Die Finanzierung wurde von &quot;Progetto ein concorso Fondazione Ospedale Maggiore Policlinico IRCCS 2009-2010&quot;, um MD, und Associazione Bambino Nefropatico ABN Onlus, Milano bereitgestellt

Alle Tierversuche wurden nach der aktuellen nationalen und europäischen Vorschriften über den Schutz von Tieren zu wissenschaftlichen Zwecken verwendet und überprüft wurden und von der Ethikkommission der Universität Mailand durchgeführt genehmigt. 1. Isolierung von Primär Osteoblasten Die Methode, mit geringfügigen Änderung, nach dem von Dodig et al 14 beschrieben ist. <ol><li> Vorbereitung Digestionsmittel, durch Zugabe von 0,1% Collagenase P und 0,05% Trypsin (ab 2,5% Trypsin 10X, ohne Phenolrot) mit HBSS-Medium (Hanks Balanced Salt Solution, ohne Calcium, Magnesium oder Phenolrot). </li><li> Verwenden Sie 3-4 Tage alten Mäusen (das Verfahren kann so wenig wie 1-Maus angewendet werden.) </li><li> Sacrifice durch Enthauptung. Sprühen Sie den Kopf mit 70% Ethanol und auf Eis zu halten. Entfernen Sie Haut-und Muskelschichten durch Pinzette und Seziersaal / chirurgische Schere. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Scheitelbeine undtrennen Sie diese, indem Sie die Pfeilnaht in zwei Hälften. Stellen Sie sicher, Knochen sind frei von Nähten und anhaftendem Gewebe und legen einzelnen Knochenstücke in gut-Platten mit HBSS Medium, bis das Verfahren abgeschlossen ist. </li><li> Entsorgen HBSS und fügen Sie in jede Vertiefung der Digestionsmittel für 15 min bei 37 ° C </li><li> Überstand verwerfen. </li><li> Fügen Sie die Verdauung wieder Medium für 15 min bei 37 ° C </li><li> Diese Zeit zu sparen den Überstand und legen Sie sie in alpha-MEM (Minimum Essential Medium) mit 10% FBS (Fetal Bovine Serum) und 1% Streptomycin / Penicillin. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.7 und 1.8 2x. </li><li> Pool der drei Fraktionen gesammelt, Spin-Zellen durch Zentrifugation bei 425 g für 5 min den Überstand verwerfen, 3 ml ergänzten alpha-MEM, um das Zellpellet resuspendieren und in ein 25 cm 2-Kolben. </li><li> Ändern Sie das Medium nach 24 Stunden, um Schmutz und abgestorbene Zellen zu entfernen. </li><li> Dann werden 50 &amp;mgr; g / ml Ascorbinsäure (AA) und 3 mM GlyCEROL 2-phosphat Dinatriumsalz-Hydrat (GP) an die alpha-MEM-Medium. </li><li> Danach ändern Sie die Medium (MEM alpha-Plus AA / GP) jeden zweiten Tag. </li></ol> 2. ATRA-Protokoll <ol><li> Führen Sie alle Experimente mit ATRA (All-Trans-Retinsäure) in einem abgedunkelten Raum, um die Inaktivierung zu verhindern. </li><li> Bereiten Sie eine 1X Trypsin-Lösung in HBSS Medium und halten bei 37 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Entfernen Sie das Medium aus subkonfluente Zellen und waschen Sie sie sorgfältig mit HBSS. </li><li> 1 ml Trypsin, sanft drehen Sie den Kolben, damit alle Zellen durch Trypsin abgedeckt werden, und Inkubation für 3 min bei 37 ° C </li><li> Überprüfen Sie für die eigentliche Ablösung von Zellen unter einem inversen Mikroskop. </li><li> 3 ml alpha-MEM-Medium, um Trypsin zu inaktivieren. </li><li> Recover die Zellen und Zentrifugieren für 15 min bei 425 g. </li><li> Zellpellet in frischem Medium. </li><li> Geben Sie einen Tropfen in einer