Der Autor ist ein Parkinson-UK Research Fellow (grant F1002). Diese Arbeit wurde zum Teil durch den Wellcome Trust / MRC Joint Call in Neurodegeneration award (WT089698) nach Großbritannien Parkinson Consortium (UKPDC), deren Mitglieder von der UCL Institute of Neurology, der University of Sheffield und der MRC Protein-Phosphorylierung Unit unterstützt der University of Dundee.

Sicherheit Die unten beschriebenen Protokoll nutzt ATP mit radioaktivem 32 P an der γ-Phosphat Lage, die Kinase-Aktivität von LRRK2 folgen beschriftet. Es basiert auf dem Standard-Protokolle in unserem Labor verwendeten, und so in Bezug auf viele der Schritte in dem Prozess wie Laufen die Gele, Western-Blot et cetera die Materialien und genauen Bedingungen sollten als Richtschnur der Ausrüstung und Protokollen getroffen werden verwendet für diese Prozesse ist von Labor zu Labor. Verbindungen, die Isotope, die ionisierende Strahlung aussenden, sind potenziell schädlich für die menschliche Gesundheit und strengen Genehmigungs-und Vorschriften auf institutioneller und nationaler Ebene Kontrolle ihrer Verwendung. Die Experimente in diesem Protokoll wurden folgende Schulungen in Open-Source-Strahlung verwenden am University College London und nach der guten Laborpraxis Richtlinien der Sicherheit Dienstleistungen an der Hochschule zur Verfügung gestellt durchgeführt (Richtlinien available bei <a href="http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf">http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf</a> ). Einsatz von Open-Source-Strahlung sollte nicht vor der entsprechenden Ausbildung und Zulassung angestrebt werden. Die Regulierungsbehörde für Open-Source-Strahlung in der Laborforschung variiert von Land zu Land. Beispiele hierfür sind: in Großbritannien, der Health and Safety Executive ( <a href="http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm">http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm</a> (), in den Vereinigten Staaten der Nuclear Regulatory Commission <a href="http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html">http:// www.nrc.gov / Materialien / miau / regs-guides-comm.html</a> ), in Kanada die kanadische Kommission für nukleare Sicherheit ( <a href="http://nuclearsafety.gc.ca/eng/">http://nuclearsafety.gc.ca/eng/</a> ) und in Deutschland Das Bundesamt für Strahlenschutz ( <a href="http://www.bfs.de/de/bfs">http : / / www.bfs.de / de / bfs</a> ). Benutzer in anderen Ländern sollten die lokalen Regeln, Vorschriften und Genehmigungsbehörden mit ihren Strahlenschutzbeauftragten zu bestätigen. Sicherheitsvorkehrungen in bezug auf dieses Protokoll wurden in den Text festgestellt worden ist, markiert mit dem radioaktiven Kleeblatt-Symbol ( <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Symbol 1" /> ). 1. Vorbereitung der Kinase-Reaktionen <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Symbol 1" /> Alle Reaktionsansätze in 1,5 ml Probenröhrchen mit Schraubverschluss mit O-Ring, um zu verhindern Ausbreitung von Radioaktivität vorbereitet. <ol><li> Thaw Protein auf Eis - LRRK2 Wildtyp, D1994A, G2019S. </li><li> Make-up Reaktion auf Eis - 10nm LRRK2, 0.5μg/μl MBP, 5UL von 10x Kinase-Puffer, aus bis zu 50 ul mit Wasser. </li></ol> 2. Das Ausführen des Tests <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Symbol 1" /> Alle Schritte nutzen 32 P ATP sollte pSpitzen in bestimmten Bereichen Strahlung. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Symbol 1" /> Geeignete persönliche Schutzausrüstung getragen werden - unter standard operating procedure in unserem Labor dazu gehören Kittel, Doppel-Handschuhe und Schutzbrille tragen. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Symbol 1" /> Proben mit 32 P ATP sollten von den Nutzern von 6mm Plexiglas-Bildschirme abgeschirmt werden, um die Exposition zu minimieren. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Symbol 1" /> Gegebenenfalls persönlichen Überwachungsgeräte verwendet werden sollte - innerhalb von UCL, muss jede zertifizierte Open-Source-Strahlung Benutzer eine Filmplakette die Strahlenbelastung während der Experimente zu überwachen. