Ein. Hefe Vorbereitungen <ol><li> Transformieren Hefestämme mit einem Plasmid, welches ein GAL1-GFP-Y68L (Ubc9 ts) Kassette. </li><li> Wachsen Hefe in synthetischen Medien mit 2% Raffinose für 24 Stunden und zurück zu 2% Galactose enthaltenden Medien verdünnt für 16 h oder O / N. Inkubieren Zellen bei 30 ° C unter Schütteln bei 200 UpM. </li><li> Am folgenden Morgen, verdünnen die Abfrage Stamm OD 600 = 0,2. Schütteln für 4-6 Stunden bei 30 ° C (200 rpm), bis die Kultur erreicht OD 600 = 0,8-1,0. </li><li> Ausdruck (so daß nur die bereits übersetzten und gefaltet Pool von GFP-Ubc9 ts zu überwachen), Veränderung Medien synthetischen Medien mit 2% Glucose (SD) 30 min vor der Bebilderung ergänzt unterdrücken. </li><li> Treatment - Hitzeschock die Zellen für 20 min bei 37 ° C bis Fehlfaltung zu induzieren, oder kontinuierlich im Mikroskop Inkubator Proteinaggregation bei Hitze-Schock-Bedingungen folgen. Hinweis - Wenn Sie mit dem Mikroskop bei einer Temperatur oberhalb RT, Vorheizen for etwa 2 Stunden, um die Temperatur entlang dem Körper des Mikroskops und den Zielen (siehe unten) äquilibrieren. </li></ol> 2. Platte \ Slide Vorbereitungen <ol><li> Wählen Sie das entsprechende Platte. Das wichtigste Kriterium ist die Fähigkeit, während der Bildgebung Fokus Akquisition aufrechtzuerhalten. Die folgenden Punkte sind entscheidend für die 4D-Bildgebung und nicht für 2D-Zeitraffer-oder 3D-Bildgebung. <ol><li> Mehreren Mulden-Platte der Boden der verschiedenen Vertiefungen eventuell nicht homogen (dh die Bohrungen werden in unterschiedlichen Höhen relativ zu dem Ziel sein). Dadurch wird es schwierig, den Fokus quer xy Punkten und Zeitpunkten zu erhalten, unabhängig von der Autofokus-Technik verwendet wird. </li><li> Slide Material: Glas vs Kunststoff. Glasboden Dias sind z-homogene zwischen Brunnen, sind aber teurer. </li><li> Dicke der Platte ist unten: Wir verwenden normalerweise Deckglas-Bodenplatten-Index 1,5, aber Index 1 ist auch akzeptabel je nach Zielsetzung. </li></ol></li><li> Cover Unterseite der Platte \ Schieber mit ConA (0,25 mg / ml) für 10 min. ConA wird verwendet, um Zellen zu der Folie, die nach einer einzelnen Zelle über die Zeit ermöglicht haften. </li><li> Entfernen ConA und inkubieren Sie die Folie in einer chemischen Haube, so dass überschüssiges ConA verdampft. </li><li> Platte 200 ul Hefeprobe (OD 600 = 0,5) in die ConAed gut. </li><li> Inkubation: 15 min, zu ermöglichen Zellen an der Oberfläche der Platte haften. </li><li> Entpacken Sie das Medium, und dreimal mit neuem Medium, um eine Schicht von Zellen zu erhalten. Hinweis: wenn eine lange Zeitspanne ist geplant, Saatgut die Zellen dünn, so dass neue Knospen nicht zu füllen und unterbrechen die Region von Interesse. </li></ol> 3. Microscope Vorbereitungen <ol><li> Wir verwenden eine Nikon A1Rsi konfokalen Mikroskop mit ein paar Nicht-Standard-Modifikationen. Für Hefe Bildgebung verwenden wir bis zu 4-Laser (405 nm, 50 mW CUBE Laser; 457-514 nm, 65 mW Argonionenlaser; 561 nm, 50 mW Saphir-Laser, und 640 nm, 40 mW CUBE Laser), und bis zu 4 PMTs ausgestattet mitFilter. Meiste Bildgebung ist mit einem grünen Filtersatz für EGFP und einem roten Filtersatz für mCherry und