Zählkammer Zählkammer, zu ermöglichen, für ein paar Minuten absetzen und zählen die cell Nummer. </li><li> Ort Zellen in 25 cm 2-Kolben in einer Dichte von 10.000 Zellen / cm 2 mit Alpha-MEM sowie AA / GP. Seien Sie sich bewusst, dass die Zelldichte, die für die optimale Entwicklung von Zellprozessen und interzellulären Kontakten. Ein Ausgangsdichte von mehr als 10.000 Zellen / cm 2 beeinträchtigt die richtige Entwicklung von Zellprozessen, aber niedrigere Zellzahlen führen zu vorzeitigem Zelltod aufgrund der Abwesenheit von interzellulären Kontakten. </li><li> In 5 uM ATRA auf das Medium alle 24 Stunden. </li><li> Überwachen Sie die Zellen täglich Morphologie beurteilen: morphologische Veränderungen werden in der Regel nach 48 Stunden beobachtet. Wenn nach der ersten 24-48 Stunden werden die Zellen noch proliferierenden, Ausstrich auf die oben Dichte. Eine homogene Population von reifen Knochenzellen vorhanden ist, nach 4-5 Tagen. Abhängig von den Anforderungen, zu verwenden Zellen zu jedem Zeitpunkt, bis zu 12-15 Tagen. </li><li> Wenn Zellen auf anderen Trägern (wie Deckgläser oder Well-Platten) plattiert, sicher sein, dass die oben Dichte beibehalten wird undATRA weiterhin alle 24 Stunden bis zur Verwendung hinzufügen. Zellen lassen sich an die neue Träger für mindestens 24 h vor dem Experiment zu haften. </li></ol> 3. Immunfärbung <ol><li> Für Immunfärbung Platte die Zellen auf Deckgläsern und folgen etablierten Methoden (siehe zB Burry 15). </li><li> Zum Beispiel kann für die indirekte Immunfluoreszenz, fix in 4% Paraformaldehyd oder kaltem Aceton inkubiert sequentiell mit dem primären Antikörper bei RT für 1 Stunde in einer feuchten Kammer, dann mit der fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper im Dunkeln bei RT für 30 min, in einer befeuchteten Kammer. </li><li> Verwenden DAPI oder Analoga für die Kerngegenfärbung, und montieren in der Anti-Fading-Medium. </li></ol> 4. Alizarinrot Färbung und Extraktion <ol><li> Platte die Zellen auf Deckgläsern. </li><li> Fixieren die Zellen durch Eintauchen des Deck in 70% Ethanol für 10 min. </li><li> Decken Sie die Zellen mit einigen Tropfen Alizarin-Rot-Färbung-Lösung (1 mg / ml, pH 5,5)für 30 min. </li><li> Mit Leitungswasser waschen Sie die Deckgläser. Montieren Sie mit einem Tropfen Glycerin auf Glasobjektträger und nehmen Sie Bilder mit einem aufrechten Mikroskop bei 10X und 20X Vergrößerung. </li><li> Nach dem obigen Verfahren erholen die Deckgläser durch Eintauchen der Objektträger in Leitungswasser. </li><li> Setzen jedes Deckglas in einem Well-Platte. </li><li> In 60% Perchlorsäure (die Menge hat, genug, um die Zellen vollständig bedeckt sein) und lassen O / N bei 4 ° C unter leichtem Schütteln. </li><li> Messen der optischen Dichte des Überstands durch Spektrophotometrie bei 450 nm Wellenlänge. </li><li> Um Werte für die Zellzahl zu normalisieren, fügen Janus Green (0,2% ige Lösung in PBS), um die Zellpräparation für 10 Minuten abdecken. </li><li> Sorgfältig mit hochreinem Wasser waschen. </li><li> In 0,5 N HCl (die Menge hat, genug, um alle Zellen zu decken) und schütteln mit der Hand ein paar Sekunden. </li><li> Die Absorption bei 615 nm spektralphotometrisch. </li></ol>