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Symbol 1" /> Alle experimentellen Oberflächen sollten für radioaktive Kontamination vor und nach Gebrauch mit einem Gei beurteilt werdenger Zähler. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Symbol 1" /> Alle potenziell kontaminierte Verbrauchsmaterialien sollte streng nach den Richtlinien des Instituts für Entsorgung radioaktiver Abfälle entsorgt werden. <ol><li> Vor Beginn Assay gesetzt Heizblöcke bis 30 ° C und 100 ° C bzw. </li><li> Entfernen 32 P ATP von -20 Gefrierschrank (beachten Sie, dass Lagerbedingungen fro 32 P ATP kann je nach Anbieter oder die Art der Radionukleotide verwendet). <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Symbol 1" /> Scan außerhalb der Behälter vor dem Gebrauch auftauen hinter Plexiglas Bildschirm. </li><li> Mit Reaktionen auf Eis, fügen 1μl von 32 P ATP zu jedem zusammen mit 10 um der Kälte ATP. </li><li> Gut mischen mit Pipette. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Symbol 1" /> Pulszentrifugieren zu bringen Flüssigkeit Boden des Röhrchens, minimiert Risiko der Kontamination. </li><li> Entfernen Sie 15μl Aliquot für den Zeitpunkt Null Punkt eind kündigen Reaktion in aliquoten durch Zugabe von 5μl von 4x SDS-Probenpuffer und Denaturierung bei 100 ° C für 10 Minuten. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Symbol 1" /> Pulszentrifugieren zu bringen Flüssigkeit Boden des Röhrchens, minimiert Risiko der Kontamination. </li><li> Verbleibende Probe in Heizblock gestellt und bei 30 ° C für 60 Minuten. </li><li> 15μl bei 60 Minuten-Zeitpunkt und die Reaktion durch Zugabe von 5μl von 4x SDS-Probenpuffer und Denaturierung bei 100 beendet ° C für 10 Minuten entfernt. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Symbol 1" /> Pulszentrifugieren zu bringen Flüssigkeit Boden des Röhrchens, minimiert Risiko der Kontamination. </li></ol> 3. Immunoblotting der Proben und die Analyse der Ergebnisse <ol><li> Proben auf SDS-PAGE laufen <ol><li> 10 gut 4-12% Bis-Tris polyacrilamide Gel für die Elektrophorese mit MOPS Laufpuffer vorbereitet. </li><li> 20 &amp;mgr; l jeder Probe auf das Gel zusammen mit 7μl von Sharps geladenTain-Protein-Standard-Leiter. </li><li> Gel bei 160V für 90 Minuten laufen oder bis Farbstofffront hat das Ende des Gels erreicht. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Symbol 1" /> Alle Flüssigkeit in Kontakt mit Radioisotopen sollte als radioaktiver Abfall behandelt und entsorgt werden gemäß den Richtlinien des Instituts. UCL Vorschriften besagen, dass flüssige radioaktive Abfälle durch Strömen bezeichnet radioaktive Entsorgung sinkt mit viel Wasser muss entsorgt werden. </li></ol></li><li> Protein übertragen PVDF-Membran über Western-Blot. <ol><li> Transfer-Puffer, 1x Tris Glycin plus 20% Methanol. PVDF-Membran und Filterpapier auf Maß geschnitten für Gel richtig und aktiviert mit glazialen Methanol im Fall der Membran oder pre-nass mit Transfer-Puffer im Falle des Filterpapiers. Die Membran sollte mit Kugelschreiber pre-gekennzeichnet sein, um die Identifizierung der Orientierung zu ermöglichen. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Symbol 1" /> Gel aus plast entferntic Gehäuse und mehr Acrylamid entfernt und entsorgt als radioaktiver Abfall. </li><li> Das Gel sollte in ein Sandwich mit der Membran und Filterpapier gebildet werden, so dass keine Luftblasen zwischen Membran und Gel bestehen, und dann in der Western-Blot-Apparatur mit der Membran zwischen dem Gel und der Anode angeordnet. </li><li> Transfer durchgeführt bei 25V für 16 Stunden. </li></ol></li><li> Nach Proteintransfer auf PVDF, sollte die Membran bei Raumtemperatur getrocknet werden. Schließlich sollte der trockenen Membran zwischen Celluloseacetat Blatt isoliert und ausgesetzt, um entweder einen Leuchtschirm oder x-ray-Film um den Nachweis von radioaktiv markiertem Protein ermöglichen. Belichtungszeit kann von einigen Stunden zu laufen mehr als einer Woche in Abhängigkeit von der spezifischen Aktivität der Radioisotopen verwendet