Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health Grants GM 69829 unterstützt.

1. Die Messung der Agonist Konzentrations-Wirkungs-Kurven: keine konstitutive Aktivität <ol><li> Für die Abschätzung der relativen Agonist K b-Werte (RA i), ist eine Serie von mindestens zwei Agonisten Konzentrations-Wirkungs-Kurven erforderlich. Alle In-vitro-Assay für die funktionale Verhalten eines GPCR bereitgestellt gemessen werden, dass die Konzentration des Agonisten kontrolliert werden kann und einen einzigen Typ von Rezeptor vermittelt die Antwort. Geeignet zell-basierte Assays beinhalten die Messung von cAMP 4,7 und 8,9 inositolphosphate Ansammlung in einer Zelllinie, die einen rekombinanten Rezeptor. Beispiele für das gesamte Gewebe-Assays sind die Messung der Kontraktion der glatten Muskulatur 10 oder M 2 Muskarinrezeptor-und β 1-Adrenozeptor-vermittelten Veränderungen in Kontraktion der Feld-stimulierten Ratten linken Vorhof 11. </li><li> Wählen Sie eine Reihe von Agonisten zur Analyse einschließlich einer hochwirksamen Agonisten(ZB endogener Ligand). In einem gegebenen Experiment messen komplette Konzentrations-Wirkungs-Kurven für die einzelnen Agonisten. Wenn die Anzahl der Agonisten ist zu groß, um den Test in einem einzigen Experiment abgeschlossen ist, teilen die Agonisten in Untergruppen, die jeweils aus einer überschaubaren Anzahl von Agonisten für einen einzigen Experiment. Für jede Untergruppe, messen Sie die Konzentrations-Wirkungs-Kurve des hochwirksamen Agonist zusammen mit denen der anderen Agonisten in der Untergruppe (siehe Abbildung 3). Wiederholen Sie das Experiment für jede Untergruppe von 3 bis 6 mal rund, abhängig von der Variabilität der Daten. </li><li> Für jede Konzentrations-Wirkungs-Kurve, messen die Reaktion in Abwesenheit von Agonist (basal response), und in Gegenwart von steigenden Konzentrationen von Agonisten. Raum der Agonist-Konzentrationen gleichmäßig auf einer logarithmischen Skala etwa alle 0,3 bis 0,7 log 10 Einheiten, die den Bereich der Antworten und die Festlegung der maximalen Antwort (E max) (siehe Abbildung 3). Für experimEltern an Zelllinien, ist jede Messung in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. </li><li> Subtrahieren Sie die basalen Antwort von diesem in Gegenwart von jeder Konzentration des Agonisten gemessen. Die Antworten dargestellt in Abbildung 3 wurden auf diese Weise berechnet. </li></ol> 2. Eine vorläufige Analyse der Agonist Konzentrations-Wirkungs-Kurven: keine konstitutive Aktivität <ol><li> Geben Sie die Daten aus den Konzentrations-Wirkungs-Experimente (z. B. Abbildung 5) in eine Datentabelle in Prism. Alle Log-Agonist-Konzentrationen werden in der Spalte X. trat die Reaktion Messungen für den Agonist, der zu den größten E max-Wert zu haben scheint in Spalte A eingetragen sind, und diejenigen, für die anderen Agonisten sind in benachbarte Buchstaben Kolonnen eingegeben. Replicate Messungen einer Konzentrations-Wirkungs-Kurven sind in Sub-Spalten eines bestimmten Buchstaben Spalte eingetragen. </li><li> Wählen Sie das Diagramm Blatt, auf dem die Daten aufgezeichnet und analysiert die Daten durch nichtlineare Regressionsanalyse mitdie Gleichung berechtigt, log (Agonist) vs Antwort - Variable Steigung (vier Parameter). Beschränken der &quot;Bottom&quot;-Parameter auf Null, und führen Sie die Regressionsanalyse. Kopieren Sie die &quot;Top&quot; (E max) und log EC 50 Parameter in einer Excel-Tabelle für die Verwendung bei der Berechnung der anfänglichen Parameterschätzungen. Der Agonist mit dem größten E max Schätzung wird als &quot;Standard-Agonist&quot; bezeichnet, während die andere Agonisten als &quot;Test-Agonisten&quot; bezeichnet werden. </li><li> Berechnen Sie die erste Schätzung von log τK obs (LOGR1) als negative log EC 50-Wert der Standard-Agonisten (-log EC 50 &#39;). Berechnen Sie die erste Schätzung des Log-RA i-Wert von jedem Test-Agonisten (LOGRA) als log {(Top * EC 50 &#39;) / (Top&#39; * EC 50)}, in der die Parameter des Standard-Agonisten mit einem Apostroph bezeichnet werden . Berechnen Sie die Log-Affinität conKonstanten der Test-Agonisten (LOGK2 - LOGK5) als negative log der jeweiligen EC 50-Werte. </li></ol> 3. Abschätzung der Agonist RAi Werte mit nicht-lineare Regressionsanalyse: keine konstitutive Aktivität <ol><li> Geben Sie die Daten in ein Data Table in Prism, wie oben unter 2.1 beschrieben. Stellen Sie sicher, dass die Daten für die Standard-Agonisten in der Spalte A. eingetragen sind </li><li> Geben Sie eine benutzerdefinierte Gleichung, &quot;log Rai&quot;, in Prism auf mehreren Linien wie für den Fall mit insgesamt fünf Agonisten gezeigt: <ul><li> &lt;A&gt; P = LOGK1 </li><li> &lt;A&gt; Q = log r </li><li> &lt;~ A&gt; Q = log r + LOGRA </li><li> &lt;B&gt; P = LOGK2 </li><li> &lt;C&gt; P = LOGK3 </li><li> &lt;D&gt; P = LOGK4 </li><li> &lt;E&gt; P = LOGK5 </li><li> Y = Msys / (1 + {[(1 +10 ^ (X + P)) / (10 ^ (X + Q))] ^ M}) </li></ul></li><li> Geben Sie den anfänglichen Parameterschätzungen wie folgt: Geben Sie einen beliebig kleinen Wert von 0 für die Log-Affinitätskonstante (LOGK1) der Standard-Agonisten. Geben Sie die erste Schätzung desLogr und die Affinitätskonstanten (LOGK2 - LOGK5) und log RAi Werte (LOGRA) der Test-Agonisten. Weisen Sie die erste Schätzung des Wandlers Hang Faktor (M) ein Wert von 1,0. Weisen Sie die erste Schätzung für die maximale Reaktion des Systems (Msys) einen Wert entspricht dem E max der Standard-Agonisten (Top). </li><li> Wenden Sie die folgenden Parameter Einschränkungen: LOGK1 gezwungen, die Konstante, 0; LOGR1, Msys und M, gemeinsam Wert für alle Datensätze, LOGK2 - LOGK5 und LOGRA, keine Einschränkungen. </li><li> Initiate lineare Regressionsanalyse. Die Ergebnisse liefern den log K obs und log RA i-Werte der Test-Agonisten. Wenn die Standard-Agonist ist ein voller Agonist, dann die beiden log K obs und log RA i-Werte korrekt sind. Wenn die wirksamste Agonist (Standard-Agonist) ist eigentlich ein partieller Agonist, dann ist die K obs-Werte der wirksamer agonists kann nicht überschätzt werden. Dennoch ist die Schätzungen der log RA i noch in dieser Situation genau. </li><li> Wenn die Regression nicht konvergiert, kann der Experimentator möchte die theoretische Kurve von der anfänglichen Parameterschätzungen definierten Grundstück. Wenn es große Abweichungen zwischen den Datenpunkten und der theoretischen Kurven sind, überprüfen Sie die Berechnung der anfänglichen Parameterschätzungen. Wenn eine oder mehrere Agonisten E max-Werte entspricht der des Standard-Agonist, kann es notwendig sein, um ihre log K einschränken obs-Werte auf 0 für die Regression auf eine Lösung konvergieren. </li></ol> 4. Die Messung der Agonist Konzentrations-Wirkungs-Kurven in Zell-basierte Assays ausstellenden konstitutiven Rezeptor-Aktivität <ol><li> Für die Abschätzung des Agonisten K b-Werte in absoluten Einheiten der M -1, zell-basierte In-vitro-Assays sind die Ausstellung konstitutiven Rezeptor-Aktivität verwendet. VerfassungTIVE-Rezeptor-Aktivität wird als die Zunahme der Reaktion oberhalb der basalen Ebene durch die Expression des Rezeptors von Interesse verursacht definiert. </li><li> Wählen Agonisten und Design des Experiments, wie oben in Abschnitt 1.2 beschrieben. </li><li> Für jede Konzentrations-Wirkungs-Kurve, messen die Reaktion in Abwesenheit von Agonist in nicht transfizierten Zellen (basal response) und in Zellen mit dem Rezeptor von Interesse (basal Antwort + konstitutive response) transfiziert. Messen Sie die Reaktion in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen der verschiedenen Agonisten wie oben in Abschnitt 1.3 beschrieben. </li><li> Berechnen konstitutiven Rezeptor-Aktivität und die Antwort auf jede Konzentration des Agonisten als die gemessene Reaktion minus der basalen Reaktion in den Zellen nicht mit dem Rezeptor transfiziert. Abbildung 6 zeigt Reaktionen auf verschiedene Agonisten auf diese Weise für einen Signalweg eine sehr geringe konstitutive Aktivität berechnet. </li></ol> 5. Vorläufige einAlysis von Agonist Konzentrations-Wirkungs-Kurven aufweisen konstitutive Aktivität <ol><li> Geben Sie die Daten (z. B. Abbildung 6) in eine Datentabelle in Prism, wie in Abschnitt 3.1 beschrieben, sondern auch geben die Antwort konstitutiven Rezeptor-Aktivität in den entsprechenden Buchstaben Spalten entspricht einer log Agonistkonzentration von -20 verursacht. Ein großer negativer Logarithmus ist die Angleichung eines Agonisten Konzentration von Null eingegeben. </li><li> Analysieren Sie die Daten wie oben in Abschnitt 2.2 beschrieben, aber mit dem &quot;Bottom&quot;-Parameter, so dass es gezwungen ist &quot;für alle Datensätze geteilt.