Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health (NIGMS-074696) zu KAM und einer American Society of Microbiology Robert D. Watkins Graduate Student Research Fellowship an JLA Wir danken auch John Glover an der Universität von Toronto für die Bereitstellung der FFL unterstützt Source-GFP-Plasmid.

1. Der Bau der Stämme, die FFL-GFP Plasmid Für diese Studie wurde Saccharomyces cerevisiae-Stamm BY4741 (MAT a, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0) zusammen mit einem Hsp104 Deletionsstamm aus der Hefe Knockout Sammlung (Open Biosystems / Thermo Scientific) verwendet. Die Streichung wurde bestätigt mit einem Hsp104-spezifischen Antikörper für Western-Blot-Analyse. FFL-GFP wurde aus p426Met25-FFL-GFP exprimiert, hergestellt aus einem LEU2-basierte Quelle Plasmid aus dem Glover Labor an der Universität von Toronto und 17 erhältlich erhalten auf Anfrage bei den Autoren. Expression der FFL-GFP-Plasmid-Fusionsprotein wird durch die MET25 Methionin-reprimierbare Promotor kontrolliert. Das Plasmid wurde in jedem Stamm unter Verwendung eines Protokolls von Gietz et angepasst umgewandelt wurde. al, 1995: <ol><li> Zentrifuge 25 ml o<html> f log-Phase-Zellen in einem 50 ml konischen Röhrchen bei 4.400 rpm für 2 min, mit 500 ul doppelt destilliertem H 2 0 (ddH 2 O) zu waschen, und entsorgen Überstand. </li><li> Die Zellen in 250 ul TE / LiAc (Tris-HCl 10 mM, pH = 7,5, 1 mM EDTA, 0,1 M Lithium-Acetat). Inkubation bei 30 ° C ohne Mischen für 20 min. </li><li> Übertragen Sie 50 ul kompetente Zellen in ein neues Röhrchen zusammen mit 5 ml (50 ug) von Träger-DNA und 5 ul (0,1-5 ug) von Plasmid-DNA. In 300 ul PEG / TE / LiAc (wie TE / LiAc plus 40% Polyethylenglykol) zu dieser Mischung und Inkubation Zellen bei 30 ° C für weitere 30 min. </li><li> 1/10 Volumen (v / v) DMSO (36 ul) zu dieser Mischung und Hitzeschock bei 42 ° C für 6 min. </li><li> Zentrifuge Mischung bei 6.000 min für 30 sec und entfernen Überstand. Die Zellen in 100 ul sterilem ddH 2 0 und Platte Zellen auf synthetischem Komplettmedium ohne Uracil (SC-URA). </li></ol> 2. Induktion von FFL-GFP nt &quot;&gt; FFL-GFP induziert wird, wenn Zellen in der log-Phase sind, so dass die Mehrheit des Proteins vor der Hitze-Schock neu durchgeführt wird, um Proteine, die terminal über die Zeit aufgrund altersbedingter zellulären Unzulänglichkeiten aggregiert vermeiden. <ol><li> Tag 1: Inkubation Zellen in 5 ml SC-URA bei 30 ° C rotierend O / N. </li><li> Tag 2: Messen OD 600 und impfen frische Kulturen in 5 ml SC-URA OD 600 ~ 0,2. </li><li> Inkubieren Kulturen mit Drehung bei 30 ° C, bis sie log-Phase OD 600 ~ 0,8-1,0 zu erreichen. </li><li> Zentrifuge Zellen in 15 ml konischen Röhrchen bei 4.400 rpm für 3 min, abgießen Überstand und Zellpellet in 500 ul ddH 2 0; Transfer-Lösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifuge bei 6.000 rpm und entsorgen Überstand. </li><li> Die Zellen in 5 ml SC-URA-MET. Die Zellen sollten inkubiert Drehen in dieses Medium für 1 h bei 30 ° C werden </li><li> Zentrifuge Zellen und das Waschen wiederholen in ddH 2 0 und entsorgen Überstand. </li><li> Resuspend Zellen in 5 ml SC-URA Medium mit 100 ug / ml Cycloheximid, um die Proteinexpression zu hemmen, und fahren Sie sofort mit Schritt 3 fort. </li></ol> 3. Enzymatische FFL-GFP Recovery-Assay Dieser Test ist ein quantitativer Ansatz, um die Konzentrationen von aktivem Enzym in einer Population zu bestimmen. <ol><li> Vorbereitung für diesen Test: <ol class="lroman"><li> Messen OD 600 für jede Probe. </li><li> Vorbereitung der notwendigen Menge an D-Luciferin brauchte auf die Anzahl der Stichproben und der gewünschten Anzahl an Wiederholungen plus ca. 1.200 ul für die Schläuche. Endkonzentration von D-Luciferin ist ~ 23 g pro 100 ul der Zellen. Zunächst wird in Wasser bei einer Konzentration der Stammlösung von 7,5 mg / ml gelöst und auf 455 pg / ml in SC vor Experiment. In Fig. 2 drei Wiederholungen für jede Probe wurden analysiert, was in insgesamt 2,4 ml D-Luciferin verwendet. </li><li> Programm-Reader für Flash lumizenz-Test (in Anlehnung an BioTek Gen5 &quot;Flash-Lumineszenz-Assay mit Injection&quot;, für andere Instrumente Herstellerangaben beachten) <ol class="lalpha"><li> Temperatur auf 30 ° C </li><li> Set