Wir danken Laurie Lee für das kritische Lesen des Manuskripts. TWC wird von einem American Heart Association Promotionsstipendium (12PRE6590007) unterstützt. MRB wird von einem National Cancer Institute Ausbildungsförderung (T32 CA119925) unterstützt. SSH ist National Institutes of Health (R01DK078640) unterstützt. EL wird von den National Institutes of Health (R01GM081635 und R01GM103926) unterstützt.

1. Vorbereitung der Xenopus-Ei-Extrakt HINWEIS: Jeder Frosch ergibt etwa 1 ml der verwendbaren Ei-Extrakt. Extrakte aus 10 Frösche werden typischerweise zu einer Zeit hergestellt wird, und das Volumen der unten beschriebenen Puffer zur Durchführung einer 10 Frosches Xenopus-Ei-Extrakt prep. Das Puffervolumen kann somit für größere oder kleinere Zubereitungen von Ei-Extrakt eingestellt werden. Preps auf diese Weise erzeugte Proteinkonzentrationen konsequent ergeben ≥ 50 mg / ml. Die Erfassung Eier und Verarbeitung zu extrahieren ist am effizientesten, wenn sie von zwei Personen durchgeführt. (Für die Grundhaltung Frosch Techniken siehe Sive et al. 33). <ol><li> Ei-Sammlung <ol><li> Auffrischen der Frösche, spritzen jeden weiblichen Frosch mit 100 U Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) von einem frisch zubereiteten 250 U / ml Lager. Verwenden Sie ein 3 ml Tuberkulin-Spritze mit einer 27 G-Nadel subkutan zu injizieren, mit der Schrägedie Nadel nach oben in die Rücken Lymphsack, die etwa 1 cm von der Mittellinie von der gekerbten Verfärbungen entlang der Länge der Schenkel des Strahls befindet. </li><li> Shop grundiert Frösche im Wasser (plus 20 mM NaCl, siehe Sive et al. 33) bei 18 ° C für 5-10 Tage. Für stehende Wassertank-Systemen ist die Tierdichte etwa 4 l Wasser pro Weibchen Frosch. HINWEIS: Die Mindestzeit für die Grundierung wirksam werden benötigt 5 Tage, und die Auswirkungen der Grundierung tragen off nach 10 Tagen. </li><li> Bereiten 0.5x Marc Geändert Ringers (MMR)-Lösung aus einer 20x MMR Lager. 20x MMR besteht aus 2 M Natriumchlorid, 40 mM Kaliumchlorid, 40 mM Calciumchlorid, 20 mM Magnesiumchlorid und 100 mM 4 - (2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), pH 7,4. </li><li> Richten Sie Eimer für alle injiziert Frösche (ein Frosch pro 4 l Eimer). HINWEIS: Obwohl mehr als ein Frosch kann in der gleichen Eimer für Eiersammlung gebracht werden, wenn einer der Fröschelegt überwiegend schlechte Qualität Eier, wird ein erheblicher Aufwand erforderlich, um die schlechte Qualität Eier von denen, die für die Herstellung Extrakt sind zu trennen. Somit maximiert die Anzahl von Fröschen im gleichen Behälter, die Menge an Puffer zum Ei zu minimieren Collect ist das Risiko nicht wert. </li><li> Inject 750 U Humanes Choriongonadotropin (HCG) in die dorsale Lymphsack jeder Frosch mit einer 27 G-Nadel, wie in 1.1.1 beschrieben. </li><li> Legen Sie jede der HCG injiziert Frösche in einzelne 4 L Eimer enthält 0,5 x MMR abgekühlt auf 16 ° C </li><li> Legen Sie die Behälter mit den Fröschen in einem 16 ° C-Inkubator, um Eier zu sammeln O / N (15-16 h). HINWEIS: Die Aufrechterhaltung der richtigen Temperatur ist entscheidend für das gesamte Verfahren, von der Erhebung der Vorbereitung Eier Ei-Extrakt. </li></ol></li><li> Dejellying Eier HINWEIS: Die Eier werden mit einer Gallerthülle, die vor der Herstellung Extrakt entfernt werden müssen, abgedeckt. Die Wahrscheinlichkeit der spontanen Lyse der Eier als die Zeit zwische erhöhtn Eiablage und extrahieren Vorbereitung steigt. Somit ist es wichtig, durch die folgenden Schritte so schnell wie möglich ablaufen. <ol><li> Herstellung von 4 l 1x MMR, 50 ml 0,1 x MMR, und 400 ml 2% Cystein, pH 7,7, in destilliertem Wasser hergestellt. Pflegen Sie alle Lösungen bei 16 ° C </li><li> Um weitere Eier zu vertreiben, drücken Sie leicht den unteren Rücken und Bauch des Frosches. </li><li> Entfernen Sie die Frösche und den Großteil der MMR, um die Eier in etwa 1-200 ml MMR in jedem Eimer zu verlassen. </li><li> Entfernen Sie Schmutz mit einer Transferpipette und beurteilen die Qualität der Eier: hochwertige Eier werden in der Regel durch eine klare Trennung zwischen der dunkel pigmentierten Tier Hemisphäre und der leicht gefärbt pflanzlichen Hemisphäre markiert und haben die höchste Dunkel-Lichtkontrast. Entsorgen mit einer Transferpipette alle Eier, die sehnig, fleckige oder lysiert (weiß und geschwollen) erscheinen, wie sie die Qualität des Extraktes zu verringern. Wenn&gt; 10% der Eier sind von schlechter Qualität, die gesamteBatch sollte verworfen werden. </li><li> Kombinieren Sie Eier in einen 500-ml-Becherglas und gießen Sie so viel wie möglich MMR während Eier getaucht. </li><li> Eier Spülen unter leichtem Schwenken mit dem doppelten Volumen der MMR-Ei. Zweimal wiederholen, und entfernen Sie Schmutz oder offensichtlich schlechte