&quot; Kopieren Sie die &quot;Top&quot; (E max), shared &quot;Bottom&quot; und log EC50-Parameter in eine Excel-Tabelle für die Verwendung bei der Berechnung der anfänglichen Parameterschätzungen. </li><li> Berechnen Sie die erste Parameterschätzungen wie folgt: Die Log-Affinitätskonstante der Standard-Agonisten (LOGK1) oder eine vollständige, Test-Agonisten müssen in separaten Experimenten bestimmt werden, wie bisher 3 </sup&gt;. Berechnen Sie die erste Schätzung der log K obs Wert jeder Teilprüfung-Agonisten (dh, nur LOGK2 in diesem Fall) als log {(Top&#39;-Top) / (EC 50 (Top&#39;-Bottom))}, in dem &quot;Bottom &quot;bezeichnet die Reaktion von konstitutiver Rezeptoraktivierung verursacht. Berechnen Sie die erste Schätzung von log K b (LOGKb) für jeden Agonisten wie log {Top / (EC 50 unten)}. Berechnen Sie die erste Schätzung von log τ sys (LOGTsys) als log {Bottom / (Top &quot;- Bottom)}. </li></ol> 6. Abschätzung der Agonist Kb Werte für Antworten ausstellenden konstitutiven Rezeptor-Aktivität mittels nichtlinearer Regressionsanalyse <ol><li> Geben Sie die Daten in ein Data Table in Prism, wie oben unter 3.1 beschrieben </li><li> Geben Sie eine benutzerdefinierte Gleichung &quot;Log Kb&quot;, in Prism auf mehreren Linien wie für den Zustand der beiden Agonisten gezeigt: <ul><li> &lt;A&gt; LOGKOBS = LOGK1 </li><li> &lt;B&gt; LOGKOBS = LOGK2 </li><li> A = (10 ^ (X + LOGKOBS)) +1 </li><li> B = 10 ^ (X + LOGTSYS + LOGKB) </li><li> C = (10 ^ (LOGTSYS)) </li><li> Y = Msys / {1 + [(A / (B + C)) ^ M]} </li></ul></li><li> Geben Sie den anfänglichen Parameterschätzungen wie folgt: Geben Sie die Affinitätskonstanten jedes Agonisten (LOGK1 - geben Sie den Wert unter Schritt 5.3 bestimmt). Geben Sie die K obs Schätzungen der einzelnen Tests Agonisten. Geben Sie den Kb Schätzungen des Agonisten. Geben Sie log τ sys (LOGTsys) zu schätzen. Weisen Sie den Schallkopf Hang Faktor (M) und die maximale Reaktion des Systems (Msys)-Werte von 1,0 und Top &#39;(E max der Standard-Agonist), bzw.. </li><li> Wenden Sie die folgenden Parameter Einschränkungen: LOGTsys, Msys und M, gemeinsam Wert für alle Datensätze, LOGK2 und LOGKb, keine Einschränkungen. </li><li> Initiate lineare Regressionsanalyse. Die Ergebnisse liefern den log K b der Standard-Agonist, der log K obs </sub&gt; und log K b-Werte der partiellen Agonisten, und die maximale Reaktion des Systems (Msys), die τ sys-Wert für den freien Rezeptor-Komplex (LOGTsys), und der Wandler Hang Faktor in der operativen Modells (M). </li><li> Wenn die Regression nicht konvergiert, befolgen Sie die oben beschriebenen Schritte unter Punkt 3.6. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 5 zeigt einige unserer bereits veröffentlichten Daten über die Muscarin-Agonisten-induzierte Hydrolyse Phosphoinositid in der chinesischen Hamsters stabil exprimieren die M 3 Muskarinrezeptor 12. Die Konzentrations-Wirkungs-Kurven der ausgewählten Muscarin-Agonisten wurden in diesem Test gemessen. Die Daten wurden analysiert, wie oben unter Abschnitt 3 beschrieben, um die K b-Wert von jeweils Agonist Schätzung, ausgedrückt im Verhältnis zu dem von Oxotremorin-M. Diese Log-RA i Schätzungen sind, Carbachol, -0,56 ± 0,063; Arecoline, -0,60 ± 0,074; Pilocarpin, -1,20 ± 0,15; und MCN-A-343, -1,92 ± 0,31. Die theoretischen Kurven stellen die kleinsten Quadrate der Regressionsgleichung, um die Daten (§ 3,2). Die entsprechenden Schätzungen der maximalen Reaktionszeit des Systems (M sys) und der Wandler Hang Faktor (M) wurden 53,9 ± 1,3 und 1,15 ± 0,09, bzw.. Der log K obs-Werte der Agonisten, ausgenommen Oxotremorin-M wurden, Carbachol, 5,19 ± 0,14; Arecolin, 5,49 ± 0,12; Pilocarpin, 5,58 ± 0,16 und McN-A-343, 5,27 ± 0,33. Abbildung 6 zeigt die Ergebnisse von Experimenten an den Muskarin-Agonist-stimulierte Phosphoinositid Hydrolyse in HEK 293-Zellen stabil exprimiert G α15 3. Transiente Expression der M 3 Muskarinrezeptor verursacht eine Erhöhung der basalen Phosphoinositid Hydrolyse, die zu einer konstitutiven Rezeptor-activ zugeschrieben wurdeITY. Die Daten wurden analysiert, um die log K b-Werte Oxotremorin-M und McN-A-343 abschätzen, wie unter Abschnitt 6 beschrieben. Diese Analyse ergab log K b-Werte von 8,30 ± 0,59 und 6,59 ± 0,77 für Oxotremorin-M und McN-A-343, bzw.. Die theoretischen Kurven stellen die kleinsten Quadrate der Regressionsgleichung, um die Daten (siehe Abschnitt 6.2). Die Schätzungen der log τ sys, sys M und M wurden -2,29 ± 0,59, 95,8 ± 2,8 und 0,72 ± 0,08, bzw.. Die Schätzung der K obs Wert von MCN-A-343 war 5,35 ± 0,46. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig1.jpg" /> Abbildung 1. Beziehung zwischen einzelnen Rezeptor-Aktivität und das durchschnittliche Niveau der Aktivierung des Rezeptors Bevölkerung. Einzel-Rezeptor-Aktivität, die theoretische Verhalten eines einzelnen Rezeptors unterzogen transitions zwischen aktiven (On) und deaktiviert (Off) Zustände in der Gegenwart eines Agonisten gezeigt. Die Affinitätskonstanten des Agonisten für die aktive und inaktive Zustände werden durch K b und K a, respectively. Einwohnerzahl Verhalten, das theoretische Verhalten von mehreren Rezeptoren unterziehen zufällige Übergänge zwischen aktiven und inaktiven Zuständen in der Gegenwart eines Agonisten gezeigt wird. Population Durchschnitt ist das durchschnittliche Niveau der Rezeptor-Aktivierung in einer Population von Rezeptoren in der Gegenwart von einer bestimmten Konzentration des Agonisten gezeigt. Die Aktivierung Ebene des Rezeptors Bevölkerung wird als Stimulus bekannt. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig2.jpg" /> Abbildung 2. Beziehung zwischen dem Rezeptor-Aktivierung Funktion und die Wirksamkeit (ε) und beobachtet Affinitätskonstante (K obs) des Agonisten. Bevölkerungsdurchschnitt, das durchschnittliche Niveau derRezeptor-Aktivierung, hervorgerufen durch steigende Konzentrationen von Agonisten gezeigt. Rezeptor-Aktivierung wird das durchschnittliche Niveau der Rezeptor-Aktivierung dargestellt Agonist des Log-Konzentration des Agonisten. Die negativen log Konzentration von Agonist für halbmaximale-Rezeptor-Aktivierung erforderlich ist gleichbedeutend mit der log beobachtet Affinitätskonstante des Agonisten (log K obs). Das Maximum der Rezeptor-Aktivierung Funktion wird als Wirkungsgrad (ε) bezeichnet. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig3.jpg" /> Abbildung 3. Beispiele für Konzentrations-Wirkungs-Kurven für die Stimulation der [3 H] inositolphosphate Ansammlung von verschiedenen Muscarin-Agonisten in der chinesischen Hamsters, die den menschlichen M 3 Muskarinrezeptor. Insgesamt neun Agonist Konzentrations-Wirkungs-Kurven wurden gemessen. Das Experiment lässt sich in zwei Teile aufgeteilt werden. Für jedes Teil, das Standard-Agonisten (oxotremorineM) wird immer zusammen mit zusätzlichen Agonisten getestet. So, zwei Experimenten der gezeigten Art in a und b sind erforderlich, um die Konzentrations-Wirkungs-Kurven von neun Agonisten zu messen, wenn nur fünf Agonisten auf einmal getestet werden kann. Die Daten werden von Ehlert et al. 12. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig4.jpg" /> Abbildung 4. Beispiele für Konzentrations-Wirkungs-Kurven für die Stimulation von [3 H] inositolphosphate Ansammlung von verschiedenen Muscarin-Agonisten in HEK 293 Zellen, die das menschliche M 2 Muskarinrezeptor und G α15. Die Expression der M 2-Rezeptor führte zu einer 30 bis 35% [3 H] inositolphosphate Antwort, die zu einer konstitutiven Rezeptor-Aktivität zugeschrieben wurde. Die Daten werden von Ehlert et al. 12. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig5.jpg" /> Abbildung 5. </strong&gt; Muscarinic Agonist-vermittelte Phosphoinositid Hydrolyse in der chinesischen Hamsters stabil exprimieren das menschliche M 3 Muskarinrezeptor. Die Konzentrations-Wirkungs-Kurven der ausgewählten Muscarin-Agonisten für die Stimulierung Phosphoinositid Hydrolyse gezeigt. Mittelwerte aus drei Experimenten ± SEM dargestellt. Die Daten werden von Ehlert et al. 12. <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/3179/3179fig6.jpg" /> Abbildung 6. Oxotremorin-M-und McN-A-343-vermittelten Phosphoinositid Hydrolyse in HEK 293 Zellen, die G α15 und die M 3 Muskarinrezeptor. Phosphoinositide Hydrolyse wird relativ zu den E max von Oxotremorin-M. In Abwesenheit von Agonisten, zugeschrieben Phosphoinositid Hydrolyse um die Expression des M 3-Rezeptor machen etwa 2% der Antwort. Die Mittel von drei Experimenten ± SEM dargestellt. Die data sind von Ehlert et al. 3.