Platte Leser D-Luciferin hinzufügen, schütteln und lesen Sie jede auch einzeln. </li><li> Lesen Lumineszenz (Endpunkt Lesung, 5 sec Integrationszeit, 180 Empfindlichkeit) </li><li> Für Erholung Assay zwischen jeder Ablesung Shake für 5 min, 20 min zu verzögern, und schütteln Sie zusätzlich 5 min. </li><li> Geben Sie 50 ul von D-Luciferin von einem Injektor. </li></ol></li></ol></li><li> Vorheizen-Schock Lumineszenz wird unmittelbar nach Zellen zu Medien mit Cycloheximid, die Proteinsynthese zu stoppen hinzugefügt gemessen. <ol class="lroman"><li> Übertragen Sie 100 ul der Zellen für jede Probe mit der gewünschten Anzahl an Wiederholungen in einem festen, weißen 96-Well-Platte. </li><li> Kontrollen sollten Folgendes umfassen eine leere Wasser und Zellen mit einem leeren Vektor. </li><li> Starten Sie den Schreibschutz mit dem spefikationen oben aufgeführt sind. </li></ol></li><li> Um die Einheit der FFL FFL-GFP denaturieren, bebrüten die 5 ml Kultur in einem Glas Kultur Rohr bei 42 ° C für 25 min geschüttelt. </li><li> Recovery-Assay Lumineszenz Lesungen sofort zu starten, nachdem die Zellen aus dem Inkubator, der Zeitpunkt Null ist, werden entfernt. Messen Lumineszenz gleiche wie oben für den ersten Zeitpunkt und alle 30 Minuten während 90 min beschrieben. </li><li> Normalisieren Proben zur Vorwärmung-Schock-Lumineszenz-Werte, die auf der Grundlage der OD 600 (unterteilen die Vorwärmung-Schock Werte von OD 600) wurden angepasst. </li></ol> 4. Fluoreszenzmikroskopie Dieser Assay ist eine semi-quantitative Verfahren zur Solubilisierung von Aggregaten im Laufe der Zeit in eine Population von Zellen zu bestimmen. <ol><li> Induktion ist die gleiche wie in Abschnitt 2 beschrieben, werden die Schritte 1-8 von Protokollen. </li><li> Die gleichen Zeitpunkten getroffen werden wie oben beschrieben (Abschnitt 3, Schritt 4), aber für microscopy sammeln 1 ml der Zellen bei vorzuwärmen-Schock und jeden Wiederherstellungspunkt Zeitpunkt, und Inkubation Proben Drehen bei 30 ° C in Kultur Rohr. </li><li> Visualisierung: <ol class="lroman"><li> Zentrifuge 1 ml der Zellen bei 6000 rpm für 30 sec und entfernen Überstand. </li><li> Zellpellet in 2 ul ddH 2 O. </li><li> Mix 2 ul Zellen sowie 2 ul 2% niedrig schmelzende Agarose auf dem Objektträger und fügen Sie ein Deckglas. Um eine einzelne Ebene der Zellen zu erhalten drücken Sie leicht den Finger in der Mitte des Deckglas und drehen, bis das Deckglas ist schwer zu bewegen. </li><li> Zellen visualisiert werden mit 100X Öl-Objektiv am Fluoreszenzmikroskop; verwenden DIC zu den Zellen und die FITC-Filters zu visualisieren GFP-Fluoreszenz sichtbar zu machen. </li><li> Nehmen mehrerer Bilder für jeden Stamm zu jedem Zeitpunkt zur Quantifizierung. Felder für Bilder sollte ~ 15-30 Zellen für quantitative post-experimentellen Analyse enthalten. </li><li> Um Prozentsatz der Zellen, die Aggregate zu berechnen, zählen 50-100 Zellen insgesamt und teilen die Anzahl der Zellen, die Aggregate. </li></ol></li></ol> 5. Single Cell Mikroskopie Dieses Verfahren wird verwendet, um die Solubilisierung von einzelnen Aggregaten in einer einzigen Zelle im Laufe der Zeit zu folgen. <ol><li> Induce FFL-GFP-Expression, wie in Abschnitt 2 beschrieben, werden die Schritte 1-8. </li><li> Nach Hitzeschock-, Zentrifugen-Zellen in 15 ml konischen Röhrchen bei 4.400 rpm für 2 min. </li><li> Waschen der Zellen mit 500 ul Wasser und resuspendieren in 20 ul ddH 2 O. </li><li> Für jeden Stamm Ausschneiden eines 5x5 mm Abschnitt eines SC-URA-Agar-Platte und mit der Oberfläche, die in Kontakt mit Petrischale Pipette 4 ul Zellen und Verbreitung auf Oberfläche des Agar mit Pipettenspitze. Lassen Sie stehen für ~ 1 min. </li><li> Mit einer Pinzette Agar cube Abschnitt verdeckt platzieren auf einem ~ 55 mm Glasboden Gericht Nr. 0 und leicht andrücken. </li><li> Visualisierung: <ol class="lroman"><li> Siehe i-iii in Abschn.Ionen-4. </li><li> Set-Koordinaten für 2-4 Anlaufstellen für jeden Stamm je nach Dichte der Kultur. </li><li> Schalten Sie die Kamera, um Bilder mit einer Z-Stapel mit den entsprechenden Bereich zu nehmen (- / + 15 um mit einem 0,5-1,0 um Schichtdicke) alle 5 Minuten für eine 90-Minuten-Zeitraum. </li></ol></li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