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	<li>Schneider, P., Meier, M., Wepf, R., M&#252;ller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+quantitative+3D+imaging+of+the+osteocyte+lacuno-canalicular+network.">Towards quantitative 3D imaging of the osteocyte lacuno-canalicular network.</a> Bone. 47 (5), 848-858 (2010).</li><li>Cheng, F., Hulley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+osteocyte--a+novel+endocrine+regulator+of+body+phosphate+homeostasis.">The osteocyte--a novel endocrine regulator of body phosphate homeostasis.</a> Maturitas. 67 (4), 327-338 (2010).</li><li>Paic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differentially+expressed+genes+between+osteoblasts+and+osteocytes.">Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes.</a> 45 (4), 682-692 (2009).</li><li>Dallas, S. 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E., J&#228;hn, K., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+osteocytes+from+the+long+bones+of+skeletally+mature+and+aged+mice.">Isolation and culture of primary osteocytes from the long bones of skeletally mature and aged mice.</a> Biotechniques. 52 (6), 361-373 .</li><li>Kalajzic, I., Matthews, B. G., Torreggiani, E., Harris, M. A., Divieti Pajevic, P., Harris, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+approaches+to+study+osteocyte.">In vitro and in vivo approaches to study osteocyte.</a> Bone. 54 (2), 296-206 .</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+an+osteocyte-like+cell+line,+MLO-Y4.">Establishment and characterization of an osteocyte-like cell line, MLO-Y4.</a> J Bone Miner Metab. 17 (1), 61-65 (1999).</li><li>Mattinzoli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+model+of+in+vitro+osteocytogenesis+induced+by+retinoic+acid+treatment.">A novel model of in vitro osteocytogenesis induced by retinoic acid treatment.</a> Eur Cell Mater. 24, 403-425 (2012).</li><li>Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoids+in+embryonal+development.">Retinoids in embryonal development.</a> Physiol Rev. 80 (3), 1021-1054 (2000).</li><li>Clagett-Dame, M., McNeill, E. M., Muley, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+all-trans+retinoic+acid+in+neurite+outgrowth+and+axonal+elongation.">Role of all-trans retinoic acid in neurite outgrowth and axonal elongation.</a> J Neurobiol. 66 (7), 739-756 (2006).</li><li>Vaughan, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATRA+induces+podocyte+differentiation+and+alters+nephrin+and+podocin+expression+in+vitro+and+in+vivo.">ATRA induces podocyte differentiation and alters nephrin and podocin expression in vitro and in vivo.</a> Kidney Int. 68 (1), 133-144 (2005).</li><li>Dodig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+TAAT-containing+motif+required+for+high+level+expression+of+the+COL1A1+promoter+in+differentiated+osteoblasts+of+transgenic+mice.">Identification of a TAAT-containing motif required for high level expression of the COL1A1 promoter in differentiated osteoblasts of transgenic mice.</a> J Biol Chem. 271 (27), 16422-16429 (1996).</li><li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemistry.">Immunocytochemistry.</a> A practical guide for biomedical research. , (2010).</li><li>Woo, S. M., Rosse, r. J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo.">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> J Bone Miner Res. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li><li>Gu, G., Nars, M., Hentune, n. T. A., Metsikk&#246;, K., V&#228;&#228;n&#228;nen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+primary+osteocytes+express+functional+gap+junctions+in+vitro.">Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro.</a> Cell Tissue Res. 323 (2), 263-271 (2006).</li><li>Boukhechba, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+osteocyte+differentiation+in+a+3D+culture+system.">Human primary osteocyte differentiation in a 3D culture system.</a> J Bone Miner Res. 24 (11), 1927-1935 (2009).</li><li>Krishnan, V., Dhurjati, R., Vogler, E. A., Mastro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenesis+in+vitro:+from+pre-osteoblasts+to+osteocytes:+a+contribution+from+the+Osteobiology+Research+Group,+The+Pennsylvania+State+University.">Osteogenesis in vitro: from pre-osteoblasts to osteocytes: a contribution from the Osteobiology Research Group, The Pennsylvania State University.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46 (1), 28-35 .</li><li>Irie, K., Ejiri, S., Sakakura, Y., Shibui, T., Yajima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+mineralization+as+a+trigger+for+osteocyte+maturation.">Matrix mineralization as a trigger for osteocyte maturation.</a> J Histochem Cytochem. 56 (6), 561-567 .</li><li>Hirao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+tension+is+an+important+mediator+of+the+transformation+of+osteoblasts+to+osteocytes.">Oxygen tension is an important mediator of the transformation of osteoblasts to osteocytes.</a> J Bone Miner Metab. 25 (5), 266-276 (2007).</li><li>Brounais, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+oncostatin+M+treatment+induces+an+osteocyte-like+differentiation+on+osteosarcoma+and+calvaria.">Long term oncostatin M treatment induces an osteocyte-like differentiation on osteosarcoma and calvaria.</a> Bone. 44 (5), 830-839 (2009).</li><li>Gupta, R. R., Yoo, D. J., Hebert, C., Niger, C., Stains, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+an+osteocyte-like+phenotype+by+fibroblast+growth+factor-2.">Induction of an osteocyte-like phenotype by fibroblast growth factor-2.</a> Biochem Biophys Res Commun. 402 (2), 258-264 (2010).</li><li>Poole, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sclerostin+is+a+delayed+secreted+product+of+osteocytes+that+inhibits+bone+formation.">Sclerostin is a delayed secreted product of osteocytes that inhibits bone formation.</a> FASEB J. 19 (13), 1842-1844 (2005).</li><li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Osteocyte:+An+Endocrine+Cell+and+More.">The Osteocyte: An Endocrine Cell and More.</a> Endocr Rev. 34 (5), 658-690 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In den letzten Jahren hat sich die Osteozyten als die zentrale Zelle im Knochen entstanden. Fortschritte in der Forschung schrittweise enthüllt eine Reihe von bisher unbekannten oder unbewiesen osteocyte Eigenschaften, die für die Gestaltung von neuen und besseren Behandlung für eine Vielzahl von Knochenerkrankungen von enormem Wert sind. Allerdings hat die Untersuchung von osteocyte Biologie an der begrenzten Verfügbarkeit von in-vitro-Modelle leidet so sehr, dass Osteoblasten haben als Ersatzzellen über ...

