Unser Protokoll ermöglicht die Messung der Rate der Autophagie und proteasomale Aktivität in Mausgeweben und ist empfindlich genug, um zirkadiane Variationen innerhalb dieser Aktivitäten zu erkennen. Diese Technik kann in vivo verwendet werden, um Proteinkatabolismus in Zellen und Geweben zu bewerten und die erforderlichen Materialien sind relativ technologiearm und für jedes molekularbiologische Labor zugänglich. Demonstrieren das Verfahren wird Michail Ryzhikov, ein Post-Doc aus meinem Labor sein.
15 Minuten vor jedem Zeitpunkt die Leupeptin- und Bortezomib-Lagerlösungen auf Raumtemperatur erwärmen und das aufgetaute Bortezomib in sterilem PBS verdünnen, um eine Arbeitslösung von 50 Milligramm pro Milliliter zu ergeben. Zur Verabreichung von Proteasehemmern injiziert intraperitoneal 40 Milligramm pro Kilogramm Leupeptin oder 1,6 Mikrogramm pro Kilogramm Bortezomib in jedes Versuchstier. Für eine Negative Kontrolle, injizieren Sie Mäuse mit 0,5 Milliliter PBS.
Bringen Sie jede Maus in Käfige zurück, die nach der Art der erhaltenen Behandlung gruppiert sind, während sie injiziert werden, und erfassen Sie die Zeit, in der die Mäuse behandelt oder in einer standardisierten Tabelle bearbeitet werden. Zwei Stunden nach der Injektion den linken Leberlappen, der von jedem geopferten Versuchstier geerntet wurde, in sieben Milliliter eiskalten Homogenisierungspuffer in entsprechend beschrifteten 15 Milliliter konischen Röhren auf Eis untertauchen. Wenn alle Proben erworben sind, übertragen Sie die erste Probe und das gesamte Volumen des Homogenisierungspuffers in einen 15 Milliliter-Kapazität Dounce Homogenisator und homogenisieren Sie die Probe mit 10 Schlägen des losen Kolbens und 15 Schlägen des engen Kolbens.
Bringen Sie das resultierende Rohhomogenat in sein ursprüngliches Rohr zurück und homogenisieren Sie die nächste Probe, wie gerade gezeigt. Wenn alle Proben homogenisiert sind, sedimentieren Sie die homogenaten Kerne und Trümmer durch Zentrifugation und übertragen Sie die oberen vier Milliliter jedes postnuklearen Überstandes in neue 15 Milliliter-Rohre. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration dieser ersten Überstandfraktion nach Standardprotokollen und gleichen Die Konzentrationen aller Proben auf 2,1 Milligramm pro Milliliter mit frischem Homogenisierungspuffer bei Bedarf aus.
Zur nachgelagerten Analyse und Qualitätsverbesserung werden 500 Mikroliter der normalisierten Gesamtproteinfraktionen in 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhren für eine Speicherung von minus 80 Grad Celsius umgewandelt. Übertragen Sie 1,5 Milliliter der verbleibenden Gesamtensproteinfraktionen in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen und pellet die Proteinproben durch Zentrifugation. Übertragen Sie einen Milliliter der resultierenden Überreste der zweiten Fraktion in neue Mikrozentrifugenröhren auf Eis und aspirieren Sie die restlichen Überreste.
Waschen Sie die 3K-Pellets zweimal in 1,5 Milliliter frischer Kalthomogenisierungspuffer pro Wäsche, dann setzen Sie das 3K-Pellet in 200 Mikroliter SDS-PAGE-Probenpuffer wieder auf und kochen Sie die Proben bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten. Drehen Sie die Überwälstmittel der zweiten Fraktion 20 Minuten lang bei 20.000 x g und vier Grad Celsius und übertragen Sie die resultierenden dritten zytoplasmatischen Überrupungsmittel in ein neues Mikrozentrifugenrohr. Kombinieren Sie für die SDS-PAGE-Analyse 150 Mikroliter der zytoplasmatischen Fraktion mit 50 Mikrolitern 4x SDS-PAGE-Probenpuffer und kochen Sie die zytoplasmatischen Fraktionsproben bei 95 Grad Celsius fünf Minuten lang.
