effiziente Infektion, die Bedeutung der USV in Pflanzen-Pathogen-Interaktionen. Die Substratspezifität der USV wird von der E3-Ubiquitin-Ligase, die in Abstimmung mit den E1-und E2-Ligasen wirkt, um spezifische Protein-Moleküle, die für Abbau bestimmt, indem es an diese Ketten von Ubiquitin-Moleküle zu erkennen und zu kennzeichnen erreicht. Eine Klasse der E3-Ligasen ist der SCF (Skp1 / CUllin / F-Box-Protein)-Komplex, der spezifisch das UPS Substrate und richtet sie für Ubiquitinierung über seine F-Box-Protein-Komponente. Um eine mögliche Rolle des UPS in einem biologischen Prozess von Interesse zu untersuchen, ist es wichtig, ein einfaches und zuverlässiges Assay für UPS-vermittelte Proteinabbau zu entwickeln. Hier beschreiben wir einen solchen Assay unter Verwendung einer Pflanzenzelle freies System. Dieser Test kann für Studien über die Rolle der regulierten Proteinabbau in verschiedenen zellulären Prozessen angepasst werden, mit einem besonderen Fokus auf die F-Box-Protein-Substrat-Wechselwirkungen.

Fig. 1, von Zaltsman et al. 17 angepasst, veranschaulicht repräsentative Experimente zum Nachweis von proteasomalen Abbau in einem zellfreien System. Insbesondere zeigen wir, Destabilisierung einer Anlage Verteidigungs Protein VIP1 von der VBF F-Box-Protein über den SCF VBF Weg in N. benthamiana. Arabidopsis VBF-und HA-markierten VIP1 (HA-VIP1)-Proteine ​​wurden transient koexprimiert und HA-Protein innerhalb VIP1 Inhalt Extrakte der Blätter zum Au...

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Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

Gezielte Proteinabbau stellt einen wichtigen Regulationsmechanismus für die Zellfunktion. Es tritt über eine konservierte Ubiquitin-Proteasom-Weg, der Polyubiquitinketten an das Zielprotein, die dienen dann als molekulare &quot;Tags&quot; für die 26S-Proteasom isst. Hier beschreiben wir eine einfache und zuverlässige zellfreien Assays für den proteasomalen Abbau von Proteinen.

Untersuchen proteasomalen Abbau in einem zellfreien System in Pflanzen

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.2K Aufrufe.  Stony Brook University, State University of New York.  Gezielte Proteinabbau stellt einen wichtigen Regulationsmechanismus für die Zellfunktion. Es tritt über eine konservierte Ubiquitin-Proteasom-Weg, der Polyubiquitinketten an das Zielprotein, die dienen dann als molekulare "Tags" für die 26S-Proteasom isst. Hier beschreiben wir eine einfache und zuverlässige zellfreien Assays für den proteasomalen Abbau von Proteinen. 