Dieses pneumatisch aktivierte mikrofluidische Kompressionsgerät kann verwendet werden, um mechanobiologie in 3D-Hydrogelkulturen von Wachstumsplattenchondrozyten zu studieren. Das mikrofluidische Gerät ist kosten- und zeiteffektiv, da es gleichzeitig mehrere Größen einer Kompression auf kleinen Probenvolumina erzeugen kann und verschiedene mikroskopische Bildgebungen mit dem Gerät angewendet werden können. Unsere Methode kann auch auf das Studium der Mechanobiologie anderer Zelltypen angewendet werden.
Um die Mikrokanalschicht einzurichten, mischen Sie zunächst PDMS mit einem Gewichtsverhältnis von 10 Prepolymeren zu einem Härtungsmittel für fünf Minuten. Als nächstes legen Sie die Form auf ein Schaumstoffpad und gießen Sie die Mischung in die Master-Form. Das PDMS 30 Minuten in einer Vakuumkammer entgasen und das entgaste PDMS mit einem Stück Transparenzfolie verdrehen.
Klemmen Sie die Sandwich-Baugruppe mit der Glasplatte, Schaumstoffpolstern und Plexiglasplatten. Das PDMS sechs Stunden lang bei 80 Grad Celsius aushärten und die PDMS-Schicht und den Transparenzfilm von der Sandwichstruktur isolieren. Aktivieren Sie die Oberflächen des PDMS und eine saubere Glasplatte mit dem Plasmareiniger für eine Minute, bevor Sie das PDMS 30 Minuten lang auf die Glasplatte im 80-Grad-Celsius-Ofen kleben.
Entfernen Sie dann den Transparenzfilm. Zur Herstellung der dünnen PDMS-Membran eine 60 Mikrometer dicke PDMS-Schicht auf einer Transparenzfolie mit 1.000 Umdrehungen pro Minute zu drehen. Das spinbeschichtete PDMS bei 80 Grad Celsius 20 bis 30 Minuten lang teilweise aushärten, bevor der Plasmareiniger die Mikrokanal-PDMS-Schicht auf der Glasplatte und die dünne PDMS-Schicht für eine Minute aktiviert.
Dann die dünne PDMS-Membranschicht auf die Mikrokanal-PDMS-Schicht kleben und die Schichten über Nacht in den 80-Grad-Celsius-Ofen legen. Zur Rohrblockzubereitung Metallrohre vertikal auf eine Petrischale legen und ungehärtetes PDMS vorsichtig in die Schale gießen, bis etwa 3/4 der Rohre untergetaucht sind. Nach der Entgasung des PDMS in einer Vakuumkammer für 30 Minuten, härten Sie das PDMS im Ofen bei 60 Grad Celsius für mehr als sechs Stunden aus.
Schneiden Sie am Ende des Aushärtungsprozesses ein Stück PDMS-Block mit einem Rohr und stanzen Sie ein Loch in die dünne PDMS-Schicht für den Einlass. Aktivieren Sie den PDMS-Block und die dünne PDMS-Schicht mit dem Plasmareiniger. Nach einer Minute den PDMS-Block am Einlassloch der dünnen PDMS-Schicht befestigen und die gesamte Betätigungseinheit über Nacht bei 80 Grad Celsius in den Ofen stellen.
Zur Herstellung von Agarose-Gel-Formen 5%Agarose und 200 Millimolar Calciumchlorid in entionisiertem Wasser mischen und die Agarose-Gel-Lösung bis zum Kochen erhitzen. Gießen Sie die gekochte Agarose-Gel-Lösung in eine Aluminiumform und verschließen Sie die Form mit der Glasplatte. Nach fünf Minuten das erstarrte Agarosegel aus der Aluminiumform entfernen.
Platte 150 Mikroliter Alginat-Chondrozyten-Lösung auf die aminosilanisierte Glasplatte und bedecken Sie die Lösung drei Minuten lang mit Agarose-Gelform. Verwenden Sie am Ende der Inkubation eine Rasierklinge, um die übermäßige Alginat-Gel-Lösung zu entfernen und die Agarose-Gelform von der Platte zu entfernen. Dann legen Sie die Alginat-Chondrozyten-Konstrukte in eine Vernetzungslösung mit 50 Millimolar Calciumchlorid und 140 Millimolar-Natriumchlorid in deionisiertem Wasser für eine Minute.
Um das Gerät zu montieren, lokalisieren Sie vier ein Millimeter dicke PDMS-Abstandshalter auf die vier Ecken der dünnen PDMS-Schicht der Betätigungseinheit. Bedecken Sie die Luftkammern der dünnen PDMS-Schicht mit 700 MikroliterChdrozytenkulturmedium. Platzieren Sie das Alginat-Chondrozyten-Konstrukt mit einem Stereo-Mikrosope auf der dünnen PDMS-Schicht, wobei Sie darauf achten, die Konstrukte an den Luftkammern auszurichten, und das Gerät mit 3D-gedruckten Klemmen einklemmen.
Zur Betätigung des Geräts verwenden Sie ein Stück Siliziumschläuche, um den Auslass einer Luftpumpe mit dem Einlass eines Magnetventils zu verbinden. Verwenden Sie ein zusätzliches Rohrstück, um den Auslass des Magnetventils mit dem Einlass des montierten Geräts zu verbinden. Verbinden Sie das Magnetventil mit einem Funktionsgenerator und verwenden Sie eine vom Funktionsgenerator erzeugte Einhertz-Quadratwelle, um das Magnetventil zu manipulieren.
Schalten Sie dann die Luftpumpe ein, um das Gerät pneumatisch zu betätigen. Das mikrofluidische Chondrozyten-Kompressionsgerät enthält fünf mal fünf Arrays zylindrischer Alginat-Chondrozytenkonstrukte, die mit fünf verschiedenen Komprimierungsgrößen komprimiert werden können. In diesem Beispiel wurde die Gelsäule durch die größte PDMS-Ballonumstiegumzahl um 33,8 % in der Höhe komprimiert, und die resultierende Druckdehnung der Gelkonstrukte wurde um etwa 5 % pro 0,2-Millimeter-Schritt und dem PDMS-Ballondurchmesser erhöht.
Die komprimive Verformung der Chondrozyten wurde durch DieAbbildung der Zellen in einem 613 mal 613 durch 40 bis 55 Mikrometer Volumen in der Nähe des Gelkonstruktzentrums bestimmt. Hier wird ein Bild einer Chondrozyte gezeigt, die durch den größten PDMS-Ballon um 16% komprimiert wurde. In diesem Diagramm kann die Verteilung der gemessenen Zellkompressionsdehnungswerte beobachtet werden.
In dieser Analyse wurden die Zellen durch größere PDMS-Ballons insgesamt stärker komprimiert. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die Mengen an Alginat-Gel und Chondrozytenkompression durch den Durchmesser der PDMS-Ballons unter einem konstanten Druck von 14 Kilopascal gesteuert werden. Um die Wiederholbarkeit der Geräteleistung zu gewährleisten, ist die Erstellung einer dünnen PDMS-Membran mit konstanter Dicke und Elastizität von entscheidender Bedeutung.
Nach diesem Verfahren können verschiedene biologische Assays wie Immunfluoreszenz und In-situ-Hybridisierung durchgeführt werden. Mit dieser Technik können viele Fragen zur Mechanotransduktion in Wachstumsplatten oder Gelenkchdrozyten beantwortet werden.
