Diese Methoden können helfen, die wichtigsten Fragen im Bereich der Biomaterialien zu beantworten. Speziell für die Knochenregeneration. Sie werden verwendet, um die Wirksamkeit von Biomaterialien und potenziellen Immunantworten zu bewerten.
Der Hauptvorteil dieser multidisziplinären Plattform besteht darin, dass sie eine Reihe von Parametern für die Vorhersage der Biokompatibilität von Biomaterialien bietet, die für die Knochenreparatur verwendet werden. Die Auswirkungen dieser In-vitro- und In-vivo-Knochentechniken erstrecken sich auf andere Knochenerkrankungen. Aufgrund der Notwendigkeit eines präklinischen Screenings neuartiger orthopädischer Biomaterialien.
Die dermatologische Methodik kann Einblicke in Biomaterialien für die Knochenheilung liefern, sie kann auch auf Biomaterialbewertungen für jede andere klinische Indikation angewendet werden. Aspirieren Kulturmedium aus primären Osteoblasten 14 Tage nach Zugabe von osteogenemineralischem Mineralisierungsmedium. Zweimal mit 0,5 Millilitern 1X PBS abspülen.
Beheben Sie dann die Zellen, indem Sie 0,5 Milliliter 10% gepufferte Formalinlösung hinzufügen und bei Raumtemperatur 10 Minuten inkubieren. Nach 10 Minuten das 10%gepufferte Formalin mit einer Einwegpipette ansaugen und zweimal mit 0,5 MilliliterRürwasser waschen. Dann fügen Sie 250 Mikroliter von 40 Millimolar Alizarin Red S Färbung Lösung zu den festen Osteoblasten.
Und bebrüten die Platte bei Raumtemperatur für 10 Minuten auf einem Shaker bei 100 Shakes pro Minute. Nach der Inkubation mit Färbelösung die Färbelösung mit einer Einwegpipette ansaugen und mit einem Milliliter Reinstwasser abspülen. Wiederholen Sie diesen Schritt fünf- bis zehnmal, bis die Spüllösung klar ausfällt, um unspezifische Färbungen zu entfernen.
Nach dem Ansaat der letzten Wäsche, fügen Sie einen Milliliter kalte PBS. Und die Platte bei Raumtemperatur 10 Minuten lang auf einem Shaker bebrüten. Als nächstes übertragen Sie die gefärbten Beta-Tricalciumphosphat-Scheiben in einen neuen Brunnen und scannen die Platten mit einem Flachbettscanner, um die Mineralisierung aufzuzeichnen.
Nach der Bildaufnahme 250 Mikroliter 10%cetylpyridiniumchloridlösung hinzufügen und 15 Minuten schütteln, um den Alizarin Red S Farbstoff zu extrahieren. Als nächstes übertragen Sie die Lösung von den Brunnen auf einzelne 1,5 Milliliter Rohre und Zentrifuge bei 17.000 x g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Den Extrakt mit 10%cetylpyridiniumchloridlösung bei einer Verdünnungsration von 1:10 bis 1:20 in einem 1,5 Milliliter-Rohr verdünnen.
Dann 300 Mikroliter jeder verdünnten Probe in die Brunnen der 96-Well-Platte geben. Fügen Sie zwei leere Brunnen mit nur 10% Cetylpyridiniumchlorid ein. Als nächstes bereiten Sie sieben Alizarin Red S Referenzstandards vor, die von 4 400 Mikromolaren reichen, indem Sie 40 Milliomolar Alizarin Red S Färbelösung mit 10%cetylpyridiniumchloridlösung verdünnen, um eine Standardkurve zu erzeugen.
Laden Sie 300 Mikroliter jedes Standards in die Platte. Lesen Sie schließlich die Absorptionsstoffe der Proben, Rohlinge und Referenzstandards bei 520 Nanometern. Isolieren Sie Knochenmark-Osteoplast-Vorstufen von den Oberschenkelknochen und Tibiae einer eingeschläferten Maus, indem Sie eine sterile Schere verwenden, um die Beine aus dem Körper am Hüftgelenk zu entfernen.
Schneiden Sie die Gliedmaßen an den Knie- und Sprunggelenken und entfernen Sie das Weichgewebe mit sterilem Skalpell und Zangen. Schneiden Sie die Epiphysen ab. Legen Sie eine 27-Meter-Nadel, die an einer Spritze befestigt ist, die mit einem Milliliter Knochenwachstumsmedium gefüllt ist, in das Lumen ein und spülen Sie das Mark in eine sechs Zentimeter sterile Petrischale.
Nachdem Sie dies für alle Oberschenkelknochen und Tibiae wiederholt haben, übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50 Milliliter konisches Rohr. Waschen Sie die sechs Zentimeter lange Petrischale mit fünf Milliliterknochen-Wachstumsmedium und übertragen Sie sie in das gleiche 50 Milliliter konische Rohr. Zentrifuge bei 350 x g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten.
Nach der Zentrifugation setzen die Zellen in einem Milliliter pro Brunnen des Osteoklastendifferenzierungsmediums wieder aus. Eine BALB/c-Maus liefert eine ausreichende Anzahl von Osteoklast-Vorstufen für eine 24-Well-Kulturplatte. Fügen Sie primäre Osteoblasten, die im Knochenwachstumsmedium suspendiert sind, auf das Biomaterial und die Kontrollen mit 8,8 * 10 x 4 Zellen pro Quadratzentimeter zu.