In diesem Artikel wird das Modell Protein FFL-GFP wurde verwendet, um zu zeigen, dass die Hefe disaggregase, Hsp104 zu Protein re-Solubilisierung und Reparatur trägt. Die enzymatische Assays und Mikroskopie differentiell den Status des gleichen Substrats Protein Rückfaltung Effizienz und Ausbeute zu bestimmen abgefragt. Ergebnisse der enzymatischen Assays Erholung vermuten, dass nicht nur der maximalen Erholung der hsp104D Mutantenstamm ineffizient, aber die anfängliche Größe der Entfaltung Spannung größ...

Beim Menschen neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson und Huntington-Krankheit haben Proteinfehlfaltungen und Aggregation 10 verbunden. Cells beschäftigen molekulare Chaperone, um kinetische Trapping von zellulären Proteinen in misfolded inaktiven Strukturen 6 zu verhindern. Chaperone Teilnahme in komplizierten Wechselwirkung Netzwerke innerhalb der Zelle, aber es ist nicht vollständig geklärt, wie die Summe dieser Wechselwirkungen organismal Proteostase beiträgt. Eines der wichtigsten Chaperone für die Mehrheit der cytosolischen Proteinfaltung ist die 70 kD Hitzeschockprotein (Hsp70) Familie 19. Es hat sich gezeigt, dass in der Hefe Verlust von Hsp70 verringert die Fähigkeit, entstehende heterolog exprimiert FFL zu falten und das endogene Protein, Ornithin transcarbamoylase, in vivo 18, 7 falten. Die Fähigkeit zur Analyse mit nahezu Echtzeit Auflösung Faltung erleichtern das Verständnis, wie zusätzliche zelluläre Faktoren contribute dieser Hsp70-abhängigen Prozess. Darüber hinaus Falten / Umfaltungsreaktionen möglicherweise nicht völlig abhängig von diesen Beitrag Proteine, so Assays muss empfindlich genug, um sowohl große als auch kleine Veränderungen in der Kinetik und Effizienz zu erfassen. Die Hefezelle disaggregase, Hsp104, spielt eine wichtige Rolle bei der Reparatur von aggregierten Proteinen misfolded. Obwohl Hsp104 Homologe in Pilzen und Pflanzen identifiziert worden sind, erscheint diese Familie zu sein, in Metazoen abwesend. Es wurde vorgeschlagen, dass andere Chaperone wie denen des Hsp110 Familie einige der bekannten Hsp104 Aktivitäten in Säugetieren 16 durchzuführen. Hsp104 ist ein AAA +, hexameren Protein-Komplex, dass die Funktionen in der Hefe zu renovieren Proteinaggregaten, einen Beitrag zur Rückfaltung und Reparatur 13. Hsp104, zusammen mit der Hefe Hsp70, Ssa1 und der Hefe Hsp40, Ydj1, zur Verwertung von denaturiertem FFL in Hefezellen 5, 8 erforderlich. Die kleinen Hitzeschock-Protein, Hsp26, hat auch gezeigt, dass requi seinrot für Hsp104-vermittelte Aufschlüsselung der FFL 2. FFL ist ein Zwei-Domänen-Protein, das das Substrat Luciferin in der aktiven Stelle und infolge einer Konformationsänderung, ATP und Sauerstoff decarboxyliert erfordert bindet das Substrat und setzt Oxiluciferin, Kohlendioxid (CO 2), Adenosinmonophosphat (AMP), und Licht 11, 9, 3. Die im Handel erhältlichen FFL Substrat, D-Luciferin, Ergebnisse in Lichtemission zwischen 550-570 nm, die unter Verwendung eines Luminometer 15 werden kann. FFL ist außerordentlich empfindlich auf Denaturierung von chemischen oder Wärmebehandlungen