Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es eine Aufklärung der Rolle ermöglicht, die zelluläre Kräfte in vielen physiologischen und pathologischen Prozessen spielen, wie z. B. Wundheilung und Krebsmetastasen. Der Hauptvorteil dieser mechanikbasierten Technik ist ihre Fähigkeit, Zell-Zell-Verbindungen gleichzeitig zu unterbrechen und ihre Auswirkungen auf zellgenerierte mechanische Kräfte, vor allem Traktionen und interzelluläre Stressoren, zu messen. Unser Protokoll ist auf eine Breite von pathophysiologischen Prozessen anwendbar, wie z. B. Krebsmetastasen, Atherosklerosen und Bluthochdruck.
Unsere Methoden können integriert werden, um sowohl biochemische als auch biomechanische Analysen mit Organ-on-Chip-Modellen, biotechnischen Gewebekonstrukten, In-vitro-Medikamentenabgabesystemen und Gewebe-Cokultursystemen durchzuführen. Unser Protokoll ist ziemlich einfach durchzuführen. Wir raten jedoch denjenigen, die dieses Protokoll zum ersten Mal tun, Geduld zu haben und nicht durch die Schritte dieses Protokolls zu eilen.
Unser Protokoll verfügt über einzigartige Schritte, die für Erstbenutzer möglicherweise nicht klar sind. Daher empfehlen wir Benutzern, unsere schriftlichen Schritt-für-Schritt-Verfahren zu befolgen und visuelle Demonstrationen als Anleitung zu verwenden. Zu Beginn bereiten Sie Blind-Silan-Lösung durch Mischen von 200 Milliliter ultrareinem Wasser mit 80 Mikroliter Essigsäure und 50 Mikroliter Silanmethacrylat.
Die Bind-Silan-Lösung mindestens eine Stunde lang auf einer Rührplatte rühren. Behandeln Sie die Mitte gut einer Petrischale mit der Bind-Silan-Lösung für 45 Minuten. Entfernen Sie die Bind-Silan-Lösung und spülen Sie die Petrischale zwei- bis dreimal mit ultrareinem Wasser ab.
Trocknen Sie die Petrischale Oberfläche und lagern Sie bei Raumtemperatur für die zukünftige Verwendung. Zur Herstellung der Hydrogellösung 12,49 Milliliter Reinstwasser in 2,062 Milliliter 40%Acrylamid und 375 Mikroliter 2%Bisacrylamid in einem 15-Milliliter-Zentrifugenrohr mischen. Fügen Sie der Hydrogellösung 80 Mikroliter fluoreszierende Perlen hinzu.
Schütteln Sie die Röhre vorsichtig, um die Perlen mit der Gellösung zu mischen. Halten Sie die Kappe locker auf dem Zentrifugenrohr und legen Sie sie in eine Vakuumkammer. Entgasen Sie die Gellösung für mindestens 45 Minuten in der Vakuumkammer.
Um das Hydrogel zu polymerisieren, fügen Sie zunächst 75 Mikroliter 10%Ammoniumpersulfat hinzu und fügen Sie dann acht Mikroliter TEMED in die Hydrogellösung ein. 24 Mikroliter der Hydrogellösung in die Mitte der Petrischale stellen. Drücken Sie auf das Hydrogel mit einem 18-Millimeter-Abdeckungsschlupf, um das Hydrogel abzuflachen und eine Höhe von ca. 100 Mikrometern zu erreichen.
Warten Sie mindestens 30 bis 40 Minuten auf die Gelpolymerisation. Tauchen Sie das polymerisierte Hydrogel in reines Ultrawasser ein, um eine Gelaustrocknung zu verhindern. Bedecken Sie die Petrischale mit Aluminiumfolie, um das Photobleichen von fluoreszierenden Perlen zu verhindern und bei vier Grad Celsius aufzubewahren.
Mischen Sie zunächst die PDMS-Silikonbasis mit dem Silikonhärtemittel im Verhältnis 20 zu eins in einem 50-Milliliter-Zentrifugenrohr. Invertieren Sie das Rohr auf den Kopf und schütteln Sie kräftig mehrmals, um eine ordnungsgemäße Durchmischung der PDMS-Lösung zu gewährleisten. Entfernen Sie die Blasen in der PDMS-Lösung, indem Sie eine Minute lang bei 190-fachen G.Pour fünf bis sechs Milliliter der PDMS-Lösung in der Mitte einer 100-Millimeter-Petrischale zentrieren, und erregen Sie die Schale, bis die PDMS-Lösung die gesamte Petrischalenoberfläche abdeckt.
Härten Sie die PDMS-Lösung über Nacht bei 50 bis 60 Grad Celsius. Entfernen Sie anschließend eine kreisförmige PDMS-Schablone mit einem Lochstanzer mit einem Durchmesser von 16 Millimetern. Verwenden Sie einen Biopsies-Punch mit einem Durchmesser von 1,25 Millimetern, um kleine Löcher in der PDMS-Schablone zu erstellen.