Osteozyten, die häufigste Knochenzelltyp sind terminal differenzierte, hochverzweigten Zellen tief in das Skelett entfernt. Der Zellkörper der reifen Knochenzellen werden im Knochen Lücken enthalten und haben unterschiedliche Formen; Osteozyten mit länglichen Zellkörper sind in den kortikalen Knochen gefunden, während abgerundete Osteozyten sind häufiger in der trabekulären Knochen ein. Verzweigte Dendriten erstrecken sich vom Zellkörper und befinden sich in winzigen Kanälen Kanälchen genannt, bilden ein komplexes Netz, das mehrere Kontakte nicht nur mit anderen Osteozyten, sondern auch mit anderen Knochenzelltypen, Knochenmark, Blutgefäße und damit verbundene Perizyten macht. Durch die Lücken und Kanälchen in der interstitiellen Flüssigkeit enthalten, sind Osteozyten letztlich auch dem Umlaufsystem verbunden, deshalb sind sie nicht nur lokale, sondern auch systemische Ereignisse, und umgekehrt, ihr Verhalten kann sowohl von lokalen und systemischen Veränderungen 2 geregelt werden, beeinflussen können. DieStudium der Osteozyten hat vor kurzem an Dynamik gewonnen, dank einiger technischer Verbesserungen, wie die Erzeugung von Gewebe-und zellspezifische transgene Tiere, die Verwendung von leistungsstarken Mikroskopie-Techniken und der Hochdurchsatz-Screening Molekular 3,4. Allerdings ist die Kenntnis dieser Zellen noch unvollständig, vor allem aufgrund der relativen Knappheit von angemessenen in vitro-Modellen. Eigentlich habe Osteozyten immer schwierig, wegen der tiefen Lage zu erhalten und zu pflegen in der Kultur, und das niedrige Niveau der Verbreitung, die eine solche differenzierte Zelltyp charakterisiert. Entlang der Jahre eine Reihe von Methoden entwickelt worden, um primäre Knochenzellen 5-7 isolieren, obwohl sie produzieren in der Regel niedriger Zellausbeuten und tragen das Risiko, dass sogar ein paar verunreinigen Fibroblasten schnell überwuchern die Osteozyten 8. Aus diesem Grund sind die meisten experimentellen in vitro Arbeit wurde bisher auf die etablierten osteocyte Zelle l durchgeführtine MLO-Y4 9. Weitere In-vitro-Methoden könnte die Möglichkeit der Untersuchung dieser Zellen zu erhöhen und könnte die Analyse der osteocyte Biologie und Pathophysiologie verbessern. Um weitgehend angenommen werden, sollten diese Methoden einfach zu reproduzieren, und würde nicht verlangen, spezielle Instrumente oder sehr lange Zeiten Zellreifung zu erreichen. Wichtig ist, wenn für Primärzellen, würden sie machen es möglich, die Vorteile von transgenen Tieren zu nehmen. Wir haben kürzlich beschrieben, dass die Behandlung der Osteoblasten-Zelllinie MC3T3-E1 und der primären Osteoblasten mit Retinsäure induziert eine rasche Änderung Phänotyp führt zu der Entwicklung einer homogenen Population von Zellen, die verzweigte morphologische und molekulare Merkmale von Osteozyten 10. All-trans-Retinsäure (ATRA) ein aktives Stoffwechselprodukt von Vitamin A, die Gen-Transkription reguliert durch Bindung der Kern Retinsäure-Rezeptoren (RARs). RARan DNA binden als Heterodimere mit dem Retinoid-X-Rezeptoren (RXRs), letztlich auf die Modulation von Retinsäure (RA) ansprechenden Zielgene 11 führt. ATRA ist gezeigt worden, die Differenzierung und Reifung von mehreren Zelltypen zu modulieren, darunter andere verzweigte Zellen, wie Nervenzellen 12 und 13 podocytes. Das hier beschriebene Verfahren wird nach Zugabe von ATRA an primären Osteoblasten basiert. Um wirksam zu sein, muss ATRA an einer präzisen Reifestufe auf Zellen in einem definierten Dichte ausplattiert hinzugefügt werden; Nach unserer Erfahrung diese Bedingungen sind für den Phänotyp Schalter von Osteoblasten Osteozyten erhalten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:923px;" width="923">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:283px;">Name</td>
			<td style="width:239px;">Company</td>
			<td style="width:219px;">Cat #</td>
			<td style="width:183px;">comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase P</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>11213857001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>14175129</td>
			<td>Pre-warm at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alpha-MEM</td>
			<td>Invitrogen, Life Technologies</td>
			<td>22571038</td>
			<td>Pre-warm at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptomycin/Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ATRA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Protect ATRA from light</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Dissolve in PBS and filter before use. Work always under a chemical hood.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32670</td>
			<td>Can be added to the secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alizarin red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Janus Green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Perchloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>176745</td>
			<td>Use with caution (skin and eye protection are recommended)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>Use with caution (skin and eye protection are recommended)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">fluorsave</td>
			<td>Calbiochem - Merck</td>
			<td>345789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Economy Tweezers #7, 0.40 x 0.5mm tips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Economy Tweezers #4, 0.40 x 0.45mm tips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting Scissors, straight,10cm curved</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical Scissors, 14 cm, straight, S/S</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Well-plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermanox coverslips</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td>12-565-27</td>
			<td></td>
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			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
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			<td>Zeiss Apotome</td>
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			<td height="20" style="height:20px;">spectrometer</td>
			<td>Safas Xenius</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
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application of retinoic acid to obtain osteocytes cultures from primary mouse osteoblasts

