The Satchi-Fainaro research laboratory is partially supported by The Association for International Cancer Research (AICR), German-Israel Foundation (GIF), THE ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Grant No. 1309/10), Swiss Bridge Award, and by grants from the Israeli National Nanotechnology Initiative (INNI), Focal Technology Area (FTA) program: Nanomedicine for Personalized Theranostics, and by The Leona M. and Harry B. Helmsley Nanotechnology Research Fund.

HINWEIS: Alle Tier Verfahren genehmigt und in Übereinstimmung mit den Standards von der Universität Tel Aviv Sackler School of Medicine Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) durchgeführt. 1. Anlage Nährmedienzubereitung <ol><li> Seed 2 x 10 6 U-87-MG-Zellen in einer 10 cm-Kulturplatte in einem Volumen von 8 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin / Nystatin-Lösung ergänzt. </li><li> Zellen bei 37 ° C; 5% CO 2 bis zum Erreichen vollständigen Konfluenz bei 48 Stunden. </li><li> Mit einem 10-ml-Spritze, zurückzutreten alle Medium von der Platte und durch ein 0,45 um Filter in eine 15-ml-Tube. </li><li> Ohne Waschen der Zellen Platte, 1 ml Trypsin-Lösung (0,25%) und Inkubation. </li><li> Wenn sämtliche Zellen abgelöst werden, inaktivieren Trypsin unter Verwendung von mindestens 5 ml DMEM mit 10% FBS und die Vorform eine Zellzahl. </li><li<html> &gt; Die Anzahl der Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers oder anderen zell Zähleinrichtung und berechnet die Anzahl der Zellen nach dem Zählverfahren verwendet. HINWEIS: Es wird später um CM Konzentration zu normalisieren werden. </li><li> Übertragen der CM in einen Glasrundkolben und konzentriere unter Hochvakuumrotationsverdampfer. Um den Prozess zu beschleunigen, erhöhen die Badtemperatur auf 37 ° C, falls gewünscht. Fortfahren, bis der CM erreicht eine pastöse Textur. </li><li> Resuspendieren CM von jedem Kulturplatte in 400 ul Kochsalzlösung. Bei der Verwendung von mehr als einer Platte verwenden äquivalentes Volumen. Beispielsweise wird für 2 Kulturplatten, verwenden 800 &amp; mgr; l. Verwenden Sie jede Platte für 4 Mäusen. </li><li> Um verschiedene Zelllinien oder Behandlungen zu vergleichen, nach dem Zellen-Verhältnis in Schritt 1.6 empfangen Einstellen der Lautstärke. Zum Beispiel, wenn eine Platte enthält 1.5x mehr Zellen, fügen Sie 200 ul Kochsalzlösung zu den bereits bestehenden 400 ul. Dies wird die angepasst cm </li></ol>title &quot;&gt; 2. ECM-Mimik Gel Stecker Inokulation in Mäuse <ol><li> Vor der Inokulation des ECM-Mimik Gel in Mäuse, bereiten Sie die folgenden Materialien: <ol><li> Wachstumsfaktoren reduziert phenolfrei ECM-Mimik-Gel (tauen über Nacht, einen Tag vor dem Experiment, bei 4 ° C auf Eis). </li><li> Elektrorasierer. </li><li> Ketamin und Xylazin, um die Mäuse zu betäuben. </li><li> Eiskalte 1000 ul sterilen Spitzen. </li><li> Eiskalte 1-ml-Spritze und 27 G Nadeln. </li></ol></li><li> Bereiten Sie für jede Maus ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit 80 ul eingestellt CM und auf Eis halten. </li><li> Zu jedem Röhrchen, fügen Sie 600 ul eiskaltem Wachstumsfaktoren reduziert phenolfrei ECM-Mimik Gel, das über Nacht bei 4 ° C auf Eis aufgetaut wurde. Das ECM-Mimik-Gel ist in 4 ° C flüssig und verfestigt sich bei Körpertemperatur; um die ECM-Mimik Gel erstarrt zu vermeiden, verwenden eiskalten 1000 ul Tipps. Rohre Vorsichtig mischen, ohne Bildung von Blasen und auf Eis halten. </li><li> Anesthetize 6 Wochen alten BALB / c-Mäuse mit Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (12 mg / kg). Überprüfen Sie die Narkose nach der institutionellen Pflege der Tiere und die Verwendung Ausschuss, dh vor dem Beginn des Experiments. Tiere haben ihren richtigen Ebene der Narkose erreicht, wenn sie nicht mehr zu einer festen Zehen Prise reagieren. </li><li> Rasieren Sie die Bauchraum der Mäuse und desinfizieren mit einem chirurgischen Scheuer / Alkohol. </li><li> Verwenden eines kalten 1 ml Spritze und einer 27 G-Nadel, um den Inhalt des Eppendorfgefäß subkutan zu injizieren. Führen Sie die Injektion sehr langsam, um eine Blasenbildung zu verhindern. Sobald alle Volumen verabreicht wird, nicht die Nadel für einige Minuten auszuwerfen, bis zur Verfestigung auftritt. </li></ol> 3. Bewertung der ECM-Mimik Gel Stecker Vaskularisierung mittels Ultraschall HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls ist, Vorkenntnisse zum Betrieb eines Ultraschall-Bildgebungssystem, oder die Unterstützung durch einen