Sterilisieren Sie PDMS-Schablonen, indem Sie sie zwei bis drei Minuten lang in 70% Ethanol eintauchen, überschüssiges Ethanol absanieren und dann fünf Minuten unter UV-Licht stellen. Alle überschüssigen Flüssigkeiten ansaugen und den Deckelschlupf aus dem Hydrogel entfernen. Legen Sie die PDMS-Schablone auf die Hydrogeloberfläche und verwenden Sie eine Pinzette, um leichten Druck auf die PDMS-Schablone auszuüben, um eine wasserdichte Abdichtung zwischen der PDMS-Schablone und der Hydrogeloberfläche zu gewährleisten.
Bedecken Sie die Hydrogeloberfläche mit Sulfo-SAMPA gelöst in 0,1 Molaren-HEPES-Pufferlösung in einer Konzentration von 1 bis 1 000 und legen Sie das Hydrogel acht Minuten lang unter eine UV-Lampe mit einer Leistung von 36 Watt. Die überschüssige Sulfo-SAMPA- und HEPES-Lösung ansaugen und das Hydrogel zweimal mit 0,1 Mol-HEPES abspülen, gefolgt von zwei zusätzlichen Spülungen mit reinem Ultrawasser. Aspirieren Sie überschüssiges ultrareines Wasser und verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette, um das Hydrogel mit 0,1 Milligramm pro Milliliter Kollagen-1 zu beschichten.
Bedecken Sie die Schale, um die fluoreszierenden Perlen vor Photobleichungen zu schützen, und lagern Sie das Hydrogel über Nacht bei vier Grad Celsius. Fügen Sie nun drei Milliliter 1X Trypsin in den Kolben und legen Sie es in den Inkubator bei 37 Grad Celsius für drei bis fünf Minuten, um die Zellen von der Gewebekultur-Flasche zu lösen. Nach der Trypsinisierung drei Milliliter Zellkulturmedien in den Kolben geben, wirbeln und die Mischung in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr geben.
Zentrifugieren Sie die Zelllösung für drei Minuten bei 1, 710 mal G.Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in den Medien auf eine Konzentration von 50 mal 10 zu den vier Zellen pro Milliliter wieder aus. Nehmen Sie die Hydrogelschale aus dem Kühlschrank. Entfernen Sie das Collagen-1 aus dem Hydrogel und spülen Sie es einmal mit PBS ab.
Fügen Sie 75 mal 10 zu den dritten Zellen an der Spitze der PDMS-Schablone hinzu und lassen Sie die Zellen mindestens eine Stunde lang im Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid an der Hydrogeloberfläche anhaften. Entfernen Sie die PDMS-Schablone und tauchen Sie die PDMS-Schablone 10 x 15 Sekunden lang in 10-fache Trypsin-Datei unter, um alle angeschlossenen Zellen zu entfernen. Fügen Sie mindestens zwei Milliliter Medien in die Petrischale und sterilisieren Sie die Schablone, indem Sie mit 70% Ethanol sprühen und dann fünf Minuten unter das UV-Licht stellen.
Legen Sie die Petrischale mindestens 36 Stunden im Inkubator oder bis eine konfluente Monoschicht beobachtet wird. Phasenkontrastbilder von 30 Minuten vor der Chalcone-Behandlung und zwei Stunden nach der Chalcone-Behandlung wurden verglichen. Zellinduzierte Perlenverschiebungen wurden beobachtet, um sowohl bei niedrig dosierten Chalcone- als auch bei hochdosierten Chalcon-Bedingungen im Vergleich zu HUVEC-Monolayern zu verringern.
Vor der Chalcone-Behandlung lagen die RMS-Traktionen für alle Erkrankungen bei rund 51 Pascal. Nach der Chalcone-Behandlung gab es einen leichten Anstieg der RMS-Traktionen auf 59 Pascal in niedrig dosierten, mit Chalcon behandelten Monolayern und eine fast zweifache Abnahme der RMS-Traktionen auf 18 Pascal in hochdosierten, mit Chalkonbehandelten Monolayern im Vergleich zur Kontrolle. Die Chalcone-Behandlung erhöhte die durchschnittliche normale interzelluläre Stressgröße mit niedriger Dosis, verringerte aber signifikant die durchschnittliche normale interzelluläre Stressgröße mit hoher Dosis im Vergleich zur Kontrolle.
Die Chalcone-Behandlung verringerte auch die maximale reinzelluläre Belastung bei niedriger und hoher Chalcone-Konzentration im Vergleich zur Kontrolle. Die Auswirkungen der Chalcone-Behandlung sind statistisch signifikant, basierend auf T-Tests und Einem-Faktor-ANOVA-Tests. Stellen Sie beim Auflegen der PDMS-Schablone auf das Gel sicher, dass das Gel trocken genug ist, um eine wasserdichte Abdichtung zwischen der PDMS-Schablone und dem Gel zu gewährleisten.
Dieses Protokoll kann auch angewendet werden, um den biomechanischen Beitrag einer Vielzahl von Zell-Zell-Verbindungen, Zytoskelettproteinen, Zellmatrix-Adhäsionsmolekülen oder extrazellulären Molekülen mit Live-Bildgebung zu untersuchen. Mit diesem In-vitro-Protokoll können Forscher nun erfolgreich eine Vielzahl biomechanischer sowie biochemischer Eigenschaften bei Gewebereparatur, Wundheilung oder Krebsmetastasen ohne Tiermodell untersuchen. Wir raten unseren Zuschauern, sehr vorsichtig zu sein, während chalcone und DMSO als Inhalation dieser Medikamente wird berichtet, schädlich zu sein.