und das Enzym Kinetik der Reaktion. </li><li> Phosphoscreen gescannt / Film verarbeitet. Wenn Sie einen Leuchtschirm, sollte das Bild als hochauflösende TIFF-oder Bitmap-Datei gespeichert werden, wenn mit Film dann die resultierende transparency sollte gescannt mit einem Desktop-Scanner und gespeichert werden als hochauflösende TIFF oder Bitmap-Datei. Das Bild kann dann in ImageJ, ein Freeware-Programm finden Sie auf der National Institutes of Health Website (analysiert werden <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ). </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 1 zeigt repräsentative Ergebnisse für einen Assay durchgeführt unter Verwendung von Wildtyp, G2019S und D1994A LRRK2 mit Myelin Basic Protein als generisches Phosphat Acceptorsubstrat. Autophosphorylierung LRRK2 sichtbar ist bei ≈ 200 kDa, mit mehreren Bands vertreten phosphorylierten MBP sichtbar von 20-40kDa. Beachten Sie das Fehlen von Autophosphorylierung in der D1994A (kinase dead) lane, und erhöhte Phosphorylierung durch die G2019S Mutation. Beachten Sie auch Rest-Phosphorylierung von MBP in der Kinase-tote Spur. Dies kann aufgrund von unvollständigen Ablation der Kinase-Aktivität von LRRK2 durch die D1994A-Mutante oder reflektieren die Gegenwart of Spur kontaminierender Kinasen in der Reaktion. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dieses Papier beschreibt eine grundlegende Protokoll zur Bestimmung der Kinase-Aktivität von LRRK2 mit einem in vitro-System. Im Interesse der Kürze hat dies zu einer einstündigen Endpunkt Vorlage mit einem generischen Substrat beschränkt, sondern dem allgemeinen Protokoll gilt für eine Reihe von möglichen Substraten und zugänglich anspruchsvollere Analysen Untersuchung der Kinetik der Kinase-Aktivität von LRRK2 . Dies unterstreicht eine der wichtigsten Vorteile der Verwendung eines in vitro Systems an die Kinase Verhalten eines Proteins, wie diese zu untersuchen: denn es gibt die volle Kontrolle über die Konzentrationen der Enzym und Substrat, ist es möglich, kinetische Daten zu generieren und zu berechnen K m und V max-Werte für die Reaktion. Für weitere detaillierte kinetische Auswertungen oder Bewertung der Auswirkungen der vermeintlichen Hemmer, ist ein höherer Durchsatz-System (wie z. B., dass durch die LRRKtide Substrat, erhältlich von Invitrogen bot) eine überlegene Alternatibereits in dem hier beschriebenen Ansatz. Es ist jedoch wichtig, zu erkennen, dass die reduktionistische Modell-System zur Verfügung gestellt durch in vitro Kinase-Assays ist nur ein Werkzeug, um die Biologie von einer Kinase und seine Beziehungen zu potenziellen Substraten zu untersuchen. Daten aus Untersuchungen, wie diese sollte in Verbindung mit anderen Ansätzen verwendet werden, um ein umfassendes Bild davon, wie eine Kinase verhält sich in vitro und im zellulären Kontext zu gewinnen. Zum Beispiel kann ein mutmaßliches Substrat in vitro phosphoryliert durch Massenspektrometrie analysiert werden, um mögliche phosphosites, die dann durch gezielte Mutagenese (z. B.. Umwandlung von Serin oder Threonin-Phosphat-Akzeptor Rückstände none-phosphorylierbaren Rückstände wie Alanin) manipuliert werden können, um die funktionale untersuchen zu identifizieren Folgen der Phosphorylierung ex vivo. Ein entscheidendes Kriterium bei der Interpretation von Daten aus einem in-vitro-Assay-System wie diesem ist die Wahrscheinlichkeit von either Typ I oder Typ II (false positive oder falsch-negativen) Fehler. Die reduktionistische Natur dieses System leider verfügt es sowohl - im Fall des ehemaligen, mit einem gereinigten putative Substrat und gereinigt Kinase in künstlich unmittelbarer Nähe und in hoher Konzentration (im Vergleich zu den zellulären Milieu) können in artifizielle Phosphorylierung Ereignissen führen. Umgekehrt funktionieren viele Kinasen als Teil eines komplexen im Rahmen der Zelle, und benötigen Co-Faktoren für die Phosphorylierung von einem gegebenen Substrat auftreten. Wie oben erwähnt, mit einem positiven Ergebnis von Phosphorylierung eines vermeintlichen Substrat ein in vitro Testsystem