Den restlichen Überstand aus den 20K Pellets ansaugen und die Proben zweimal mit 1,5 Milliliter frischer Kalthomogenisierungspuffer pro Wäsche waschen. Dann setzen Sie das 20K Pellet in 100 Mikroliter SDS-PAGE Probenpuffer für das Kochen bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten wieder aus. Für die Western Blot-Analyse, seriell verdünnt Standard-Kurvenproteine ein s bis drei in 1x Probenpuffer für insgesamt sechs Verdünnungen und laden 10 Mikroliter jeder Standard-Kurvenprobe in einen Brunnen von 26 gut vier bis 12%SDS-PAGE Midi-Gel, dann laden Sie einen vorgefärbten kommerziellen Molekulargewichtsstandard.
Um den autophagischen Fluss zu messen, laden Sie 12 Mikroliter jeder 3K-Pelletprobe in die entsprechenden Brunnen. Um den proteasomalen Fluss zu messen, laden Sie 12 Mikroliter jeder zytoplasmatischen Fraktion in die entsprechenden Brunnen. Wenn alle Kontroll- und Versuchsproben geladen sind, trennen Sie die Proteinproben durch SDS-PAGE, bevor Sie die Proteine gemäß den Standardprotokollen auf Polyvinylidenfluoridmembranen übertragen.
Zur Analyse des makroautophagischen Flusses blotmembranen Membranen, die die 3K-Pelletproben mit Anti-p62- oder Anti-LcB-Antikörpern enthalten, über Nacht bei vier Grad Celsius. Zur Analyse des proteasomalen Flusses bloten Membranen, die die zytoplasmatischen Fraktionsproben mit Antilysin 48-Spezifischem Polyubiquitin-Antikörper enthalten, über Nacht bei vier Grad Celsius. Dann stellen Sie die westlichen Flecken mit Standard-Sekundärantikörpern und Bildgebungsgeräten ab.
Um densitometrische Messungen an Interessenbändern sowohl für die Standardkurve als auch für experimentelle Proben durchzuführen, öffnen Sie ein geeignetes Bildanalyse-Softwareprogramm und zeichnen Sie ein langes Rechteck, das das Proteinmonomer von Interesse am unteren Rand des Fleckbildes umfasst, das sich bis an die Oberseite der Membran erstreckt. Kopieren und einfügen, um das Rechteck in die verbleibenden Samples zu verschieben, wobei das Rechteck zwischen den Stichproben konsistent bleibt. Speichern Sie die Quantifizierung in einer Kalkulationstabelle, und generieren Sie eine densitometrische Standardkurve innerhalb der Kalkulationstabelle mithilfe der seriell verdünnten Standardstichprobe in linearer oder polynomiader Regression, um eine am besten passende Standardkurvengleichung zu erhalten.
Mit dieser Gleichung extrapolieren Sie die Menge der Monomere, die innerhalb der Versuchsproben von Interesse sind. Um Flussmessungen zu erhalten, subtrahieren Sie die extrapolierte Proteinmenge jeder behandelten Inhibitorprobe vom Durchschnittswert der PBS-Proben vom gleichen Zeitpunkt. Bewerten Sie dann die statistische Signifikanz der zeitlichen Variation des Proteinumsatzes mit Hilfe von one-way ANOVA.
Die primäre Auslesung für autophagischen Fluss zu einem bestimmten Zeitpunkt ist der Unterschied in der Menge der makroautophagie spezifischen Marker zwischen dem leupeptin behandelt im Vergleich zu den Scheinproben in der Lysosome-angereicherten 3K-Pelletfraktion geteilt durch zwei. In der Regel werden die Ergebnisse auf den Mittelwert normalisiert, der den Vergleich über unabhängige Experimente hinweg vereinfacht. Unser Verfahren zur Messung des proteolytischen Flusses hängt von der Fähigkeit von Leupeptin oder Bortezomib ab, die Ansammlung von Autophagie- und Proteasomensubstraten zu verursachen, was ein zeitabhängiger Prozess ist.
Diese Technik hat die Erforschung ermöglicht, wie biologische Rhythmen Leberprotein-Katabolismus programmieren. Wir hoffen, dass es den Weg für die Untersuchung der Auswirkungen von Krankheiten auf zelluläre Haushaltsfunktionen ebnen wird.