<ol>
	<li>Stephenson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modification+of+receptor+theory.">A modification of receptor theory.</a> British Journal of Pharmacology. 11, 379-393 (1956).</li><li>Furchgott, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+b-haloalkylamines+in+the+differentiation+of+receptors+and+in+the+determination+of+dissociation+constants+of+receptor-agonist+complexes.">The use of b-haloalkylamines in the differentiation of receptors and in the determination of dissociation constants of receptor-agonist complexes.</a> Advances in Drug Research. 3, 21-55 (1966).</li><li>Ehlert, F. J., Suga, H., Griffin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+agonism+and+inverse+agonism+in+functional+assays+with+constitutive+activity:+Estimation+of+orthosteric+ligand+affinity+constants+for+active+and+inactive+receptor+states.">Analysis of agonism and inverse agonism in functional assays with constitutive activity: Estimation of orthosteric ligand affinity constants for active and inactive receptor states.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 33, 671-686 (2011).</li><li>Griffin, M. T., Figueroa, K. W., Liller, S., Ehlert, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+Agonist+Activity+at+G+Protein-Coupled+Receptors:+Analysis+of+M2+Muscarinic+Receptor+Signaling+through+Gi/o,Gs,+and+G15.">Estimation of Agonist Activity at G Protein-Coupled Receptors: Analysis of M2 Muscarinic Receptor Signaling through Gi/o,Gs, and G15.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 321, 1193-1207 (2007).</li><li>Black, J. W., Leff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operational+models+of+pharmacological+agonism.">Operational models of pharmacological agonism.</a> Proceedings of the Royal Society of LondonSeries B: Biological Sciences. 220, 141-162 (1983).</li><li>Tran, J. A., Chang, A., Matsui, M., Ehlert, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+relative+microscopic+affinity+constants+of+agonists+for+the+active+state+of+the+receptor+in+functional+studies+on+M2+and+M3+muscarinic+receptors.">Estimation of relative microscopic affinity constants of agonists for the active state of the receptor in functional studies on M2 and M3 muscarinic receptors.</a> Mol. Pharmacol. 75, 381-396 (2009).</li><li>Schultz, J., Hamprecht, B., Daly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+adenosine+3':5'-cyclic+monophosphate+in+clonal+glial+cells:+labeling+of+intracellular+adenine+nucleotides+with+radioactive+adenine.">Accumulation of adenosine 3':5'-cyclic monophosphate in clonal glial cells: labeling of intracellular adenine nucleotides with radioactive adenine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 1266-1270 (1972).</li><li>Berridge, M. J., Downes, C. P., Hanley, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lithium+amplifies+agonist-dependent+phosphatidylinositol+responses+in+brain+and+salivary+glands.">Lithium amplifies agonist-dependent phosphatidylinositol responses in brain and salivary glands.</a> Biochemical Journal. 206, 587-595 (1982).</li><li>Kendall, D. A., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Neurotransmitter Receptor Analysis. , 68-87 (1990).</li><li>Pulido-Rios, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitro+Isolated+Tissue+Functional+Muscarinic+Receptor+Assays.">Vitro Isolated Tissue Functional Muscarinic Receptor Assays.</a> Current Protocols in Pharmacology. 48, 4-15 (2010).</li><li>Kenakin, T., Enna, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Pharmacology. , (2001).</li><li>Ehlert, F. J., Griffin, M. T., Sawyer, G. W., Bailon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=simple+method+for+estimation+of+agonist+activity+at+receptor+subtypes:+comparison+of+native+and+cloned+M3+muscarinic+receptors+in+guinea+pig+ileum+and+transfected+cells.">simple method for estimation of agonist activity at receptor subtypes: comparison of native and cloned M3 muscarinic receptors in guinea pig ileum and transfected cells.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 289, 981-992 (1999).</li><li>Burstein, E. S., Spalding, T. A., Brann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacology+of+muscarinic+receptor+subtypes+constitutively+activated+by+G+proteins.">Pharmacology of muscarinic receptor subtypes constitutively activated by G proteins.</a> Mol. Pharmacol. 51, 312-319 (1997).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Da unsere Methode zur Schätzung der RA i (relative K b-Wert) erfordert nur die Messung des Agonisten Konzentrations-Wirkungs-Kurven, kann unsere Analyse auch jederzeit diese Kurven gemessen werden. Wenn der Tag zu Tag Variation in der Reaktion des experimentellen Vorbereitung (zB Zellen oder Gewebe) groß ist, kann die Antwort Messungen der einzelnen Konzentrations-Wirkungs-Kurve relativ zu den &quot;Top&quot; Schätzung der Standardabweichung Agonist...