autorisierten Techniker. <ol><li> Bevor Sie beginnen, die fach Materialien und Instrumente bereit: <ol><li> Elektrorasierer. </li><li> Enthaarungscreme. </li><li> Ketamin und Xylazin, um die Mäuse zu betäuben. </li><li> Nicht gezielte Mikroblasen. </li><li> Aktivierungsvorrichtung. </li><li> US-Bildgebungssystem mit einem 55 MHz-708 Sonde und einer 3D-Erfassungsmikromanipulator. </li></ol></li><li> Messen Sie Vaskularisierung in den Steckern 3 Wochen nach der Inokulation: HINWEIS: In der U-87 MG-basierten Tiermodell, wurde 3 Wochen gefunden, dass die ideale Zeitpunkt zur Bildgebung dar. Unter verschiedenen Einstellungen, Kalibrierung Gefäß Kinetik ab ein paar Tage nach der Inokulation von Steckern. <ol><li> Anesthetize Mäuse mit Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (12 mg / kg). Überprüfen Sie die Narkose nach der institutionellen Pflege der Tiere und die Verwendung Ausschuss, dh vor dem Beginn des Experiments. Tiere haben ihren richtigen Ebene der Narkose erreicht, wenn sie nicht mehr zu einer festen Zehen Prise reagieren. </li><li> Rasieren Sie dieBauchraum der Mäuse und Behandlung mit Enthaarungscreme. </li><li> Fixieren die Mäuse supinely auf der Bühne des Mikromanipulators. </li><li> Mit einer 1 ml Spritze mit Kochsalzlösung und eine 30-G-Nadel, legen Sie die Nadel in die Schwanzvene, fixieren Sie die Nadel fest und lösen Sie die Spritze. </li><li> Für den Kontrast 3D-Modus Bildaufnahme Sitzung festgelegt: <ol><li> Drücken Sie auf &quot;3D&quot;, um die 3D-Motorphase zu initialisieren und legen Sie die Wandler in der Mitte des gewünschten Scanbereichs. </li><li> Drücken Sie &quot;3D&quot; und geben Sie den Scan-Entfernung und Schrittgröße, und drücken Sie &quot;Scan&quot;. </li><li> Stellen Sie sicher, dass der gesamte Stecker wurde in den angezeigten 3D-Bilddaten gescannt. Wenn nicht, stellen Sie den Schwinger so dass der gesamte Stecker in der Scan-und wiederholen Sie Schritt 3.5.2 zu sehen ist. </li><li> Drücken Sie &quot;Kontrast&quot;, und drücken Sie die Zeitverstärkungsausgleich (TGC) steuert nach links, um das Bild dunkler zu machen. </li></ol></li><li> Aktivieren Sie die Mikrobläschen mit einem Fläschchen Mixer, desi istFür die Aktivierung von Mikroblasen für 45 sec finierten. </li><li> Mischen Sie in einer 1 ml Spritze 50 ul von Mikrobläschen mit 50 ul Kochsalzlösung. </li><li> Ersetzen Sie die Kochsalzlösung, die gelöste Spritze mit einer Spritze mit aktivierten Mikroblasen. Injizieren Sie den verdünnten Mikrobläschen in die Schwanzvene der Mäuse, warten Sie einige Sekunden, bis die Luftblasen, um einen stabilen Zustand zu erreichen, und dann erwerben 3D kontrastverstärkten Kinoschleife des Steckers, mit dem 3D-Akquisition Motor: <ol><li> Drücken Sie &quot;3D&quot; und wählen Sie &quot;Scan&quot;, um 3D-kontrastverstärkten Bilder erwerben und drücken Sie die &quot;Cine Store&quot;, um die Bilddaten zu speichern. </li><li> Drücken Sie &quot;3D&quot; und klicken Sie auf &quot;Destroy 3D&quot;, um die Mikrobläschen zerstören. </li><li> Drücken Sie &quot;3D&quot; erneut und wählen Sie &quot;Scan&quot;, um ein post-Zerstörung Kinoschleife zu erwerben, und drücken Sie &quot;Cine Store&quot;. </li></ol></li><li> Generieren Sie das Overlay-Bild-Frames vor und nach der Zerstörung der Mikrobläschen: <ol><li> In der &amp;# 8220; Referenz-Einstellungen &quot;auf der linken Seite des Bildschirms klicken Sie auf&quot; Create Reference &quot;. </li><li> Drücken Sie auf &quot;Study Management&quot;, das erworbene vorge Zerstörung Kinoschleife zu öffnen. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Process Cine&quot;, um die grüne Gegensatz Overlay zu erzeugen, klicken Sie auf &quot;Laden in 3D&quot;. </li></ol></li><li> Verwenden Sie die US-Imaging-Software, um die daraus resultierenden 3D-Bild für das Blutvolumen in den Steckern zu quantifizieren: <ol><li> Drücken Sie auf &quot;Scan / Einfrieren&quot; und drücken Sie &quot;Modus-Einstellungen&quot;. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Lautstärke&quot; und wählen Sie &quot;Parallel&quot;. </li><li> Erstellen eines 3D-Volumen des Zielgewebes durch Segmentieren einer Reihe von Konturen. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Fertig stellen&quot;, um die Segmentierung zu vervollständigen. ANMERKUNG: Das Volumen des Kontrastmittels werden auf der unteren linken Seite des Bildschirms angezeigt. </li></ol></li><li> Am Ende des Verfahrens, legen Mäuse in einem warmen, trockenen, sauberen, ruhigen Umgebung vonandere Tiere. Sorgen für Wärme mit Hilfe eines handelsüblichen chirurgischen Heizkissen oder eine Glühlampe (50-75 Watt), von Nagetieren platziert 12-14 Zentimeter entfernt. Überwachen Sie Mäusen fortlaufend, bis die Aufrechterhaltung aufrechte Körperhaltung und in der Regel zu Fuß. </li></ol></li></ol> 4. Bewertung der ECM-Mimik Gel Stecker Gefäßsystem Morphologie Mit Fibered konfokale Endomikroskopie HINWEIS: In diesem Teil des Protokolls ist unmittelbar nach US-Bildgebung durchgeführt und es Vorkenntnisse für den Betrieb des fibered konfokalen Endomikroskopie-Bildgebungssystem, oder die Hilfe von einem autorisierten Techniker erfordert. <ol><li> Bevor Sie beginnen, die folgenden Materialien und Instrumente bereit: <ol><li> Chirurgie Werkzeuge wie Zangen, Scheren und resorbierbare Nähfäden. </li><li> FITC-konjugiertes Dextran (70 kD). </li><li> Eichlösungen (drei Röhren, die jeweils Wasserstoffperoxid, Wasser oder fluoreszierende Lösung). </li><li> Das Abbildungssystem und eineSonde für Tomographie des Gefäßsystems gemäß Hersteller. </li></ol></li><li> Anesthetize Mäuse mit Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (12 mg / kg). </li><li> Verabreichen iv über die Schwanzvene 200 &amp; mgr; l von 10 mg / ml FITC-markiertes Dextran. </li><li> Desinfizieren Sie den Bauchbereich mit einem chirurgischen Scheuer / Alkohol und wenden Sie einen kleinen Schnitt in etwa 1 cm vom Stecker. </li><li> Legen Sie die Endomikroskopie Sonde auf der Oberseite des Steckers vorsichtig, während die Stecker intakt. </li><li> Übernahme: <ol><li> Sobald die Sonde auf dem Stecker eingestellt, drücken Sie &quot;Start Laser&quot; mit dem Fußpedal. Die Fluoreszenz sollte auf dem Bildschirm angezeigt werden. </li><li> Erwerben Kurzfilme (bis zu 30 Sekunden), indem Sie &quot;Record&quot; auf dem Bildschirm oder mit dem Fußpedal &quot;Auswählen&quot;. </li><li> Zwischen Filme, waschen Sie die Sonde, indem Sie die Spitze in ein Röhrchen mit Wasser. </li><li> Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie die Sonde und reinigen Sie die Spitze mit einem Wattestäbchen. </li></ol></li><li> Zur Analyse mittlere vessel Durchmesser: <ol><li> Klicken Sie auf das Symbol &quot;Detect Mikrogefäße&quot; in der oberen Platte, das Gefäß Detektionsmodul-Fenster zu öffnen. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Einstellungen&quot; und markieren Sie &quot;Mean Gefäßdurchmesser&quot; in der &quot;Statistik von Interesse&quot; und &quot;Anzeige Histogrammbalken&quot; im &quot;Anzeigemodus&quot;. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Erkennen&quot;, um die ausgewählten Messungen anzuzeigen. </li></ol></li><li> Um die Fluoreszenzsignalintensität in Bereichen angrenzend an Blutgefäßen zu analysieren: <ol><li> Klicken Sie auf &quot;Erstellen Kreis ROI&quot; im linken Fenster und erstellen Sie einen Kreis in den Bereich von Interesse. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Compute Histogramm innerhalb ROI&quot;, um die Werte in dieser Region bezogen zu berechnen. </li></ol></li></ol> 5. nach Eingriff Die Behandlung der Mäuse <ol><li> Am Ende eines jeden bildgebendes Verfahren, legen Mäuse in einem warmen, trockenen, sauberen, ruhigen Umgebung von anderen Tieren. Sorgen für Wärme mit einem handels einvailable chirurgische Heizkissen oder eine Glühlampe (50-75 W), platziert in 12-14 weg von Nagetieren. Überwachen Sie Mäusen fortlaufend, bis die Aufrechterhaltung aufrechte Körperhaltung und in der Regel zu Fuß. </li><li> Zur weiteren Analyse der Stecker &quot;Vaskularisierung bei zusätzlichen Zeitpunkten gelten die folgenden Wiederherstellungsbedingungen: <ol><li> Naht der kleinen Schnitt mit resorbierbaren Fäden. </li><li> Geben Mäusen Analgesie wie Buprenorphin (1 mg / kg) subkutan, und zum Einzelkäfigen. </li><li> Beachten Sie alle Tiere, um festzustellen, ob weitere analgetische Behandlung erforderlich und ist neu zu bewerten täglich zur Überwachung und Bewertung für Not. </li></ol></li><li> Am Endpunkt des Experiments euthanize Mäusen indem zuerst Isofluran, gefolgt durch zervikale Dislokation. </li><li> Wenn zusätzliche Bildgebung in den Wochen nach der Anfangsabbildungsschritte durchgeführt werden, sollten alle Verfahren möglichst steril gehalten werden. Ein chirurgisches Hautpeeling durchgeführt werden soll, steril water und sterile Wattestäbchen verwendet werden zum Reinigen der Endomikroskopie Sonde, und sollte die Sonde zwischen jedem Tier mit sterilem Wasser zu desinfizieren. </li></ol>