Qualität Eier. </li><li> In ca. 100 ml 2% Cystein zu dem Becherglas, vorsichtig schwenken zu mischen und ermöglichen Eier für 5 min bei 16 ° C absetzen Gießen Sie die Cystein. HINWEIS: Dejellying wird durch die allmähliche Auftreten von Gelee Mäntel schweben über die Eier und der kompakteren Verpackung der Eier gekennzeichnet, wie sie jetzt ein kleineres Volumen einnimmt, ohne die Gallerthülle. </li><li> In weiteren 100 ml 2% Cystein, schwenken, warten Sie 5 Minuten, und dann langsam abgießen Cystein. Wiederholen, bis Eier haben sich zu stark verdichtet (in der Regel von der dritten Cystein-Behandlung). Hinweis: Wenn Eier zu lange in Cystein übrig sind, anfällig für die Lyse sind sie. Ebenso sind dejellied Eier zerbrechlich und anfällig für mechanische Lyse, wenn siesind zu kräftig gewirbelt, oder wenn sie der Luft ausgesetzt sind. Nachdem die Eier wurden dejellied, ist es wichtig, schnell auf die Zentrifugation fortfahren. </li><li> Abgießen Cystein und wegspülen das Gelee Mantel und andere Verunreinigungen durch leichtes Waschen Eier in 1x MMR. Gießen Sie Puffer sorgfältig an der Seite des Bechers. Zweimal wiederholen oder bis MMR-Lösung nicht mehr trüb. Während Spülen mit 1x MMR weiterhin die schlechte Eier zu entfernen mit einer Transferpipette. </li><li> Eine abschließende schonendes Spülen mit 30 ml 0,1 x MMR, und vorsichtig abgießen, wie viel von dem Puffer wie möglich. Wieder, entfernen Sie alle natürlich schlecht Eier. </li></ol></li><li> Verpackung und Crushing Eier durch Zentrifugation HINWEIS: Die unten beschriebenen Extrakt wird für β-Catenin-Abbau ist eine Variante des Zytostatikums Faktor-Extrakt (Metaphase II festgenommen). Im Gegensatz zu der Niedriggeschwindigkeits-und Hochgeschwindigkeits-Extrakt für die Zellzyklusstudien verwendet, Zwischengeschwindigkeit Extrakt besten für β-Catenin-Abbau. Ichnterphase Extrakt fördert ähnlich robust β-Catenin-Abbau ist zwar arbeitsintensiver, sich vorzubereiten. <ol><li> In Leupeptin, Pepstatin, Aprotinin-Mischung (LPA, einem Protease-Inhibitor) bei 10 pg / ml und Cytochalasin D (aus einer 10 mg / ml Stammlösung in DMSO) bei 20 pg / ml (aus einer 10 mg / ml Stammlösung verdünnt in DMSO) in die verbleibenden 20 ml 0,1 x MMR. </li><li> 0 hinzufügen. X MMR enthalten LPA und Cytochalasin D zu den gewaschenen Eier, vorsichtig schwenken und Inkubation für 5 min bei 16 ° C </li><li> Übertragen Eier in 16 ° C vorgekühlte 50 ml Zentrifugenröhrchen, damit die Eier zu regeln, und entfernen Restpuffer von oben. Um an der Luft zu verhindern, in die Transferpipette zurückzutreten eine kleine Menge Puffer vor dem Abziehen Eier für die Übertragung. Weiterhin zusätzliche Eier in die Zentrifugenröhrchen übertragen und entfernen Restpuffer von der Spitze der Röhre, bis die Eier füllen die Zentrifugenröhrchen nach oben, was die Ausbeute zu maximieren wird vonextrahieren. </li><li> Um die Eier, Spin Zentrifugenröhrchen bei 400 g für 60 Sekunden bei 4 ° C Packung mit einem Festwinkelrotor. Entfernen Restpuffer von der Spitze der Zentrifugenröhrchen. </li><li> Für die Zerkleinerung Spin, Spin Röhrchen bei 15.000 × g für 5 min bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Sammeln Cytoplasmic Schicht von Extract HINWEIS: Die unten beschriebene Methode unterscheidet sich von der klassischen Methode der Punktion der Seite der Zentrifugenröhrchen, um die Zytoplasma-Schicht zu sammeln. Dieses Protokoll wurde zur Vereinfachung und für die Verwendung mit bestimmten Zentrifugenröhrchen, die wiederverwendbar sind, angepasst. Keine merkliche Unterschiede in der Kinetik der β-Catenin-Abbau sind entweder Verfahren gefunden. An diesem Punkt Extrakt sollte während des gesamten Prozesses kalt gehalten werden, und alle Schritte bei 4 ° C durchgeführt werden <ol><li> Deaktivieren Sie ein Loch in die Lipidschicht mit Hilfe von P1000 Pipettenspitze. </li><li> Sammeln Sie die Zytoplasma-Schicht (zwischen dem dunklen Pigmentschicht und der light Lipidschicht) mit einer neuen P1000 Pipettenspitze in saubere vorgekühlte Zentrifugenröhrchen (Abbildung 1). Für hochwertige Extrakt, robust abbaut β-Catenin, minimieren die Menge von pigmentierten und Lipidschicht, die mit der zytoplasmatischen Schicht abgezogen wird. </li><li> Spin extrahiert zytoplasmatische Schicht bei 15.000 × g für 10 min bei 4 ° C und Sammeln der cytoplasmatischen Schicht wieder. Wiederholen Sie den Spin-und Extraktions 1X. HINWEIS: Der Extrakt sollte &quot;strohfarben.