sollte dann in einem zellulären System getestet werden, um das Ergebnis zu validieren, und ein negatives Ergebnis sollte mit Vorsicht interpretiert werden. Vor diesem Hintergrund ist es entscheidend, wo möglich, sowohl positive als auch negative Kontrollen müssen eine vergleichende Studie über die Tätigkeit der Kinase von Interesse erlauben. Sorgfältige Auswahl einer positiven control dass ein bekannter Aktivität gegenüber dem Protein von Interesse ist, zusammen mit einer Negativ-Kontrolle, die unwahrscheinlich, dass vermeintliche Substrat phosphoryliert wird, ist äußerst wertvoll. Ein Kandidat Steuerung für LRRK2 ist Rezeptor interagiert Kinase 3, die eine eng verwandte primäre Sequenz der Kinase-Domäne des LRRK2 hat aber eine ganz andere gesamten Domain-Struktur 18. Dies ist als rekombinantes Protein von Invitrogen und wird als Standard-Steuerung in unserem Labor verwendet. Es sollte auch darauf hingewiesen, dass die kommerziell erhältliche Form von LRRK2 der N-Terminus des Proteins fehlt und ist mit Glutathion-S-transferase und dies sollte in Betracht als potenzieller Störfaktor gezogen werden, wenn die Durchführung Kinase-Assays mit diesem Protein markiert werden, da nicht bekannt ist, welche Rolle der N-terminal von LRRK2 kann in die normale Funktion dieses Proteins zu spielen. Wenn zum Beispiel der N-terminalen Teil des LRRK2, dass fehlt in dem Protein im Sinne dieses Protokollsist entscheidend für die Einstellung eines bestimmten Substrat der Kinase-Domäne des LRRK2 dann wird dies einen großen Einfluss auf die beobachteten Phosphorylierung haben das Substrat in der in vitro-System beschrieben. Selbst mit diesen Einschränkungen jedoch unterstreicht die Bedeutung, die Biologie der LRRK2 in der Parkinson-Forschung den Nutzen dieses Protokolls als ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung des Verhaltens dieses Proteins in einem in vitro-Einstellung.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> LRRK2 Wildtyp </td><td> Invitrogen </td><td> PV4873 </td><td></td></tr><tr><td> LRRK2 G2019S </td><td> Invitrogen </td><td> PV4881 </td><td></td></tr><tr><td> LRRK2 D1994A </td><td> Invitrogen </td><td> PV6051 </td><td></td></tr><tr><td> Kinase-Puffer </td><td> Cell Signalling </td><td> 9802S </td><td></td></tr><tr><td> MBP </td><td> Sigma </td><td> M1891 </td><td></td></tr><tr><td> 32P g ATP </td><td> Perkin Elmer </td><td> BLU002X500UC </td><td> 500μCi, 30Ci / mmol </td></tr><tr><td> 4x LDS-Probenpuffer </td><td> Invitrogen </td><td> NP0007 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Mercaptoethanol </td><td> Sigma </td><td> M6250 </td><td></td></tr><tr><td> Protein-Standards </td><td> Invitrogen </td><td> LC5800 </td><td></td></tr><tr><td> MOPS-Laufpuffer </td><td> Invitrogen </td><td> NP0001 </td><td></td></tr><tr><td> Bis-Tris Acrylamidgel </td><td> Invitrogen </td><td> NP0321 </td><td> 4-12% 1mm 10well </td></tr><tr><td> PVDF-Membran </td><td> Millipore </td><td> IPVH00010 </td><td></td></tr><tr><td> Übergabepuffer </td><td> Invitrogen </td><td> NP0006 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Reagenzien Destilliertes und deionisiertes Wasser wurde für alle Verdünnungsstufen eingesetzt <table border="1"><tbody><tr><td> Gerätetyp </td><td> Firma </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> Geigerzähler </td><td> Mini Instruments </td><td></td></tr><tr><td> SDS-PAGE-Tank </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Transfer-Tank </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Hitze blockiert (2) </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> Phosphor-Bildschirm </td><td> GE </td><td> X-ray-Film ersetzt werden kann </td></tr><tr><td> Phosphor iMager </td><td> GE </td><td></td></tr><tr><td> Exposure Kassette </td><td> GE </td><td></td></tr><tr><td> Zentrifuge </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> Perspex Abschirmung </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml Röhrchen </td><td> VWR </td><td> Schraubverschluss mit O-Ring </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Ausrüstung