<ol>
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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+SIKVAV+site+of+laminin+in+promotion+of+angiogenesis+and+tumor+growth:+an+in+vivo+Matrigel+model.">Role of the SIKVAV site of laminin in promotion of angiogenesis and tumor growth: an in vivo Matrigel model.</a> J Natl Cancer Inst. 84, 1633-1638 (1992).</li><li>Passaniti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+quantitative+method+for+assessing+angiogenesis+and+antiangiogenic+agents+using+reconstituted+basement+membrane,+heparin,+and+fibroblast+growth+factor.">A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic agents using reconstituted basement membrane, heparin, and fibroblast growth factor.</a> Lab Invest. 67, 519-528 (1992).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+models+of+angiogenesis.">In vivo models of angiogenesis.</a> J Cell Mol Med. 10, 588-612 (2006).</li><li>Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+assays:+a+critical+overview.">Angiogenesis assays: a critical overview.</a> Clin Chem. 49, 32-40 (2003).</li><li>Johns, A., Freay, A. 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The authors have nothing to disclose.

Die Kombination von komplementären Bildgebungsverfahren ermöglicht den Erwerb von Informationen über die verschiedenen Komponenten der Angiogenese &quot;Gefäßdichte, Funktion und Morphologie. Lade CM auf ECM-mimische Gelpfropfen erzeugt ein Tumor-Mikroumgebung, die aus anderen Zellpopulationen getrennt ist, wie Endothelzellen, die in den Stecker rekrutiert werden und extravasate. Durch Ausführen, parallel Mikrobläschen kontrastverstärkten Bildgebung und US fibered konfokalen endomicr...