&quot; Wenn es wesentliche Kontamination mit den pigmentierten und Lipidschichten an diesem Punkt kann man den Spin noch einmal zu wiederholen, obwohl übermäßige Spins wird die Kapazität des Extraktes auf β-Catenin abgebaut verringern. </li><li> Hinzufügen LPA und Cytochalasin D, um den Extrakt in Endkonzentrationen von 10 ug / ml. HINWEIS: Mit dem beschriebenen Verfahren ergibt eine ziemlich konsequente Gesamtproteinkonzentration von ca. 50 mg / ml (52,41 ± 5,40 mg / ml, n = 3 separate Preps) in Xenopus zBg-Extrakten. </li><li> (Optional) Für Übersetzungs Assays, fügen bedeckten mRNA (0,1 mg / ml), RNAsin (1,5 U / ml), und die Regeneration Energie-Mix (2.2.1) und Inkubation der Reaktion bei RT für 2 Stunden (für weitere Informationen siehe salischen et al. 33) al. 2 und Sive et. Verwenden Sie übersetzte Auszug sofort für β-Catenin-Abbau-Assays oder Snap-freeze in flüssigem Stickstoff für die spätere Verwendung. HINWEIS: Frisch hergestellte Extrakt hat eine hohe Fähigkeit, exogen zuge mRNA übersetzen, aber leider ist diese Fähigkeit verloren, sobald der Extrakt wird eingefroren. Capped-mRNA kann leicht unter Verwendung kommerziell erhältlichen Kits werden. </li><li> Snap-Extrakt Einfrieren in flüssigem Stickstoff. HINWEIS: Extrakte werden in kleinen (200 ul) Aliquots für den einmaligen Gebrauch gespeichert werden, da sie schnell ihre Fähigkeit, β-Catenin, wenn wieder eingefroren verschlechtern. Für langfristige Lagerung kann Extrakt in flüssigem Stickstoff gelagert werden. Für Kurzzeitspeicher kann Extrakt bei -80 ° C gelagert werden, obwohl die Kapazität of-Extrakt zu β-Catenin abbauen können dramatisch mit längerer Lagerung reduziert werden bei -80 ° C (länger als 2 Monate). </li></ol></li></ol> 2. Vorbereitung Extract für β-Catenin-Abbau-Assay <ol><li> Depletion von Xenopus-Extrakt HINWEIS: Ein wesentlicher Vorteil des Xenopus-Extrakt ist die Fähigkeit, ohne weiteres verbrauchen Komponenten eines Weges und eine bestimmte Menge eines Proteins genau wieder hinzuzufügen, um die Dosis-abhängigen Effekte zu bestimmen. <ol><li> Verwenden Sie frisch zubereitete Xenopus-Ei-Extrakt oder schnell auftauen gefrorenen Extrakt und auf Eis. Führen Sie alle Manipulationen in der Kälte. </li><li> Add-Extrakt auf 1/10 des Volumens des pelle Antikörper oder Affinitätskügelchen (z. B. 20 ml Kügelchen pelletiert und 200 ml Extrakt). Zur Verdünnung des Extraktes zu minimieren, ziehen so viel Flüssigkeit aus den Perlen wie möglich vor der Zugabe des Extraktes mit Gel-Ladespitzen mit langen, sich verjüngenden Spitzen. </li><li> Drehen Extrakt-Beadgemisch bei 4 ° C für 1 Stunde. </li><li> Spin-Extrakt Beadgemisch bei 12.600 × g in Mikrozentrifuge bei 4 ° C für 30 sek. Alternativ, wenn Magnetkügelchen verwendet werden, gelten Magnetfeld, um Perlen zu sammeln. </li><li> Überweisung erschöpft Extrakt zu einem frischen Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Seien Sie vorsichtig, keine Perlen mit dem Extrakt zu übertragen. </li><li> Effizienz der Erschöpfung Bestätigen durch Immunoblotting sowohl abgereichertem Extrakt und Perlen. </li><li> Bereiten Extrakt für β-Catenin-Abbau-Assay, wie in 2.2 beschrieben. </li></ol></li><li> Optimierung Xenopus Extrakt für β-Catenin-Abbau HINWEIS: β-Catenin-Abbau in Xenopus-Ei-Extrakt ein energieabhängiger Prozess, schnell erschöpft das endogene ATP speichert. Folglich wird ein Energierückgewinnungssystem erforderlich, um robuste β-Catenin-Abbau zu erhalten. <ol><li> Bereiten Sie eine 20x Energie-Rückgewinnung (ER)-Mix, bestehend aus 150 mM Kreatinphosphat, 20 mM ATP, 600 ug / ml Creatinphosphokinase,und 20 mM MgCl 2. ER sollte aliquotiert und bei -80 ° C gelagert werden Vermeiden Sie wiederholte Einfrieren / Auftauen von eingefrorenen Aliquots mit kleinen. </li><li> Tauen schnell Xenopus-Ei-Extrakt durch Reiben der gefrorenen Röhre zwischen den Händen. Das Röhrchen auf Eis unmittelbar bevor der gesamte Extrakt wurde geschmolzen. </li><li> Werden 10 ul Energierückmischung (20x ER) in einem Aliquot (200 ul) von Xenopus-Ei-Extrakt. Gründlich mischen durch schnippen schnell den Schlauch und Impuls Verwirbelung. Pulse-Spin und sofort auf Eis legen. </li><li> (Optional) Der Umsatz von β-Catenin kann etwas in Xenopus-Ei-Extrakt durch Zugabe von Ubiquitin (1,25 mg / ml final) verbessert werden. Cycloheximid (0,1 mg / ml Endkonzentration) zugesetzt werden, um die Translation endogener Transkripte zu minimieren. </li><li> Aliquot die entsprechenden Volumina für den Abbau-Assay in vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Für radioaktiv markiertem β-Catenin-Abbau-Assays, zurückzutreten 2-5 ml für jeden Zeitpunkt zu extrahieren. &lt;/ Li&gt; </ol></li></ol> 3. Radioaktiv markierte β-Catenin-Abbau-Assay in Xenopus-Ei-Extrakt HINWEIS: Alle Schritte sollten auf Eis durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. <ol><li> Vorbereiten Radioaktiv markierte β-Catenin <ol><li> Vorbereitung frisch in vitro synthetisierten [35 S]-Methionin radioaktiv markiertes Protein unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Kits. HINWEIS: Generieren 35 S-markierten (Halbwertszeit 87 