assaying the kinase activity of lrrk2 in vitro

Leucin rich repeat kinase 2 (LRRK2) ist ein 2527 Aminosäure Mitglied der ROCO Familie von Proteinen, die über eine komplexe, Multidomain Struktur mit einem GTPase-Domäne (genannt ROC, für Ras komplexer Proteine) und eine Kinase-Domäne 1. Die Entdeckung im Jahr 2004 von Mutationen in LRRK2, dass die Parkinson-Krankheit (PD) führen führte LRRK2 wird im Mittelpunkt einer riesigen Menge von Forschung in seine normale Funktion und wie das Protein schief geht in der Krankheitszustand 2,3. Erste Untersuchungen in der Funktion des LRRK2 Schwerpunkt auf ihre enzymatische Aktivitäten 4-6. Obwohl ein klares Bild ist noch von einer konsistenten Änderung dieser durch Mutationen entstehen, hat Daten aus einer Anzahl von Gruppen die Bedeutung der Kinase-Aktivität von LRRK2 in den Zelltod in Verbindung mit Mutationen 7,8 hervorgehoben. Neuere Veröffentlichungen haben Inhibitoren gezielt die Kinaseaktivität von LRRK2 und bietet eine zentrale experimentelle Tool 9-11 gemeldet. In Anbetracht dieser Daten ist esist wahrscheinlich, dass die enzymatische Eigenschaften LRRK2 uns leisten einen wichtigen Einblick in die Biologie dieses Proteins, obwohl, ob sie mögliche Angriffspunkte für die Parkinson-sind, sei dahingestellt. Eine Reihe unterschiedlicher Ansätze wurden verwendet, um Tests der Kinase-Aktivität von LRRK2. Zunächst wurden Tests unter Verwendung von Epitop markierte Protein in Säugetier-Zelllinien überexprimiert durchgeführt und immunpräzipitiert, mit dem Tests durchgeführt mit diesem Protein auf Agaroseperlen 4,5,7 immobilisiert. Anschließend haben gereinigten rekombinanten Fragmente LRRK2 in Lösung auch verwendet worden, zum Beispiel ein GST getaggt Fragment aus Insektenzellen, die Rückstände von 970 bis 2527 von LRRK2 12 gereinigt. In jüngster Zeit Daniels et al. Die Isolierung der vollen Länge LRRK2 in Lösung aus menschlichen embryonalen Nierenzellen berichtet, jedoch dieses Proteins ist nicht allgemein zugänglich 13. Im Gegensatz dazu abgeschnitten dem GST-Fusionsprotein Form LRRK2 ist kommerziell verfügbe (von Invitrogen, siehe Tabelle 1 für weitere Details), und bietet ein komfortables Werkzeug für den Nachweis eines Assays für LRRK2 Kinase-Aktivität. Mehrere verschiedene Ausgänge für LRRK2 Kinase-Aktivität berichtet worden. Autophosphorylierung LRRK2 selbst, die Phosphorylierung von Myelin Basic Protein (MBP) als generische Kinase-Substrat und die Phosphorylierung von einem künstlichen Substrat - genannt LRRKtide, auf die Phosphorylierung von Threonin 558 in Moesin Basis - alle wurden verwendet, da eine Reihe von vermeintlichen physiologischen Substrate einschließlich α-Synuclein, Moesin und 4-EBP 14-17. Der Status dieser Proteine ​​als Substrate für LRRK2 bleibt unklar, und als solche den unten beschriebenen Protokoll wird zur Verwendung von MBP als generisches Substrat, in Anbetracht der Nützlichkeit dieses System Assay LRRK2 Kinase-Aktivität gegen eine Reihe von möglichen Substraten gerichtet konzentrieren.