Das Matrigel Stecker Angiogenese-Test wurde zuerst von Kibbey et al. 1992, wo es verwendet wurde, um die Angiogenese-Stimulation durch das Peptid SIKVAV (Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val) 1 zu bewerten. Im Gegensatz zu anderen in vivo-Angiogenese-Assays, wie die Maus korneale Angiogenese oder Hühner-Chorioallantoismembran-Assays, ist dieser Test relativ leicht, 2 um. Das injizierte ECM-mimische Gel kann Zellen pro-angiogenen oder einer anti-angiogenen Verbindungen und / oder Faktoren enthalten. Bei der Beurteilung der Aktivität eines anti-angiogenen Verbindungen, enthält der Stecker in der Regel eine Mischung aus den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) und Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) und der anti-angiogene Substanz kann direkt in den Stopfen oder systemisch 3 verabreicht werden, 4. Das ECM-Mimik Gel wird subkutan injiziert, wo es innerhalb von Minuten erstarrt. Beurteilung der Blutgefäß Rekrutierung in der resultierenden Stecker typically durch Messen der Hämoglobinspiegel innerhalb des Steckers, durch Fluoreszenzsignalmessung nach der Injektion von mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) -markiertem geführt Dextran durch Immunfärbung Histologieschnitten für Endothelzellen-spezifische Marker oder durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) 2,5, 6. Allerdings erlaubt diese Einschätzung nur Endpunktanalyse und es fehlt Informationen über die Funktionalität und die Morphologie der Blutgefäße. Zusätzlich wurden Messungen des Plasmavolumens, entweder durch Hämoglobinniveaus oder durch Verwendung von Dextran-FITC als Indikator kann irreführend sein, da Blutgehalt wird durch die Größe der Blutgefäße und der Umfang der stagnierenden Pools von Blut beeinflusst. Dies ist besonders wichtig, wenn die angeworben Gefäßsystem wird durch die erhöhte Permeabilität und Retention (EPR) Effekt 7 gekennzeichnet. Wir hier schlagen eine neue, genauere, Verfahren zur Visualisierung der eingestellten Blutgefäße durch die Kombination von zwei sich ergänzenden bildgebenden Verfahren. High auflösenden Mikrokontrastverstärkten Ultraschall (US) in Kombination mit intravital fibred-konfokale Endomikroskopie können nicht nur Informationen über Blutgefäßdichte, sondern auch auf ihre Morphologie und Funktionalität bieten. Darüber hinaus kann diese Analyse zu verschiedenen Zeitpunkten, wodurch so die Überwachung der Angiogenese-Kinetik erfolgen. US ist eine weit verbreitete Bildgebungsmodalität, die eine hohe räumliche Auflösung für Blutgefäße Bildgebung nach intravenöser (iv) Injektion von Mikrobläschen, die sich ausschließlich in dem vaskulären Kompartiment 8-11 bleiben besitzt. Die Mikrobläschen sind gasgefüllten Mikrobläschen, die eine starke echogenen Signal, wenn sie mit einem US-Puls angeregt und damit als gutes Kontrastmittel dienen. 3D-Bilder des Steckers mit dem US-Bildgebungssystem-Software folgende Mikroblasen Zerstörung erworben. Die resultierenden Bilder werden aus Bildfeldern vor und nach der Zerstörung von Mikroblasen besteht und geben den Unterschied im Videointensität in der Farbe. Diese überlagertBilder werden von der Software automatisch angezeigt. Folglich kann der Prozentsatz an funktionellen Gefäße innerhalb des Steckers zu quantifizieren. Hohe Auflösung fibered konfokalen Endomikroskopie dient als komplementäre Bildgebungsverfahren durch die Berichterstattung auf die Blutgefäße Morphologie. In diesem minimal invasiven Verfahren werden die Bilder nach intravenöser Verabreichung von FITC-konjugiertem Dextran 12 erworben. Die fluoreszierende Polymerfarbstoffe in die Blutbahn und dient als &quot;Kontrastmittel&quot; für die Blutgefäße der Morphologie und der Blutfluss bei. Da darüber hinaus die injizierte Polymer in einer Größe von 70 kDa, es kommt immer nur undichte Gefäße nach Tumorvaskulatur gefunden. Dies wird in hohem Hintergrund von der FITC-markiertem Dextran außerhalb der Blutgefäße führen. Folglich kann fibered konfokalen endomicroscopy verwendet, um typische Eigenschaften des EPR-Effekt in Tumor neovasculature- vergrßerte undicht, hoch verheddert Gefäße sichtbar zu machen, mit stumpfen Enden ist. Das Systemmodell beschrie wurdeBett im Vergleich der angiogene Potential von U-87-MG-menschlichen Glioblastom und deren ruhenden Klon 13. Gefäßbildung in den Steckern bewertet 3 Wochen veröffentlichen ECM-Mimik Gel Impfung. Es wurde gezeigt, dass die Vaskularisierung in Stecker mit CM von U-87-MG schnell wachsenden Tumor erzeugenden Zellen wurde hinsichtlich der Anzahl, Dichte und Funktionalität wesentlich erhöht, wenn sie mit der Vaskularisierung innerhalb Stecker mit CM von den ruhenden Tumorerzeugenden Zellen verglichen. Daher konnten die Autoren schließen, dass CM, isoliert aus U-87-MG schnell wachsenden Tumor erzeugenden Zellen enthält höhere pro-angiogenen Faktoren, verglichen mit dem CM von ruhenden Tumorerzeugenden Zellen. Diese Faktoren stimulieren die Bildung von funktionellen Blutgefäße durch positiv auf alle Schritte der angiogenen Kaskade (dh Proliferation, Sprießen, Migration und schließlich die Bildung von röhrenförmigen Strukturen von Endothelzellen).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="864">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Company</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Catalog number</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">Comments/Description&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Rotary Vacuum Evaporator</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Growth-factors reduced phenol-free Matrigel</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">BD Bioscience</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">FAL356231</td>
			<td style="width:251px;">Thaw overnight, at 40C on ice&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Depilatory cream&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Vevo2100 US imaging system</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">VisualSonics Inc.&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">55 MHz 708 probe</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">VisualSonics Inc.</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Vevo2100 imaging software</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">VisualSonics Inc.</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">VialMix&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">DEFINITY Imaging</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">VMIX</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">DEFINITY microbubbles</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">DEFINITY Imaging</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">DE4</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">Activate for 45 seconds using Vialmix before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">CellVizio (Fibered confocal endomicroscope)</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">ProFlex MiniO/30 probe</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">70 kD FITC-labeled Dextran</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">46945</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">ImageCell software</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Calibration Kit</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td align="left" height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td align="left">Gibco Life Tecchnologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td align="left" height="37" style="height:37px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td align="left">Biological Industries&#160;</td>
			<td align="left">04-007-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td align="left" height="39" style="height:39px;">Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution</td>
			<td align="left">Biological Industries&#160;</td>
			<td align="left">03-032-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring functionality and morphology of vasculature recruited by factors secreted by fast-growing tumor-generating cells