Beta-Tricalciumphosphat-Scheiben, kontrollierte Rinderknochen und Gewebekultur-Kunststoff werden hier verwendet. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius in fünf Prozent Kohlendioxid für 24 Stunden. Nach 24 Stunden fügen Sie den kultivierten primären Osteoblasten frisch isolierte Knochenmarkosteoklasten- und Osteoklastdifferenzierungsmittel hinzu und kehren für fünf Tage Kultur bei 37 Grad Celsius bei fünf Prozent Kohlendioxid in den Brutkasten zurück.
Ersetzen Sie das Medium jeden zweiten Tag durch frisch zubereitetes Osteoklastdifferenzierungsmedium. Dann Färben Osteoklasten für tartrateresistente Säurephosphatase, um differenzierung zu bewerten. Rasieren Sie die Kopfhaut einer anästhesierten acht Wochen alten BALB/c-Maus und reinigen Sie die Oberfläche mit 7,5% Povidon-Jodlösung und 70%Ethanol.
Bedecken Sie die Augen mit ophthalmologischer Salbe, um eine Trocknung während des Eingriffs zu verhindern. Sicherstellen eines angemessenen Niveaus der Anästhesie durch das Fehlen einer Reaktion auf eine Zed und Schwanz Prise. Dann nach einem Mittellinien-Sagittalschnitt entfernen Sie das Paracranium-Bindegewebe oberhalb des rechten Parietalknochens, indem Sie es mit einem Skalpell kratzen.
Verwenden Sie dann ein steriles Zahntrephin mit einem Durchmesser von vier Millimetern bei 2000 Umdrehungen pro Minute, um einen kritischen Defekt im rechten Parietalknochen zu erzeugen. Bewässern Sie die Region ständig mit steriler Herz-Skelett-Lösung, während Sie den richtigen Parietalknochen einkleben und den Ektocortext und etwas Endocortex durchschneiden. Um Schäden am Dera Mater zu vermeiden, verwenden Sie einen kleinen Periosteal-Aufzug, um den verbleibenden Endocortex zu durchbrechen.
Dann verwenden Sie Zange, um den Kalbsknochen vorsichtig zu heben und zu entfernen. Der resultierende Defekt sollte kreisförmig sein und einen Durchmesser von etwa 3,5 Millimetern aufweisen. Als nächstes füllen Sie den calvarialen Defekt mit Beta-Tricalciumphosphat-Kollagenschaum, vorgetränkt in sterilem PBS.
Um das Biomaterial an Ort und Stelle zu halten, tragen Sie 0,5 Mikroliter Gewebekleber am Ende des Defekts an zwei entgegengesetzten Stellen auf. Dann schließen Sie die Haut mit einer nicht resorbierbaren Naht. Legen Sie eine anästhesierte Maus auf den Rücken, rasieren Sie das Bauchfell und reinigen Sie die rasierte Oberfläche mit 7,5% Povidon Jodlösung und 70% Ethanol.
Nach einem acht Millimeter langen Mittellinienschnitt durch die Haut entlang der Linie a alba des Bauches, implantieren PBS getränktes Biomaterial unter die Haut. Dann die Haut mit einer nicht resorbierbaren Naht besonieren. Acht Wochen nach der Implantation, verbrauchen Sie die Implantationsstelle mit umgebendem Gewebe aus der eingeschläferten Maus.
Dieses Bild zeigt, dass das Wachstum auf Beta-Tricalciumphosphat-Scheiben, die in offenen Bars gezeigt werden, die Osteoblasten-Lebensfähigkeit im Vergleich zum Wachstum auf Gewebekulturkunststoff bei sieben und 14 Tagen Kultur nicht beeinflusst. Kultivierte Osteoblasten wurden nach 14 Tagen mit Alizarin Red S befleckt. Die Mineralisierung war bei Mineralisierungsmediumkontrollen höher als bei Osteoblasten, die allein im Medium kultiviert wurden.
Und auf Beta-Tricalciumphosphat-Scheiben in Suspensionskulturbrunnen. Wenn ein chirurgisch induzierter kalvarialer Defekt in kritischer Größe leer blieb, wurde eine dünne Schicht beobachtet, die den gesamten Defekt abdeckte, aber bei 12 Wochen nach der Operation war keine signifikante Knochenbildung vorhanden. Im Gegensatz dazu, wenn der Defekt Beta-Tricalciumphosphat-Kollagen-Schaum enthielt, überbrückten Schaumreste, die von dichtem Fasergewebe umgeben waren, einschließlich einiger Blutgefäße und entzündlicher Zellen, den Defektbereich ohne Hinweise auf Knochenbildung.
Nach der subkutanen Beta-Tricalciumphosphat-Kollagen-Kollagen-Implantation wurde eine entzündliche Reaktion mit Fremdkörperriesenzellen auf Hämatoxylin- und Eosin-gefärbten Abschnitten beobachtet, die nach acht Wochen auf Massons trichrom gefärbten Abschnitten fibroseten. Im Gegensatz dazu hatte die Implantationsstelle der Scheinkontrollen minimale Entzündungen und keine Fibrose. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, präzise und reproduzierbare Einzensierung des Calvariums zu tun, ohne das Tier zu verletzen.
Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Osteoklastdifferenzierungstests und hoher Durchsatz in peritoneale Immunmodelle vorgeformt werden, um zusätzliche Fragen wie die Reaktion von Osteoklast auf Biomaterialien und die Art der Immunantwort zu beantworten.