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Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucin rich repeat kinase 2 ist ein großes Multidomain-Kinase, Mutationen, bei denen sind die häufigste genetische Ursache der Parkinson-Krankheit. Die Analyse der Kinase-Aktivität dieses Proteins hat sich als wichtiges Instrument für das Verständnis der Biologie und Dysfunktion des Proteins werden. In diesem Papier,<em&gt; In-vitro-</em&gt; Testen der Kinase-Aktivität von LRRK2 und eine Auswahl seiner Mutanten beschrieben wird, bietet ein experimentelles System zur Phosphorylierung von vermeintlichen Substraten und potenzielle Funktionsstörungen LRRK2 in Krankheit zu untersuchen.

Untersuchen der Kinase-Aktivität von LRRK2 In-vitro-</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

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Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

22.4K Aufrufe.  UCL Institute of Neurology. Leucin rich repeat kinase 2 ist ein großes Multidomain-Kinase, Mutationen, bei denen sind die häufigste genetische Ursache der Parkinson-Krankheit. Die Analyse der Kinase-Aktivität dieses Proteins hat sich als wichtiges Instrument für das Verständnis der Biologie und Dysfunktion des Proteins werden. In diesem Papier, In-vitro- Testen der Kinase-Aktivität von LRRK2 und eine Auswahl seiner Mutanten beschrieben wird, bietet ein experimentelles System zur...

Serie: Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals. Here, we describe an in vitro assay, "the reorientation assay", that has been used extensively to study the effect of extrinsic and intrinsic signals on the orientation of commissural axons2. This assay was developed by numerous people in the laboratories of Jane Dodd, Thomas Jessell and Andrew Lumsden (see acknowledgements for more details) and versions of this assay were used to demonstrate the reorientation activities of key axon guidance molecules, including the BMP chemorepellent in the roof plate3,4 and the chemoattractive activities of Netrin15 and Sonic Hedgehog (Shh)6 in the floor plate in the spinal cord.
Explants comprising 2-3 segments of the dorsal two-thirds of spinal cord are dissected from embryonic day (E) 11 rats and cultured in three dimensional collagen gels7. E11 dorsal spinal explants contain newly born commissural neurons, which can be identified by their axonal expression of the glycoprotein, Tag18. Over the course of 30-40 hours in culture, the commissural axon trajectory is recapitulated in these dorsal explants with a time course similar to that seen in vivo. This axonal trajectory can be challenged by placing either test tissues or a COS cell aggregate expressing a candidate signaling molecule in contact with one of the lateral edges of the dorsal explant. Commissural axons extending in the vicinity of the appended tissue will grow under the influence of both the endogenous roof plate and signals from the ectopic lateral tissue. The degree to which commissural axons are reoriented under these circumstances can be quantified. Using this assay, it is possible both to examine the sufficiency of a particular signal to reorient commissural axons3,4 as well the necessity for this signal to direct the commissural trajectory9.

This assay assesses the ability of a signaling molecule, here Bone Morphogenetic Protein 7 (BMP7), to reorient commissural axons. An explant of embryonic dorsal spinal cord is cultured adjacent to an aggregate of COS cells secreting the candidate growth factors. Reoriented commissural axons growing within the explant are visualized by immunohistochemistry.