quantifying agonist activity at g protein-coupled receptors

Wenn ein Agonist eine Bevölkerung von G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) aktiviert, löst es einen Signalweg, der in der Reaktion der Zelle oder eines Gewebes gipfelt. Dieser Prozess kann auf der Ebene eines einzelnen Rezeptors, eine Bevölkerung von Rezeptoren oder einer nachgeschalteten Reaktion analysiert werden. Hier beschreiben wir, wie die nachgeschaltete Reaktion zu analysieren, um eine Schätzung des Agonisten Affinitätskonstante für den aktiven Zustand einzelner Rezeptoren zu erhalten. Rezeptoren verhalten, als quantal Switches, die abwechselnd zwischen aktiven und inaktiven Zuständen (Abbildung 1). Der aktive Zustand interagiert mit spezifischen G-Proteine ​​oder andere Signalisierung Partnern. In Abwesenheit von Liganden, überwiegt in den inaktiven Zustand. Die Bindung von Agonisten erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass der Rezeptor wird in den aktiven Zustand wechseln, weil ihre Affinitätskonstante für den aktiven Zustand (K b) ist viel größer als bei den inaktiven Zustand (K a). Die Summe derrandom Ausgänge aller der Rezeptoren in der Bevölkerung führt zu einem konstanten Niveau von Rezeptor-Aktivierung in der Zeit. Der Kehrwert der Konzentration des Agonisten entlocken halbmaximale-Rezeptor-Aktivierung ist äquivalent zu der beobachteten Affinitätskonstante (K obs), und der Anteil der Agonist-Rezeptor-Komplexe in den aktiven Zustand wird als Wirkungsgrad (ε) (Abbildung 2) definiert. Methoden zur Analyse der nachgeschalteten Reaktionen der GPCRs sind entwickelt worden, damit die Schätzung der K obs und relative Wirksamkeit eines Agonisten 1,2. In diesem Bericht zeigen wir, wie diese Analyse zu modifizieren, um den Agonisten K b-Wert relativ zu dem eines anderen Agonisten zu schätzen. Für Tests, die konstitutive Aktivität aufweisen, zeigen wir, wie K b in absoluten Einheiten von M -1 abschätzen. Unsere Methode zur Analyse von Agonisten Konzentrations-Wirkungs-Kurven 3,4 bestehtder globalen nichtlineare Regression mit dem operativen Modell 5. Wir beschreiben ein Verfahren, mit dem Software-Anwendung, Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Die Analyse liefert eine Schätzung des Produktes der K obs und ein Parameter proportional zur Wirksamkeit (τ). Die Schätzung der τK obs eines Agonisten, durch die eines anderen geteilt wird, ist ein relatives Maß für K b (RA i) 6. Für jeden Rezeptor aufweisen konstitutiven Aktivität ist es möglich, einen Parameter proportional zur Wirksamkeit des freien Rezeptor-Komplex (τ sys) zu schätzen. In diesem Fall wird die K b-Wert eines Agonisten entspricht τK obs / τ SYS 3. Unsere Methode ist nützlich für die Bestimmung der Selektivität der Agonist für Rezeptor-Subtypen und zur Quantifizierung der Agonist-Rezeptor-Signalwege durch verschiedene G-Proteine.

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors at JoVE.com

Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

Eine Methode zur Abschätzung der Affinitätskonstante eines Agonisten für den aktiven Zustand (<em&gt; K<sub&gt; B</sub</em&gt;) Ein G-Protein-gekoppelten Rezeptor beschrieben. Die Analyse bietet absolute oder relative Maßnahmen<em&gt; K<sub&gt; B</sub</em&gt; Je nachdem, ob konstitutive Rezeptoraktivierung messbar ist. Unsere Methode bezieht sich auf verschiedene Reaktionen unterhalb von Rezeptor-Aktivierung.