Tage) Proteine ​​leicht und effizient unter Verwendung von im Handel erhältlichen in vitro gekoppelten Transkriptions-Translations-Kits hergestellt. Es ist wichtig, dass das translatierte Protein ausreichend markiert, so daß Veränderungen in den Proteinumsatz leicht sichtbar gemacht werden kann. </li><li> Um erfolgreich zu radioaktiven Markierung bestätigen, führen SDS-PAGE/autoradiography mit 0,5 ul des übersetzten Protein. Quantifizierung der Intensität der radioaktiv markiertem β-Catenin-Band mit ImageJ, Imagequant oder eine alternative quantitative Software progrbin. HINWEIS: Die radioaktiv markierten β-Catenin-Protein-Bande sollte in wenigen Stunden (4-6 Std.) auf dem Film deutlich sichtbar sein. </li><li> Schnapp Einfrieren der radioaktiv markierten Protein in flüssigen Stickstoff für die Lagerung bis zur Verwendung. Hinweis: Längere Lagerung (&gt; 2 Monate) und mehrfaches Einfrieren / Auftauen (größer als 2) erheblich beeinträchtigen kann die Kapazität des radioaktiv markierten β-Catenin zu robust in Xenopus-Ei-Extrakt abzubauen. Typischerweise wird die Stabilität der radiomarkierten Proteine ​​sinkt signifikant nach 1 Monat Lagerung bei -80 ° C; somit relativ frisch zubereitet radioaktiv markiertem β-Catenin liefert die besten Ergebnisse in dieser Abbau-Assays. </li></ol></li><li> Darstellende β-Catenin-Abbau-Assay <ol><li> In 1-3 ul (abhängig von der Stärke des radioaktiv markierten Bandsignal) von in-vitro-übersetzte β-Catenin (und andere Proteine, kleine Moleküle usw., die getestet werden) in 20 ul Xenopus-Reaktionsmischung auf Eis. Gründlich mischen quickly Dazu den Schlauch und einen kurzen Impuls von Wirbeln; dies ist ein wichtiger Schritt, da Xenopus-Ei-Extrakt ist sehr viskos, und unvollständiges Mischen wird die Konsistenz der Ergebnisse zu beeinträchtigen. Pulse Spin und auf Eis stellen. </li><li> Starten Sie den β-Catenin-Abbaureaktion durch Verschieben der Rohre auf RT. </li><li> Zum festgelegten Zeitpunkt, entfernen Sie 1-5 ml der Probe und sofort mischen mit SDS-Probenpuffer (5x Volumen), um die Reaktion zu stoppen. Um sicherzustellen, dass die Abbaureaktion ist vollständig beendet, Röhrchen klopfen mehrmals und kräftig vortexen. </li><li> Führen SDS-PAGE/autoradiography. Führen Sie 1 ml-Äquivalente (~ 50 mg Protein) des Extraktes für jeden Zeitpunkt / Spur. Abbau von β-Catenin in Xenopus-Ei-Extrakt sollte durch die zeitabhängige Abnahme der Intensität der radioaktiv markierten β-Catenin-Band Abbildung 2 nachgewiesen werden. Quantifizierung Ergebnisse mit ImageJ, Imagequant oder anderen bevorzugten Bildbearbeitungssoftware, wenn nötig. </li><li> (Optional) Tränken SDS-Polyacrylamid-Gel in Fixierlösung (10% Essigsäure und 30% Methanol in destilliertem Wasser) vor dem Trocknen, um Hintergrundradioaktivität zu verringern und die Qualität des Bildes. </li></ol></li></ol> 4. Β-Catenin-Luciferase-Assay-Abbau in Xenopus-Ei-Extrakt Führen Sie alle Schritte auf Eis, es sei denn anders angegeben. <ol><li> Vorbereiten β-Catenin-Luciferase- <ol><li> Synthetisieren, nicht-radioaktiv markierten, Luciferase-markierten β-Catenin mit der Transkriptions-Translations-System gekoppelt mit vollständigen Aminosäuremischung. </li><li> Herstellung des Luciferase-markierten β-Catenin durch Messung der Luciferase-Aktivität von 0,5 bis 1 &amp;mgr; l der Reaktion zu bestätigen. Bewerten Hintergrund Lumineszenz durch Messung der Lumineszenz von einem nicht übersetzten Reaktionsmischung. HINWEIS: Mehrere kommerzielle Kits sind für die Messung Luciferase-Aktivität zur Verfügung. Langlebige Lumineszenz, jedoch funktioniert besonders gut für den Abbau assay. </li></ol></li><li> Darstellende β-Catenin-Luciferase-Assay-Abbau <ol><li> Auftauen und bereiten Xenopus-Ei-Extrakt, wie in 2.2. </li><li> In in vitro-übersetzte β-Catenin-Luciferase-Fusions (ab 4.1) in vorbereitete Xenopus-Reaktionsgemisch (2,2) auf Eis und gut mischen, wie in 3.2.1. HINWEIS: Die Aktivität der β-Catenin-Luciferase, die zu dem Extrakt zugegeben wird, ist typischerweise zwischen 20 - 50.000 relativen Lumineszenz-Einheiten (RLU) / ml des Extrakts (basierend auf Messungen 4.1.2) erhalten. Startschuss sollte ungefähr 100.000 RLU (2-5 ml der in vitro-übersetzte β-Catenin-Luciferase-Fusions) sein. </li><li> Verschieben Sie den Extrakt auf RT , um die Abbaureaktion zu starten. </li><li> Entfernen Sie einen aliquoten Teil der Reaktion in der angegebenen Zeit und Snap-in flüssigem Stickstoff einfrieren. HINWEIS: Dreifachproben werden typischerweise zur Analyse entfernt für jeden Zeitpunkt. Gefrorene Extrakt kann bei -80 ° C gelagert werden, until sie bereit sind, analysiert werden. </li><li> Tauwetter Eis-Proben, Proben Übertragung auf Standard-Weiß 96-Well-Platten auf Eis, und ein Verfahren zur Luciferase-Aktivität. </li></ol></li></ol>