<html> Die Notwendigkeit für osteocyte Kulturen ist gut für die Gemeinschaft der Knochenforscher bekannt; Isolierung von primären Knochenzellen ist schwierig und produziert niedrigen Zellzahlen. Daher ist die am meisten verwendete Zellsystem die Osteozyten-ähnliche MLO-Y4-Zelllinie. Das hier beschriebene Verfahren bezieht sich auf die Verwendung von Retinsäure, um eine homogene Population von Zellen, die mit verzweigten morphologischen und molekularen osteocyte Eigenschaften zu erzeugen. Nach Isolierung von Maus-Calvaria Osteoblasten, ist all-trans-Retinsäure (ATRA) zur Zellmedium zugegeben und Zellenüberwachung wird täglich unter einem Umkehrmikroskop durchgeführt. Erste morphologische Veränderungen nach 2 Tagen der Behandlung und Differenzierung nachweisbar ist im allgemeinen innerhalb von 5 Tagen vollständig, mit fortschreitenden Entwicklung von Dendriten, Verlust der Fähigkeit, die extrazelluläre Matrix zu erzeugen, die Herunterregulierung der Osteoblastenmarkern und Hochregulierung von Osteozyten-spezifischen Molekülen. Inhalt &quot;&gt; Tägliche Zellenüberwachung ist wegen der inhärenten Variabilität der Primärzellen benötigt werden, und das Protokoll kann mit minimaler Variation, um Zellen von verschiedenen Mausstämmen erhalten und transgene Modelle angewendet angepasst werden. Das Verfahren ist einfach durchzuführen und erfordert keine spezielle Instrumentierung erforderlich, es in hohem Maße reproduzierbar ist, und erzeugt schnell eine ausgereifte Osteozyten Bevölkerung in vollständiger Abwesenheit von extrazellulären Matrix, was die Verwendung dieser Zellen für unbegrenzte biologische Anwendungen.