Die subkutane Matrigel Plug-Assay in Mäusen, ist ein Verfahren der Wahl für die in vivo-Bewertung von pro- und anti-angiogene Faktoren. Bei diesem Verfahren werden die gewünschten Faktoren Kaltflüssigkeits ECM-mimische Gel, das nach subkutaner Injektion verfestigt, um eine Umgebung imitiert die Krebs Milieu bilden eingeführt. Diese Matrix ermöglicht das Eindringen von Wirtszellen, wie beispielsweise Endothelzellen und damit die Bildung von Gefäßen. Hierbei schlagen wir eine neue modifizierte Matrigel Stecker Assay, der ausgenutzt werden kann, um die angiogene Potential von einem Pool von Faktoren, die durch die Krebszellen sezerniert zu illustrieren, im Gegensatz zu einem bestimmten Faktor (zB bFGF und VEGF) bzw. Agenten. Der Stecker enthält ECM-Mimik-Gel verwendet, um den Host (zB Maus) mit einem Pool von Faktoren, auf die CM schnell wachsender Tumor erzeugende Glioblastomzellen abgesondert einzuführen. Wir haben zuvor beschriebenen einen ausführlichen Vergleich der angiogene Potential vonU-87 MG menschlichen Glioblastom und deren ruhenden abgeleiteten Klon, in diesem Systemmodell, welches induzierte Angiogenese in der U-87-MG-Elternzellen. Das CM wird durch Filtern gesammelt Medien aus zusammenfließenden Gewebekulturplatten mit einer der beiden Zelllinie nach 48 Stunden Inkubation vorbereitet. Daher enthält sie nur Faktoren von den Zellen sezerniert wird, ohne die Zellen selbst. Beschrieben wird hier die Kombination von zwei bildgebenden Verfahren, Microbubbles kontrastverstärkte Ultraschallbilderzeugung und intravitalen fibered konfokale endomicroscopy für eine genaue Echtzeit-Charakterisierung des Ausmaßes, der Morphologie und Funktionalität der neu gebildete Blutgefäße innerhalb der Stecker.