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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biochemical+screen+for+identification+of+small-molecule+regulators+of+the+Wnt+pathway+using+Xenopus+egg+extracts.">A biochemical screen for identification of small-molecule regulators of the Wnt pathway using Xenopus egg extracts.</a> Journal of Biomolecular Screening. 16, 995-1006 (2011).</li><li>Hinkson, I. V., Elias, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+state+of+protein+turnover:+It's+about+time.">The dynamic state of protein turnover: It's about time.</a> Trends in Cell Biology. 21, 293-303 (2011).</li><li>Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+Hereditary+Colorectal+Cancer.">Lessons from Hereditary Colorectal Cancer.</a> Cell. 87, 159-170 (1996).</li><li>Lee, E., Salic, A., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+regulation+of+[beta]-catenin+stability+by+Tcf3+and+CK1epsilon.">Physiological regulation of [beta]-catenin stability by Tcf3 and CK1epsilon.</a> J Cell Biol. 154, 983-993 (2001).</li><li>Lee, E., Salic, A., Kr&#252;ger, R., Heinrich, R., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+APC+and+Axin+derived+from+experimental+and+theoretical+analysis+of+the+Wnt+pathway.">The roles of APC and Axin derived from experimental and theoretical analysis of the Wnt pathway.</a> PLoS Biology. 1, (2003).</li><li>Seeling, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+beta-catenin+signaling+by+the+B56+subunit+of+protein+phosphatase+2A.">Regulation of beta-catenin signaling by the B56 subunit of protein phosphatase 2A.</a> Science. 283, 2089-2091 (1999).</li><li>Guger, K. A., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Catenin+has+Wnt-like+activity+and+mimics+the+Nieuwkoop+signaling+center+in+Xenopus+dorsal-ventral+patterning.">beta-Catenin has Wnt-like activity and mimics the Nieuwkoop signaling center in Xenopus dorsal-ventral patterning.</a> Dev Biol. 172, 115-125 (1995).</li><li>Cselenyi, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRP6+transduces+a+canonical+Wnt+signal+independently+of+Axin+degradation+by+inhibiting+GSK3's+phosphorylation+of+&#946;-catenin.">LRP6 transduces a canonical Wnt signal independently of Axin degradation by inhibiting GSK3's phosphorylation of &#946;-catenin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 8032-8037 (2008).</li><li>Jernigan, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gbetagamma+activates+GSK3+to+promote+LRP6-mediated+beta-catenin+transcriptional+activity.">Gbetagamma activates GSK3 to promote LRP6-mediated beta-catenin transcriptional activity.</a> Science Signaling. 3, (2010).</li><li>Major, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wilms+tumor+suppressor+WTX+negatively+regulates+WNT/beta-catenin+signaling.">Wilms tumor suppressor WTX negatively regulates WNT/beta-catenin signaling.</a> Science. 316, 1043-1046 (2007).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+eggs+from+Xenopus+laevis+females.">Obtaining eggs from Xenopus laevis females.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+fractionation+of+Xenopus+laevis+egg+extracts.">Preparation and fractionation of Xenopus laevis egg extracts.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+DNA+damage+checkpoint+using+Xenopus+egg+extracts.">Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus Laevis : A Laboratory Manual. , (2000).</li><li>Rubinfeld, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+GSK3&#946;+to+the+APC-&#946;-Catenin+Complex+and+Regulation+of+Complex+Assembly.">Binding of GSK3&#946; to the APC-&#946;-Catenin Complex and Regulation of Complex Assembly.</a> Science. 272, 1023-1026 (1996).</li><li>Salic, A., King, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+small+molecule+inhibitors+of+the+ubiquitin-proteasome+pathway+in+Xenopus+egg+extracts.">Identifying small molecule inhibitors of the ubiquitin-proteasome pathway in Xenopus egg extracts.</a> Methods in Enzymology. 399, 567-585 (2005).</li><li>Trinkle-Mulcahy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+specific+protein+interaction+partners+using+quantitative+mass+spectrometry+and+bead+proteomes.">Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes.</a> J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).</li><li>Tan, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signalling+pathway+parameters+for+mammalian+cells.">Wnt signalling pathway parameters for mammalian cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Xenopus-Ei-Extrakt ist ein robustes System für die Untersuchung von biochemischen β-Catenin-Umsatzes. Die Konzentration von β-Catenin in Xenopus-Ei-Extrakt 25 ~ 2 nM. Unter optimalen Bedingungen ist die Ei-Extrakt, der zum Abbau β-Catenin mit einer Geschwindigkeit von 50-100 Nm / h und ist halb-maximal bei 200 nM 24. Es gibt mehrere wichtige Schritte für eine erfolgreiche Wiederherstellung der β-Catenin-Abbau unter Verwendung von Xenopus-Ei-Extrakt. Dazu gehören 1)...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/51425">Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract</a>. At the time of publication there were some instances where an incorrect volume notation was used. These instances were corrected from:
2.1.2. Add extract to 1/10 the volume of pelleted antibody or affinity beads (e.g., 20 ml pelleted beads to 200 ml extract). In order to minimize dilution of the extract, withdraw as much liquid from the beads as possible before addition of the extract using gel loading tips with long, tapered tips.
2.2.5. Aliquot the appropriate volumes for degradation assay into pre-chilled microfuge tubes on ice. For radiolabeled &#946;-catenin degradation assays, withdraw 2-5 ml extract for each time point.
3.2.3. At the designated time point, remove 1-5 ml of the sample and mix immediately with SDS sample buffer (5x volume) to stop the reaction. To make sure the degradation reaction is completely terminated, flick tube several times and vortex vigorously.
3.2.4. Perform SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 ml equivalents (~50 mg of protein) of the extract for each time point/lane. Degradation of &#946;-catenin in Xenopus egg extract should be evidenced by the time-dependent decrease in intensity of the radiolabeled &#946;-catenin band Figure 2. Quantify results using ImageJ, ImageQuant, or other preferred imaging software if necessary.
4.2.2. Add in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion (from 4.1) into prepared Xenopus reaction mix (from 2.2) on ice and mix well as in 3.2.1. NOTE: The activity of the &#946;-catenin luciferase that is added to the extract is typically between 20 - 50,000 relative luminescence units (RLU)/ml of extract (based on measurements obtained from 4.1.2). Starting signal should be approximately 100,000 RLU (2-5 ml of the in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion).
to:
2.1.2. Add extract to 1/10 the volume of pelleted antibody or affinity beads (e.g., 20 &#181;l pelleted beads to 200 &#181;l extract). In order to minimize dilution of the extract, withdraw as much liquid from the beads as possible before addition of the extract using gel loading tips with long, tapered tips.
2.2.5. Aliquot the appropriate volumes for degradation assay into pre-chilled microfuge tubes on ice. For radiolabeled &#946;-catenin degradation assays, withdraw 2-5 &#181;l extract for each time point.
3.2.3. At the designated time point, remove 1-5 &#181;l of the sample and mix immediately with SDS sample buffer (5x volume) to stop the reaction. To make sure the degradation reaction is completely terminated, flick tube several times and vortex vigorously.
3.2.4. Perform SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 &#181;l equivalents (~50 mg of protein) of the extract for each time point/lane. Degradation of &#946;-catenin in Xenopus egg extract should be evidenced by the time-dependent decrease in intensity of the radiolabeled &#946;-catenin band Figure 2. Quantify results using ImageJ, ImageQuant, or other preferred imaging software if necessary.
4.2.2. Add in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion (from 4.1) into prepared Xenopus reaction mix (from 2.2) on ice and mix well as in 3.2.1. NOTE: The activity of the &#946;-catenin luciferase that is added to the extract is typically between 20 - 50,000 relative luminescence units (RLU)/&#181;l of extract (based on measurements obtained from 4.1.2). Starting signal should be approximately 100,000 RLU (2-5 &#181;l of the in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion).