Ergebnisse wurden zwischen 5 und 10 unabhängigen Experimenten erhalten. Zellmorphologie AA / GP behandelt Primärzellen haben meist Kopfsteinpflaster-ähnliche Funktionen, die charakteristisch für reife Osteoblasten. Dazwischen verzweigten Zellen (wie durch die roten Pfeile in 1A angegeben) gefunden werden kann, die wahrscheinlich einige Osteozyten stellen. Mit ATRA-Behandlung, Zellen beginnen rasch Anzeige Verzweigungen,...

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Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

Die Behandlung der primären Maus Osteoblasten mit Retinsäure erzeugt eine homogene Population von verzweigten Zellen, die morphologischen und molekularen Merkmalen des Osteozyten. Das Verfahren überwindet die Schwierigkeiten bei der Erlangung und Aufrechterhaltung der primären Knochenzellen in Kultur, und kann vorteilhaft sein, Zellen aus transgenen Modellen abgeleitet studieren.

Anwendung von Retinsäure zu Osteozyten Kulturen aus primären Maus-Osteoblasten erhalten

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

application-retinoic-acid-to-obtain-osteocytes-cultures-from-primary

Research

JoVE Journal

Biology

13.3K Aufrufe.  Fondazione IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico.  Die Behandlung der primären Maus Osteoblasten mit Retinsäure erzeugt eine homogene Population von verzweigten Zellen, die morphologischen und molekularen Merkmalen des Osteozyten. Das Verfahren überwindet die Schwierigkeiten bei der Erlangung und Aufrechterhaltung der primären Knochenzellen in Kultur, und kann vorteilhaft sein, Zellen aus transgenen Modellen abgeleitet studieren. 

Serie: Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

Primäre neuronale Kulturen aus den Gehirnen von Late Stage Drosophila Puppen

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Forschung

Biologie

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

Primäre Dissoziierte Mittelhirn Dopamin Zellkulturen aus Nager Neugeborene

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized. Primary cells are preferred in studies of cell cycle control, apoptosis, and DNA repair, as cancer cells carry mutations in genes involved in these processes. Primary cells cannot be cultured indefinitely due to the onset of replicative senescence or aneuploidization. Hence, new cultures need to be established regularly. The procedure for isolation of rodent embryonic fibroblasts is well established, but isolating adult fibroblast cultures often presents a challenge. Adult rodent fibroblasts isolated from mouse models of human disease may be a preferred control when comparing them to fibroblasts from human patients. Furthermore, adult fibroblasts are the only available material when working with wild rodents where pregnant females cannot be easily obtained. Here we provide a protocol for isolation and culture of adult fibroblasts from rodent skin and lungs. We used this procedure successfully to isolate fibroblasts from over twenty rodent species from laboratory mice and rats to wild rodents such as beaver, porcupine, and squirrel.

This article describes a protocol for isolation and maintenance of primary fibroblast cultures from skin and lung tissue of wild rodents.

Gründung Primary Adult Fibroblastenkulturen von Nagetieren

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Primären Zellkulturen aus Drosophila Gastrula Embryonen

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial arrhythmia triggers in mice. To investigate the electrical and biological properties of cardiac melanocytes we developed a procedure to isolate them from mouse hearts that we derived from those designed to isolate neonatal murine cardiomyocytes. In order to obtain healthier cardiac melanocytes suitable for more extensive patch clamp or biochemical studies, we developed a refined procedure for isolating and plating cardiac melanocytes based on those originally designed to isolate cutaneous melanocytes. The refined procedure is demonstrated in this review and produces larger numbers of healthy melanocyte-like cells that can be plated as a pure population or with cardiomyocytes.