und Aggregate schnell beim Entfalten. Bei Temperaturen zwischen 39-45 ° C ausgesetzt FFL reversibel entfaltet und inaktivierten 12. Im Gegensatz dazu sind GFP und seinen Derivaten sehr widerstandsfähig gegen Proteinentfaltung Spannungen 14. Daher Fusion dieser beiden Proteine ​​erlaubt FFL als experimentell labilen Rest, der Targeting-funktionelle Funktion gFP um intrazelluläre Ablagerungen, die visualisiert werden kann mittels Fluoreszenzmikroskopie in der Bevölkerung und der einzelnen Zelle Ebenen. Verwendung des enzymatischen Assay in einer halbautomatischen Multimode-Reader mit automatisierten Mikroskopie gekoppelt ermöglicht ungeahnte gleichzeitige Beurteilung der Kinetik und Ausbeute Umfaltungsreaktionen. Darüber hinaus ermöglicht die einfache Molekulargenetik des Modells Eukaryoten Saccharomyces cerevisiae sowohl präzise Manipulation des Proteins Qualitätskontrolle Netzwerk und die Möglichkeit für die Entdeckung Ansätze für neue Spieler einen Beitrag zur zellulären Stressantwort und Proteostase identifizieren. In dieser Studie sind Wildtyp (WT) und Hsp104 Deletionsstämme Ausdruck FFL-GFP unterliegen Proteindenaturierungsmittel Hitzeschock. FFL-GFP Rückfaltung durch sowohl einen enzymatischen Test und Mikroskopie als Proxy Auslesen zur Reparatur des exprimierten Proteom in einer Erholzeit Verlauf überwacht. Wenn zu WT-Zellen im Vergleich zeigen wir the Hsp104 Deletionsstamm ist ~ 60% weniger effizient Rückfaltung FFL-GFP, die Unterstützung bisherigen Erkenntnisse über eine Rolle in Hsp104 Reaktivierung denaturierter FFL 2.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Synergy MX Microplate Reader</td>
 <td>BioTek</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope</td>
 <td>Olympus, Tokyo Japan</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lumitrac 200 white 96-well plates</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SlideBook 5.0 digital microscopy software</td>
 <td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP152-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(LiAc) Lithium Acetate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L6883</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PEG (polyethelene glycol)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP233-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP120-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO</td>
 <td>Malinckrodt</td>
 <td>4948</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SC</td>
 <td>Sunrise</td>
 <td>1300-030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SC-URA</td>
 <td>Sunrise</td>
 <td>1306-030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>cycloheximide</td>
 <td>Acros Organics</td>
 <td>357420050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-luciferin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L9504</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>low melt agarose</td>
 <td>NuSieve</td>
 <td>50082</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>immersion oil</td>
 <td>Cargille</td>
 <td>16484</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