Erratum: Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis-Ei-Extrakt wurde ausgiebig verwendet, um viele Zell biologischen Prozessen einschließlich Zytoskeletts, Kernanordnung und Import, Apoptose, Ubiquitin-Stoffwechsel, Zellzyklus-Progression, Signaltransduktion und Proteinumsatz 1-17 studieren. Die Xenopus-Ei-Extrakt-System ist offen für die biochemische Analyse einer Legion von zellulären Prozessen, weil Ei-Extrakt stellt im Wesentlichen unverdünnt Zytoplasma, die alle wesentlichen Komponenten zytoplasmatischen notwendig, diese Prozesse auszuführen und ermöglichen Untersuchung enthält. Große Mengen von Ei-Extrakt kann auf einmal zur biochemischen Manipulationen, die große Mengen von Material (z. B. Proteinreinigung oder Hochdurchsatz-Screening) 18-20 erfordern, hergestellt werden. Ein weiterer Vorteil ist, dass die Konzentration von spezifischen Proteinen in Xenopus-Ei-Extrakt kann präzise durch Zugabe von rekombinantem Protein und / oder der Immunodepletion ENDOG eingestellt werdenenous Proteine ​​im Gegensatz zur Transfektion von Plasmid-DNA, wobei die Expression des Proteins von Interesse ist schwierig zu steuern. Darüber hinaus kann der Mangel an verfügbaren rekombinanten Proteinen durch die Zugabe von Transkripten, die das Protein von Interesse kodiert, überwunden werden, unter Ausnutzung der hohen Kapazität der frisch hergestellten Xenopus-Ei-Extrakt zur exogen zuge mRNA zu übersetzen. Die Regulation der Proteinabbau ist entscheidend für die Steuerung vieler zelluläre Wege und Prozesse 21. Xenopus-Ei-Extrakt wurde ausgiebig verwendet, um den Proteinabbau zu untersuchen, wie das System erlaubt mehrere Möglichkeiten, um den Proteinumsatz ohne verwirrende Einflüsse der Transkription und Translation kontrollieren. Der Wnt-Signalweg ist eine hoch konservierte Signalweg, der eine entscheidende Rolle in der Entwicklung und Krankheit spielt. Der Umsatz von β-Catenin, der Haupt Effektor des Wnt-Signalwegs, ist stark reguliert, und eine erhöhte Steady-State-level von β-Catenin ist entscheidend für die Aktivierung der Wnt-Zielgene. Die Bedeutung der β-Catenin-Abbau wird durch die Tatsache, dass Mutationen im Wnt-Signalweg, die β-Catenin-Abbau hemmen, gefunden in ~ 90% der sporadischen Fälle von Darmkrebs 22 hervorgehoben. β-Catenin-Abbau durch Komponenten des Wnt-Signalwegs getreu in Xenopus-Ei-Extrakt rekapituliert, um den Mechanismus des Umsatzes zu studieren sowie neuartiger niedermolekularer Modulatoren von seiner Abbau 2, 19, 20, 23-29 zu identifizieren. Verfahren zur Herstellung von Xenopus-Ei-Extrakt zur Untersuchung der Zellzyklus sind in früheren Veröffentlichungen JoVE 30-32 beschrieben. Das derzeitige Protokoll beschreibt eine Modifikation dieser Verfahren und ist für den Abbau von optimierten [35 S]-radioaktiv markierten β-Catenin und die Luciferase-markierten β-Catenin inXenopus-Ei-Extrakt. Das radioaktiv markierte Abbau-Assay ermöglicht die direkte Visualisierung von Protein-Ebene über Autoradiographie. [35 S]-Methionin in das Protein von Interesse unter Verwendung eines in vitro-Translationsreaktion, die dann direkt auf eine Abbaureaktion zugegeben werden kann, eingebaut. Darüber hinaus ist das radioaktiv markierte Proteinumsatz-Assay erfordern einen Antikörper gegen das Protein von Interesse oder ein Epitop-Tag, das die Proteinstabilität beeinflussen. Da selbst kleine Veränderungen in der Proteinniveaus, wie in Änderungen der Intensität des radioaktiv markierten Proteinbande reflektiert, werden leicht durch Autoradiographie sichtbar gemacht, die [35 S]-radioaktiv markierte Abbauassay stellt ein sehr nützliches Verfahren zur Visualisierung des Proteinumsatzes 2. Fusion von β-Catenin an Leuchtkäfer-Luciferase (im folgenden einfach als &quot;Luciferase&quot; genannt) ermöglicht eine genaue und einfache quantitative Messung der Proteinspiegel, umum die kinetischen Eigenschaften der β-Catenin-Umsatz 19, 20 zu bestimmen. Ein wesentlicher Vorteil der Luciferase-Assay ist, dass es eine starke quantitative System, in dem bis skaliert wird. Das folgende Protokoll bietet einfache Methoden zur Bestimmung von β-Catenin-Abbau und eine robuste, effiziente und effektive Methode für die Hochdurchsatz-Screening von neuen β-Catenin-Modulatoren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:709px;" width="710">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Material</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:243px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG)</td>
			<td style="width:132px;">ProSpec</td>
			<td style="width:119px;">hor-272-A</td>
			<td>Reconstituted with distilled water before use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Human Chorionic Gonadotropin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CG10-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:132px;">Research Products International</td>
			<td style="width:119px;">S23020-5000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:132px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">AC42352-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cysteine</td>
			<td style="width:132px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">AC17360-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Leupeptin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L2884-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aprotinin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A1153-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pepstatin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4265-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cytochalasin B</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C8273-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3 mL syringe: Luer Lock tip</td>
			<td style="width:132px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">27G1 needle</td>
			<td style="width:132px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed</td>
			<td style="width:132px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Steady-Glo Luciferase assay system</td>
			<td style="width:132px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2520</td>
			<td>Store long-term at -80, can store for up to 1 month at -20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system</td>
			<td style="width:132px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">L4600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TNT Sp6 High-yield Wheat Germ protein expression system</td>
			<td style="width:132px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">L3260</td>
			<td>Generally higher yield than reticulocyte lysate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EasyTag Express Protein Labeling Mix [S35]</td>
			<td style="width:132px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">NEG772007MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Creatine phosphate</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">27920-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ATP</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2383-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Creatine phosphokinase</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3755-35KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dual-Glo luciferase assay system</td>
			<td style="width:132px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2920</td>
			<td>Same storage conditions as Steady-Glo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 mL Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">0556214D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sorvall SS-34 fixed angle rotor</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">28020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">115 V 50/60 Hz Minicentrifuge</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-090-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mMessage mMachine Sp6 kit</td>
			<td style="width:132px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-Firefly Luciferase antibody</td>
			<td style="width:132px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab16466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-GSK3 antibody</td>
			<td style="width:132px;">BD Transduction Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">610201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
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			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
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			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FLUOStar Optima</td>
			<td style="width:132px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
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		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sorvall RC-6 Plus Centrifuge</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
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		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">16&#176;C Incubator</td>
			<td style="width:132px;">Percival Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of &#946;-catenin degradation in xenopus egg extract