Die Quantifizierung der Wirkung als Agonist am G-Protein-gekoppelte Rezeptoren

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell ...

quantifying-agonist-activity-at-g-protein-coupled-receptors

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K Aufrufe.  University of California, Irvine. Eine Methode zur Abschätzung der Affinitätskonstante eines Agonisten für den aktiven Zustand ( K B

Serie: Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and release from individual presynaptic terminals directly, we designed fluorescent false neurotransmitters as substrates for the synaptic vesicle monoamine transporter. Using these probes to image dopamine release in the striatum, we made several observations pertinent to synaptic plasticity. We found that the fraction of synaptic vesicles releasing neurotransmitter per stimulus was dependent on the stimulus frequency. A kinetically distinct "reserve" synaptic vesicle population was not observed under these experimental conditions. A frequency-dependent heterogeneity of presynaptic terminals was revealed that was dependent in part on D2 dopamine receptors, indicating a mechanism for frequency-dependent coding of presynaptic selection.

Hui Zhang and Niko G. Gubernator contributed equally to this work.

A new means to measure neurotransmission optically using fluorescent dopamine analogs.

Freisetzung von Dopamin an den einzelnen präsynaptischen visualisiert FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and ...

Forschung

Biologie

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial applications as well as increases basic fundamental biological knowledge. F&ouml;rster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) between a donor molecule in an electronically excited state and a nearby acceptor molecule has been frequently utilized for studies of protein-protein interactions in living cells. The proteins of interest are tagged with two different types of fluorescent probes and expressed in biological cells. The fluorescent probes are then excited, typically using laser light, and the spectral properties of the fluorescence emission emanating from the fluorescent probes is collected and analyzed. Information regarding the degree of the protein interactions is embedded in the spectral emission data. Typically, the cell must be scanned a number of times in order to accumulate enough spectral information to accurately quantify the extent of the protein interactions for each region of interest within the cell. However, the molecular composition of these regions may change during the course of the acquisition process, limiting the spatial determination of the quantitative values of the apparent FRET efficiencies to an average over entire cells. By means of a spectrally resolved two-photon microscope, we are able to obtain a full set of spectrally resolved images after only one complete excitation scan of the sample of interest. From this pixel-level spectral data, a map of FRET efficiencies throughout the cell is calculated. By applying a simple theory of FRET in oligomeric complexes to the experimentally obtained distribution of FRET efficiencies throughout the cell, a single spectrally resolved scan reveals stoichiometric and structural information about the oligomer complex under study. Here we describe the procedure of preparing biological cells (the yeast Saccharomyces cerevisiae) expressing membrane receptors (sterile 2 &alpha;-factor receptors) tagged with two different types of fluorescent probes. Furthermore, we illustrate critical factors involved in collecting fluorescence data using the spectrally resolved two-photon microscopy imaging system. The use of this protocol may be extended to study any type of protein which can be expressed in a living cell with a fluorescent marker attached to it.

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

By employing a spectrally resolved two-photon microscopy imaging system, pixel-level maps of F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiencies are obtained for cells expressing membrane receptors hypothesized to form homo-oligomeric complexes. From the FRET efficiency maps, we are able to estimate stoichiometric information about the oligomer complex under study.

In vivo Quantifizierung der G Protein-gekoppelten Rezeptor-Wechselwirkungen mit spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskopie

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

Imaging G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR)-vermittelten Signaltransduktion, die Steuerung der Chemotaxis Dictyostelium discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce informative probes or labels into expressed receptors that do not perturb receptor function. We used amber codon suppression technology to genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine (azF) at various targeted positions in GPCRs heterologously expressed in mammalian cells. The versatility of the azido group is illustrated here in different applications to study GPCRs in their native cellular environment or under detergent solubilized conditions. First, we demonstrate a cell-based targeted photocrosslinking technology to identify the residues in the ligand-binding pocket of GPCR where a tritium-labeled small-molecule ligand is crosslinked to a genetically-encoded azido amino acid. We then demonstrate site-specific modification of GPCRs by the bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligation reaction that targets the azido group using phosphine derivatives. We discuss a general strategy for targeted peptide-epitope tagging of expressed membrane proteins in-culture and its detection using a whole-cell-based ELISA approach. Finally, we show that azF-GPCRs can be selectively tagged with fluorescent probes. The methodologies discussed are general, in that they can in principle be applied to any amino acid position in any expressed GPCR to interrogate active signaling complexes.

We genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine at various targeted positions in GPCRs and show the versatility of the azido group in different applications. These include a targeted photocrosslinking technology to identify residues in the ligand-binding pocket of a GPCR, and site-specific bioorthogonal modification of GPCRs with a peptide-epitope tag or fluorescent probe.