Testen der Fähigkeit des diffusiblen Signalmoleküle zu embryonalen Spinal kommissuralen Axone neu ausrichten

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals.  Here, we ...

Forschung

Biologie

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

Überwachung Kinase und Phosphatase-Aktivitäten durch den Zellzyklus durch Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of acetate to acetyl phosphate utilizing ATP as a substrate. Acetate kinases are ubiquitous in the Bacteria, found in one genus of Archaea, and are also present in microbes of the Eukarya6. The most well characterized acetate kinase is that from the methane-producing archaeon Methanosarcina thermophila7-14. An acetate kinase which can only utilize PPi but not ATP in the acetyl phosphate-forming direction has been isolated from Entamoeba histolytica, the causative agent of amoebic dysentery, and has thus far only been found in this genus15,16.
In the direction of acetyl phosphate formation, acetate kinase activity is typically measured using the hydroxamate assay, first described by Lipmann17-20, a coupled assay in which conversion of ATP to ADP is coupled to oxidation of NADH to NAD+ by the enzymes pyruvate kinase and lactate dehydrogenase21,22, or an assay measuring release of inorganic phosphate after reaction of the acetyl phosphate product with hydroxylamine23. Activity in the opposite, acetate-forming direction is measured by coupling ATP formation from ADP to the reduction of NADP+ to NADPH by the enzymes hexokinase and glucose 6-phosphate dehydrogenase24.
Here we describe a method for the detection of acetate kinase activity in the direction of acetate formation that does not require coupling enzymes, but is instead based on direct determination of acetyl phosphate consumption. After the enzymatic reaction, remaining acetyl phosphate is converted to a ferric hydroxamate complex that can be measured spectrophotometrically, as for the hydroxamate assay. Thus, unlike the standard coupled assay for this direction that is dependent on the production of ATP from ADP, this direct assay can be used for acetate kinases that produce ATP or PPi.

A method for the determination of acetate kinase activity is described. This assay utilizes a direct reaction for determining enzyme activity and kinetics of acetate kinase in the acetate-forming direction with different phosphoryl acceptors. Furthermore, this method can be utilized for assaying other acetyl phosphate or acetyl-CoA utilizing enzymes.

Direkter Nachweis der Acetat-bildenden Aktivität des Enzyms Acetat-Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular functions in virtually all eukaryotic organisms. Specifically, in plants, the ubiquitin/26S proteasome system (UPS) regulates protein degradation and contributes significantly to development of a wide range of processes, including immune response, development and programmed cell death. Moreover, increasing evidence suggests that numerous plant pathogens, such as Agrobacterium, exploit the host UPS for efficient infection, emphasizing the importance of UPS in plant-pathogen interactions.
The substrate specificity of UPS is achieved by the E3 ubiquitin ligase that acts in concert with the E1 and E2 ligases to recognize and mark specific protein molecules destined for degradation by attaching to them chains of ubiquitin molecules. One class of the E3 ligases is the SCF (Skp1/Cullin/F-box protein) complex, which specifically recognizes the UPS substrates and targets them for ubiquitination via its F-box protein component. To investigate a potential role of UPS in a biological process of interest, it is important to devise a simple and reliable assay for UPS-mediated protein degradation. Here, we describe one such assay using a plant cell-free system. This assay can be adapted for studies of the roles of regulated protein degradation in diverse cellular processes, with a special focus on the F-box protein-substrate interactions.

Targeted protein degradation represents a major regulatory mechanism for cell function. It occurs via a conserved ubiquitin-proteasome pathway, which attaches polyubiquitin chains to the target protein that then serve as molecular &#8220;tags&#8221; for the 26S proteasome. Here, we describe a simple and reliable cell-free assay for proteasomal degradation of proteins.

Untersuchen proteasomalen Abbau in einem zellfreien System in Pflanzen

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Funktionelle Rekonstitution und Kanalaktivitätsmessungen von gereinigtem Wildtyp und mutierten CFTR-Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Die Messung der Aktivität in der Larven<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identifikation von Kinase-Substrat-Pairs Mit High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.