In this protocol, we identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial arrhythmia triggers in mice.&#160;

Isolieren Primäre Melanozyten-ähnlichen Zellen aus der Maus Herz

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Over the last decade, several adult stem cell populations have been identified in human skin 1-4. The isolation of multipotent adult dermal precursors was first reported by Miller F. D laboratory 5, 6. These early studies described a multipotent precursor cell population from adult mammalian dermis 5. These cells--termed SKPs, for skin-derived precursors-- were isolated and expanded from rodent and human skin and differentiated into both neural and mesodermal progeny, including cell types never found in skin, such as neurons 5. Immunocytochemical studies on cultured SKPs revealed that cells expressed vimentin and nestin, an intermediate filament protein expressed in neural and skeletal muscle precursors, in addition to fibronectin and multipotent stem cell markers 6. Until now, the adult stem cells population SKPs have been isolated from freshly collected mammalian skin biopsies.
Recently, we have established and reported that a population of skin derived precursor cells could remain present in primary fibroblast cultures established from skin biopsies 7. The assumption that a few somatic stem cells might reside in primary fibroblast cultures at early population doublings was based upon the following observations: (1) SKPs and primary fibroblast cultures are derived from the dermis, and therefore a small number of SKP cells could remain present in primary dermal fibroblast cultures and (2) primary fibroblast cultures grown from frozen aliquots that have been subjected to unfavorable temperature during storage or transfer contained a small number of cells that remained viable 7. These rare cells were able to expand and could be passaged several times. This observation suggested that a small number of cells with high proliferation potency and resistance to stress were present in human fibroblast cultures 7.
We took advantage of these findings to establish a protocol for rapid isolation of adult stem cells from primary fibroblast cultures that are readily available from tissue banks around the world (Figure 1). This method has important significance as it allows the isolation of precursor cells when skin samples are not accessible while fibroblast cultures may be available from tissue banks, thus, opening new opportunities to dissect the molecular mechanisms underlying rare genetic diseases as well as modeling diseases in a dish.

Na&amp;#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

We report a method to isolate na&#239;ve multipotent skin-derived precursor (SKP) cells from primary human fibroblast cultures. We show that these SKPs derived from fibroblast cultures share similar stem cell properties to the ones derived directly from human skin biopsies. These cells express the neural crest marker, nestin, in addition to the multipotent markers such as OCT4 and Nanog.

Naive Adult Stem Cells Isolation von primären humanen Fibroblasten Kulturen

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Isolierung von Primär Myofibroblasten aus Maus und Mensch Colon Tissue

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

Herstellung von primären Myogenic Vorläuferzelle / Myoblastenkulturen von Basal Wirbelstammbaum

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid oxidation, or alternatively, synthesize new lipid via de novo lipogenesis. The net sum of these pathways is dictated by a number of factors, which in certain disease states leads to fatty liver disease. Excess hepatic lipid accumulation is associated with whole body insulin resistance and coronary heart disease. Tools to study lipid metabolism in hepatocytes are useful to understand the role of hepatic lipid metabolism in certain metabolic disorders.
In the liver, hepatocytes regulate the breakdown and synthesis of fatty acids via &#946;-fatty oxidation and de novo lipogenesis, respectively. Quantifying metabolism in these pathways provides insight into hepatic lipid handling. Unlike in vitro quantification, using primary hepatocytes, making measurements in vivo is technically challenging and resource intensive. Hence, quantifying &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis in cultured mouse hepatocytes provides a straight forward method to assess hepatocyte lipid handling. 
Here we describe a method for the isolation of primary mouse hepatocytes, and we demonstrate quantification of &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled substrates.

De novo lipogenesis and &#946;-fatty acid oxidation constitute key metabolic pathways in hepatocyte, pathways that are perturbed in several metabolic disorders, including fatty liver disease. Here we demonstrate isolation of mouse primary hepatocytes and describe quantification of &#946;-fatty acid oxidation and lipogenesis.