Die Implantation ECM-Mimik Gel Stecker mit CM von schnell wachsenden angiogene Tumormittel generiereZellLinie U-87 MG, führt zu umfangreichen Angiogenese. Das Gefäßsystem kann weitgehend durch die Verwendung von zwei komplementären Bildgebungsverfahren untersucht werden. Microbubbles kontrastverstärkten Bildgebung offenbart US zügige Einstellung Funktionsblutgefäße in den Stecker durch umfangreiche Blutfluss zur Veranschaulichung im U-87 MG CM geladenen Stecker, im Gegensatz zu nicht...

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Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.).&#160;

Überwachungsfunktionen und Morphologie der Gefäßversorgung von Faktoren durch schnell wachsende Tumor erzeugende Zellen sezerniert rekrutiert

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired ...

monitoring-functionality-morphology-vasculature-recruited-factors

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K Aufrufe.  Tel Aviv University. We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.). 

Serie: Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen durch Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Forschung

Biologie

Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate that acupuncture mobilizes a limbic-paralimbic-neocortical network and its anti-correlated sensorimotor/paralimbic network at multiple levels of the brain and that the hemodynamic response is influenced by the psychophysical response.  Physiological monitoring may be performed to explore the peripheral response of the autonomic nerve function. This video describes the studies performed at LI4 (hegu), ST36 (zusanli) and LV3 (taichong), classical acupoints that are commonly used for modulatory and pain-reducing actions. Some issues that require attention in the applications of fMRI to acupuncture investigation are noted.

FMRI and physiological monitoring is used to study the effects of Acupuncture on the central and peripheral nervous systems. Acupuncture mobilizes a limbic-paralimbic-neocortical network, with great overlap with the default mode network, to modulate neurological activity, possibly related to its autonomic effect in the peripheral nervous system.

Überwachung Akupunktur Effects on Human Brain von fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Fate Mapping von humanen embryonalen Stammzellen durch Teratom Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood. The basic architecture of the liver is illustrated in figure 1 in which more than 85% of the liver mass is composed of hepatocytes and the remaining 15% of the cellular mass is composed of Kupffer cells (KCs), stellate cells (HSCs), and sinusoidal endothelial cells (SECs). SECs form the blood vessel walls within the liver and contain specialized morphology called fenestrae within in the cytoplasm. Fenestration of the cytoplasm is the appearance of holes (&tilde;100 &mu;m) within the cells so that the SECs act as a sieve in which most chylomicrons, chylomicron remnants and macromolecules, but not cells, pass through to the hepatocytes and HSCs 1 (Fig. 1). Due to the lack of a basement membrane, the gap between the SECs and hepatocytes form the Space of Disse. HSCs occupy this space and play a prominent role in regulation and response to injury, storage of retinoic acid and immunoregulation of the liver 2.
SECs are among the most endocytically active cells of the body displaying an array of scavenger receptors on their cell surface 3. These include SR-A, Stabilin-1 and Stabilin-2. Generally, small colloidal particles less than 230 nm and macromolecules in buffer phase are taken up by SECs, whereas, large particles and cellular debris is endocytosed (phagocytosed) by KCs 4. Thus, the bulk clearance of extracellular material such as the glycosaminoglycans from blood is largely dependent on the health and endocytic functions of SECs 5,6. For example, an increase in blood hyaluronan levels is indicative of liver disease ranging from mild to more severe forms 7.
With the exception of one report 8, there are no immortalized SEC cell lines in existence. Even this immortalized cell line is de-differentiated in that it does not express scavenger receptors that are present on primary SECs (our data, not shown). All cell biological studies must be performed on primary cells obtained freshly from the animal. Unfortunately, SECs dedifferentiate under standard culture conditions and must be used within 1 or 2 days upon isolation from the animal. Differentiation of SECs is marked by the expression of Stabilin-2 or HARE receptor 9 , CD31, and the presence of cytoplasmic fenestration 1. Differentiation of SECs can be extended by the addition of VEGF in culture media or by culturing cells in hepatocyte conditioned medium 10,11.
In this report, we will demonstrate the endocytic activity of SECs in the intact organ using radio-labeled heparin for hyaluronan for the SEC-specific Stabilin-2 receptor. We will then purify hepatocytes and SECs from the perfused liver to measure endocytosis.