Genetisch kodierte Molecular Probes, um G-Protein-gekoppelte Rezeptoren Studieren

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs). The onset of a reverse pharmacology assay is the cloning and subsequent transfection of a GPCR of interest in a cellular expression system. The heterologous expressed receptor is then challenged with a compound library of candidate ligands to identify the receptor-activating ligand(s). Receptor activation can be assessed by measuring changes in concentration of second messenger reporter molecules, like calcium or cAMP. The fluorescence-based calcium mobilization assay described here is a frequently used medium-throughput reverse pharmacology assay. The orphan GPCR is transiently expressed in human embryonic kidney 293T (HEK293T) cells and a promiscuous G&#945;16 construct is co-transfected. Following ligand binding, activation of the G&#945;16 subunit induces the release of calcium from the endoplasmic reticulum. Prior to ligand screening, the receptor-expressing cells are loaded with a fluorescent calcium indicator, Fluo-4 acetoxymethyl. The fluorescent signal of Fluo-4 is negligible in cells under resting conditions, but can be amplified more than a 100-fold upon the interaction with calcium ions that are released after receptor activation. The described technique does not require the time-consuming establishment of stably transfected cell lines in which the transfected genetic material is integrated into the host cell genome. Instead, a transient transfection, generating temporary expression of the target gene, is sufficient to perform the screening assay. The setup allows medium-throughput screening of hundreds of compounds. Co-transfection of the promiscuous G&#945;16, which couples to most GPCRs, allows the intracellular signaling pathway to be redirected towards the release of calcium, regardless of the native signaling pathway in endogenous settings. The HEK293T cells are easy to handle and have proven their efficacy throughout the years in receptor deorphanization assays. However, optimization of the assay for specific receptors may remain necessary.

The here described fluorescence-based calcium mobilization assay is a medium-throughput reverse pharmacology screening system for the identification of functionally activating ligand(s) of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs).

Charakterisierung von G-Protein gekoppelten Rezeptoren durch eine Fluoreszenz-basierte Calciummobilisierungsassay

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.

Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.

Visualisierung Clathrin-vermittelte Endozytose von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an Einzelereignis Resolution über TIRF-Mikroskopie

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

Korrelieren von Gen-spezifischen DNA-Methylierungsänderungen mit Expression und Transkriptionsaktivität Astrozytäre<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

Comparative Analysis of Human Growth Hormone in Serum Using SPRi, Nano-SPRi and ELISA Assays

Sensitive and selective methods for the detection of human growth hormone (hGH) over a wide range of concentrations (high levels of 50-100 ng ml&#8722;1 and minimum levels of 0.03 ng ml&#8722;1) in circulating blood are essential as variable levels may indicate altered physiology. For example, growth disorders occurring in childhood can be diagnosed by measuring levels of hGH in blood. Also, the misuse of recombinant hGH in sports not only poses an ethical issue it also presents serious health threats to the abuser. One popular strategy for measuring hGH misuse, relies on the detection of the ratio of 22 kDa hGH to total hGH, as non-22 kDa endogenous levels drop after exogenous recombinant hGH (rhGH) administration. Surface plasmon resonance imaging (SPRi) is an analytical tool that allows direct (label-free) monitoring and visualization of biomolecular interactions by recording changes of the refractive index adjacent to the sensor surface in real time. In contrast, the most frequently used colorimetric method, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) uses enzyme labeled detection antibodies to indirectly measure analyte concentration after the addition of a substrate that induces a color change. To increase detection sensitivity, amplified SPRi uses a sandwich assay format and near infrared quantum dots (QDs) to increase signal strength. After direct SPRi detection of recombinant rhGH in spiked human serum, the SPRi signal is amplified by the sequential injection of detection antibody coated with near-infrared QDs (Nano-SPRi). In this study, the diagnostic potential of direct and amplified SPRi was assessed for measuring rhGH spiked in human serum and compared directly with the capabilities of a commercially available ELISA kit.

The proposed work assesses the diagnostic potential of direct and amplified surface plasmon resonance imaging (SPRi) assays, particularly for the detection of recombinant human growth hormone in spiked human serum, by comparing SPRi results directly with commercially available enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit.

Vergleichende Analyse von Human Growth Hormone im Serum Mit SPRi, Nano-SPRi und ELISA-Assays

Sensitive and selective methods for the detection of human growth hormone (hGH) over a wide range of concentrations (high levels of 50-100 ng ml&#8722;1 ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Imaging G Protein-gekoppelten Rezeptor-vermittelte Chemotaxis und seine Signalereignisse in Neutrophilen-like HL60-Zellen

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.

This protocol describes confocal microscopy detection of G protein-coupled receptor (GPCR) internalization in mammalian cells. It includes the basic cell culture, transfection, and confocal microscopy procedure and provides an efficient and easily interpretable method to detect the subcellular localization and internalization of fusion-expressed GPCR.

Detektion von Liganden-aktivierte G-Protein gekoppelten Rezeptor-Internalisierung durch konfokale Mikroskopie

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...