Xenopus laevis-Ei-Extrakt ist eine gut charakterisierte, robustes System zur Untersuchung der Biochemie der verschiedenen zellulären Prozessen. Xenopus-Ei-Extrakt verwendet wurde, um den Proteinumsatz in vielen zellulären Kontexten, einschließlich des Zellzyklus und der Signalübertragungswege 1-3 studieren. Hierin wird ein Verfahren zur Isolierung von Xenopus-Ei-Extrakt, das optimiert wurde, um die Verschlechterung der kritischen Wnt-Komponente, β-Catenin fördert beschrieben. Zwei verschiedene Verfahren werden beschrieben, um β-Catenin Proteinabbau in Xenopus-Ei-Extrakt zu beurteilen. Ein Verfahren ist visuell aussage ([35 S]-radioaktiv markierte Proteine), während das andere leichter für Hochdurchsatz-Assays (Firefly-Luciferase-markierte Fusionsproteine) skaliert. Die beschriebenen Techniken können dazu verwendet werden, ein, sind aber nicht darauf beschränkt, zu beurteilen β-Catenin-Protein zu identifizieren und Umsatz molekularen Komponenten beiträgt, den Umsatz. Zusätzlich wird die Fähigkeit, um große Mengen von homogenen Xenopus-Ei-Extrakt in Kombination mit der quantitativen und einfache Auslesung der Luciferase-markierte Proteine ​​zu reinigen, ermöglicht dieses System leicht für Hochdurchsatz-Screening auf Modulatoren von β-Catenin Abbau angepasst werden.