coupled assays for monitoring protein refolding in saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, da die kombinierten Prozesse der Proteinfaltung / Biogenese definiert ist Rückfaltung / Reparatur und Abbau, ein empfindliches Gleichgewicht, das zelluläre gehalten, um zu vermeiden schädliche Folgen 1 werden muss. Externe oder interne Faktoren, die dieses Gleichgewicht stören können, um Protein-Aggregation, Toxizität und Zelltod führen. Beim Menschen ist ein wichtiger Faktor, um die Symptome, die mit neurodegenerativen Erkrankungen wie Chorea Huntington, Parkinson-und Alzheimer-Krankheiten 10 verbunden. Es ist daher wichtig, dass die Proteine ​​in der Instandhaltung von Proteostase beteiligt identifiziert werden, um Behandlungen für diese schwächenden Krankheiten zu entwickeln. Dieser Artikel beschreibt Techniken zur Überwachung in vivo Proteinfaltung in Quasi-Echtzeit Auflösung mit dem Modell Protein Glühwürmchenluciferase fusioniert mit grün fluoreszierende Protein (GFP-FFL). FFL-GFP ist ein einzigartiges Modell chimären Proteins als die FFL-Einheit ist extrem empfindlich auf Stress-induzierten misfolding und Aggregation, die das Enzym inaktiviert 12. Die Luciferase-Aktivität überwacht wird unter Verwendung eines enzymatischen Assay, und das GFP-Einheit stellt ein Verfahren zur Visualisierung von löslichen oder aggregierten FFL mit automatisierten Mikroskopie. Diese Methoden gekoppelt sind mit zwei parallel und technisch unabhängige Ansätze, sowohl Rückfaltung und funktionellen Reaktivierung eines Enzyms nach Stress zu analysieren. Aktivität Erholung können direkt mit Kinetik der Disaggregation und Re-Solubilisierung korreliert werden, um besser zu verstehen, wie Protein-Qualitätskontrolle Faktoren wie Protein Chaperone um diese Funktionen auszuführen zusammenarbeiten. Darüber hinaus können Deletionen oder Mutationen zur Beiträge von spezifischen Proteinen oder Protein-Untereinheiten diesem Verfahren getestet werden. In diesem Artikel untersuchen wir die Beiträge des Proteins disaggregase Hsp104 13, bekannt, eine Partnerschaft mit der Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) Rückfaltung System 5, zu Proteinrückfaltung, diesen Ansatz zu validieren.

Hefe ist abhängig von der disaggregase an Hsp104 effizient falten hitzedenaturierten Proteine. Die Aktivität der FFL-GFP wurde nach einer 25 min Hitzeschock überwacht, mit einem Lumineszenz-Assay Flash Abbildung 1. Die Ergebnisse dieser automatisierten Assays in 2 gezeigt ergab eine schrittweise Erhöhung der Aktivität über 90 min, die letztlich zu einer&gt; 80% Ausbeute in WT-Zellen führte. Die hsp104Δ Stamm gewonnen 19% der ursprünglichen Aktivität gegenüber dem gle...

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Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Dieser Artikel beschreibt die Verwendung eines Leuchtkäfer-Luciferase-GFP-Fusionsprotein zu untersuchen,<em&gt; In vivo</em&gt; Proteinfaltung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Mit diesem Reagenz Rückfaltung eines Modells Hitze-denaturiertes Protein gleichzeitig durch Fluoreszenzmikroskopie und einem enzymatischen Assay, um die Rollen von Proteostase Netzkomponenten Proteinqualitätskontrolle Sonde überwacht werden.

Gekoppelt Assays zur Überwachung Proteinrückfaltung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

coupled-assays-for-monitoring-protein-refolding-saccharomyces

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Biology

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

10.2K Aufrufe.  University of Texas Medical School. Dieser Artikel beschreibt die Verwendung eines Leuchtkäfer-Luciferase-GFP-Fusionsprotein zu untersuchen, In vivo Proteinfaltung in Saccharomyces cerevisiae. Mit diesem Reagenz Rückfaltung eines Modells Hitze-denaturiertes Protein gleichzeitig durch Fluoreszenzmikroskopie und einem enzymatischen Assay, um die Rollen von Proteostase Netzkomponenten Proteinqualitätskontrolle Sonde überwacht werden.

Serie: Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Präparation Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Forschung

Biologie

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray-Analyse für Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Eine Fluoreszenz-Mikroskopie Assay zur Überwachung Mitophagy in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expression und Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulatorprotein in Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Die Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembran Regulator-Protein in Ausgedrückt<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Schnelle Identifikation von chemischen Genetische Interaktionen in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Growth-basierte Bestimmung und biochemische Bestätigung der genetischen Voraussetzungen für Proteinabbau in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Entwicklung Methode Regie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Bibliothek Schöpfung und Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

Gekoppelt Assays zur Überwachung Proteinrückfaltung in

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Präparation Saccharomyces cerevisiae Asci

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Microarray-Analyse für Saccharomyces cerevisiae

Eine Fluoreszenz-Mikroskopie Assay zur Überwachung Mitophagy in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Expression und Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulatorprotein in Saccharomyces cerevisiae

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz

Die Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembran Regulator-Protein in Ausgedrückt

Schnelle Identifikation von chemischen Genetische Interaktionen in

Growth-basierte Bestimmung und biochemische Bestätigung der genetischen Voraussetzungen für Proteinabbau in

Entwicklung Methode Regie in