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The study of liver sinusoidal endothelial cells (SECs) must be performed with primary cells obtained from the animal as no cell lines exist. This method relies on liver digestion and differential centrifugation for SEC purification for subsequent culturing and experimentation.

In vivo Leber Endozytose durch Reinigung von Leberzellen durch Leberperfusion Gefolgt

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling a specific biologic role as regulator, binder or catalyst. Information about tertiary contact formation is essential to understand the function of RNA molecules. Hydroxyl radicals (&bull;OH) are unique probes of the structure of nucleic acids due to their high reactivity and small size.1 When used as a footprinting probe, hydroxyl radicals map the solvent accessible surface of the phosphodiester backbone of DNA1 and RNA2 with as fine as single nucleotide resolution. Hydroxyl radical footprinting can be used to identify the nucleotides within an intermolecular contact surface, e.g. in DNA-protein1 and RNA-protein complexes. Equilibrium3 and kinetic4 transitions can be determined by conducting hydroxyl radical footprinting as a function of a solution variable or time, respectively. A key feature of footprinting is that limited exposure to the probe (e.g., 'single-hit kinetics') results in the uniform sampling of each nucleotide of the polymer.5
In this video article, we use the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme to illustrate RNA sample preparation and the determination of a Mg(II)-mediated folding isotherms. We describe the use of the well known hydroxyl radical footprinting protocol that requires H2O2 (we call this the 'peroxidative' protocol) and a valuable, but not widely known, alternative that uses naturally dissolved O2 (we call this the 'oxidative' protocol). An overview of the data reduction, transformation and analysis procedures is presented.

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by &#039;Peroxidative&#039; and &#039;Oxidative&#039; Hydroxyl Radical Footprinting

This protocol describes how to quantify the Mg(II)-dependent formation of RNA tertiary structure by two methods of hydroxyl radical footprinting.

Überwachung Equilibrium Veränderungen im RNA-Struktur von &quot;peroxidativer&quot; und &quot;Oxidativer &#39;Hydroxylradikal Footprinting

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

Überwachung Kinase und Phosphatase-Aktivitäten durch den Zellzyklus durch Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

Überwachung Plasmid-Replikation in lebenden Säugerzellen über mehrere Generationen durch Fluoreszenz-Mikroskopie

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Monitoring Intraspecies Competition in a Bacterial Cell Population by Cocultivation of Fluorescently Labelled Strains

Many microorganisms such as bacteria proliferate extremely fast and the populations may reach high cell densities. Small fractions of cells in a population always have accumulated mutations that are either detrimental or beneficial for the cell. If the fitness effect of a mutation provides the subpopulation with a strong selective growth advantage, the individuals of this subpopulation may rapidly outcompete and even completely eliminate their immediate fellows. Thus, small genetic changes and selection-driven accumulation of cells that have acquired beneficial mutations may lead to a complete shift of the genotype of a cell population. Here we present a procedure to monitor the rapid clonal expansion and elimination of beneficial and detrimental mutations, respectively, in a bacterial cell population over time by cocultivation of fluorescently labeled individuals of the Gram-positive model bacterium Bacillus subtilis. The method is easy to perform and very illustrative to display intraspecies competition among the individuals in a bacterial cell population.

Bacteria may accumulate either detrimental or beneficial mutations during their lifetime. In a population of cells individuals that have accumulated beneficial mutations may rapidly outcompete their fellows. Here we present a simple procedure to visualize intraspecies competition in a bacterial cell population over time using fluorescently labeled individuals.&#160;

Überwachung des Intraspezies-Wettbewerbs in einer bakteriellen Zellpopulation durch Kokultivierung fluoreszierender Stämme

Many microorganisms such as bacteria proliferate extremely fast and the populations may reach high cell densities. Small fractions of cells in a ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...