Eine schematische Darstellung des β-Catenin-Abbau in Xenopus-Ei-Extrakt ist in 2A gezeigt. 35 S-markierten β-Catenin wurde in Xenopus-Ei-Extrakt inkubiert wurden Aliquots (1 ml Extrakt Äquivalent) zu den entsprechenden Zeiten entnommen und die Proben wurden einer SDS-PAGE, gefolgt von Autoradiographie. β-Catenin Abbau von Komponenten des Wnt-Signalwegs durch das Ubiquitin-Proteasom-System 2 vermittelt wird, und den Abbau von [35 S]-radioaktiv markie...

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Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Es wird ein Verfahren zur Analyse von Protein-Abbau unter Verwendung radioaktiv markiert und die Luciferase-Fusionsproteine ​​in Xenopus-Ei-Extrakt und deren Anpassung für Hochdurchsatz-Screening für Kleinmolekül-Modulatoren der Proteinabbaus beschrieben.

Rekonstitution von β-Catenin-Abbau in<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

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Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

12.0K Aufrufe.  Vanderbilt University Medical Center.  Es wird ein Verfahren zur Analyse von Protein-Abbau unter Verwendung radioaktiv markiert und die Luciferase-Fusionsproteine ​​in Xenopus-Ei-Extrakt und deren Anpassung für Hochdurchsatz-Screening für Kleinmolekül-Modulatoren der Proteinabbaus beschrieben. 

Serie: Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Vorbereitung und Fraktionierung von Xenopus laevis Egg Auszüge

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Forschung

Biologie

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

In Vitro Nuclear Assembly mit Fraktionierte Xenopus Egg Auszüge

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage checkpoint signaling as a surveillance mechanism to sense DNA damage and direct cellular responses to DNA damage. There are several groups of proteins called sensors, transducers and effectors involved in DNA damage checkpoint signaling (Figure 1). In this complex signaling pathway, ATR (ATM and Rad3-related) is one of the major kinases that can respond to DNA damage and replication stress. Activated ATR can phosphorylate its downstream substrates such as Chk1 (Checkpoint kinase 1). Consequently, phosphorylated and activated Chk1 leads to many downstream effects in the DNA damage checkpoint including cell cycle arrest, transcription activation, DNA damage repair, and apoptosis or senescence (Figure 1). When DNA is damaged, failing to activate the DNA damage checkpoint results in unrepaired damage and, subsequently, genomic instability. The study of the DNA damage checkpoint will elucidate how cells maintain genomic integrity and provide a better understanding of how human diseases, such as cancer, develop.
Xenopus laevis egg extracts are emerging as a powerful cell-free extract model system in DNA damage checkpoint research. Low-speed extract (LSE) was initially described by the Masui group1. The addition of demembranated sperm chromatin to LSE results in nuclei formation where DNA is replicated in a semiconservative fashion once per cell cycle.
The ATR/Chk1-mediated checkpoint signaling pathway is triggered by DNA damage or replication stress 2. Two methods are currently used to induce the DNA damage checkpoint: DNA damaging approaches and DNA damage-mimicking structures 3. DNA damage can be induced by ultraviolet (UV) irradiation, &gamma;-irradiation, methyl methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO), or aphidicolin3, 4. MMS is an alkylating agent that inhibits DNA replication and activates the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint 4-7. UV irradiation also triggers the ATR/Chk1-dependent DNA damage checkpoint 8. The DNA damage-mimicking structure AT70 is an annealed complex of two oligonucleotides poly-(dA)70 and poly-(dT)70. The AT70 system was developed in Bill Dunphy's laboratory and is widely used to induce ATR/Chk1 checkpoint signaling 9-12.
Here, we describe protocols (1) to prepare cell-free egg extracts (LSE), (2) to treat Xenopus sperm chromatin with two different DNA damaging approaches (MMS and UV), (3) to prepare the DNA damage-mimicking structure AT70, and (4) to trigger the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint in LSE with damaged sperm chromatin or a DNA damage-mimicking structure.

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus egg extract is a useful model system to investigate the DNA damage checkpoint. This protocol is for the preparation of Xenopus egg extracts and DNA damage checkpoint inducing reagents. These techniques are adaptable to a variety of DNA damaging approaches in the study of the DNA damage checkpoint signaling.

Untersuchung der DNA Damage Checkpoint mit<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Auszüge

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

Produktion von<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Egg Extrakte Mikrotubuli-assoziierten RNAs identifizieren

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Gesichtstransplantation in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonen

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

Die<em&gt; Xenopus</em&gt; Eizelle Cut-open Vaseline Gap Voltage-Clamp-Technik Mit Fluorometrie

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial development will allow for more rigorous analysis of orofacial phenotypes upon abrogation with substances that can genetically or molecularly manipulate gene expression or protein function. Using two dimensional images of the embryonic heads, traditional size dimensions-such as orofacial width, height and area- are measured. In addition, a roundness measure of the embryonic mouth opening is used to describe the shape of the mouth. Geometric morphometrics of these two dimensional images is also performed to provide a more sophisticated view of changes in the shape of the orofacial region. Landmarks are assigned to specific points in the orofacial region and coordinates are created. A principle component analysis is used to reduce landmark coordinates to principle components that then discriminate the treatment groups. These results are displayed as a scatter plot in which individuals with similar orofacial shapes cluster together. It is also useful to perform a discriminant function analysis, which statistically compares the positions of the landmarks between two treatment groups. This analysis is displayed on a transformation grid where changes in landmark position are viewed as vectors. A grid is superimposed on these vectors so that a warping pattern is displayed to show where significant landmark positions have changed. Shape changes in the discriminant function analysis are based on a statistical measure, and therefore can be evaluated by a p-value. This analysis is simple and accessible, requiring only a stereoscope and freeware software, and thus will be a valuable research and teaching resource.

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

A method to quantify the orofacial size and shape of Xenopus laevis embryos has been developed. In this protocol, traditional size measurements are combined with geometric morphometrics to allow for more sophisticated analyses of orofacial development and defects.

Quantifizierung der Orofacial Phänotypen in<em&gt; Xenopus</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Funktionelle Rekonstitution und Kanalaktivitätsmessungen von gereinigtem Wildtyp und mutierten CFTR-Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).