tdTomato getan. Mit GFP und mCherry gibt es fast keine Übersprechen, daher verwenden wir oft simultane Abtastung. Allerdings kann Zeilenkamera auch zur Übersprechen zu verhindern, wenn es auftritt. Unsere konfokalen ist auch mit einem PInano Piezotisch (MCL), die 3 msec Schritten in z machen kann, wodurch 2-3 Z-Stapel (30-50 Teilen) pro Sekunde ausgestattet. Die Systeme auch eine Spektrometervorrichtung, Perfect Focus (Laser-Verschiebung) und zwei Scanner - ein Galvano-Scanner und eine Resonanzabtaster. </li><li> Wählen Sie das entsprechende Ziel. Wichtigsten Überlegungen: <ol><li> Wasser / Öl / Luft-Ziel: die wichtigste Überlegung ist der Brechungsindex des Bilderzeugungsmediums vs Medium der Probe. <ol><li> Oil objektiven Vorteile: <ol><li> Oil Ziele können eine höhere numerische Apertur (Öl bricht Licht mehr als Wasser, und somit mehr Photonen gehen Sie zurück zum Ziel). Oil Ziele können bisNA 1,49, bis 1,27 für Wasser verglichen. (Dies ist jedoch nicht wirklich ein großer Unterschied in der Auflösung). </li><li> Der Brechungsindex des Öls dem Brechungsindex von Glas, also keine Photonen sind verloren gehen aus der Probe, durch das Glas, auf das Ziel. (Anmerkung - wählte ein Immersionsöl, die einen Brechungsindex, die für Ihr Ziel und Ihre Deckglas ist, hat). </li><li> Oil ermöglicht problemlose lange Zeit hinfällig, da sie nicht verdampfen. </li></ol> Oil Ziel Nachteile: <ol><li> Die höhere Auflösung durch die höhere NA von Öl Ziele aktiviert schnell abgebaut, wenn das Licht hat, um durch einem wässrigen Medium (zB eine Zelle) reisen. </li><li> Bilder haben in der Regel mehr sphärische Aberrationen und eine Wirkung in 3D &quot;ausgestreckt&quot;. </li><li> Öl ist klebrig, chaotisch, und eine Gefahr für die Ziele. </li></ol></li><li> Wasser objektiven Vorteile <ol><li> Die Zelle selbst ist wässrig, daher gibt es weniger Verzerrungen in Z, And die Auflösung hoch bleibt tief in einer wässrigen Probe. </li><li> Reinigen und benutzerfreundlich. Wasser objektive Nachteile: verdunstet schnell, daher nicht geeignet für lange Filme ohne besondere Vorkehrungen getroffen, um Wasser kontinuierlich zu pumpen, um das Ziel. </li></ol></li><li> Air objektiven Vorteile: 1. Es wird kein Material / verdampft während Mehrpunkt Erwerb oder einer langen Film verloren. 2. Reinigen und benutzerfreundlich. Nachteil: geringer Auflösung und Signal-Empfindlichkeit. </li></ol></li><li> Zimmer-und Inkubatortemperatur: ändernden Temperatur beeinflusst Materie Eigenschaften und in zarten Systemen ändert den Fokus. Die Temperatur sollte vor der Wahl Punkten für den Erwerb eingestellt werden. Änderung der Temperatur während der Akquisition unterbricht Bildgebung und führt zum Verlust des Fokus führen. Wir lassen unsere Mikroskopsystem für 2 Stunden äquilibrieren bei der gewünschten Temperatur vor der Bildgebung. </li><li> Korrektur Kragen: Viele Ziele sind mit einer Korrektur-Ring ermöglichtdas Ziel, für eine gegebene Deckglas Dicke eingestellt werden. Wir empfehlen Einstellung der Korrektur Kragen, während unter Verwendung von fluoreszierenden Kügelchen, die Point-Spread-Funktion zu visualisieren. Dadurch wird sichergestellt, richtigen Einstellungen für jede Probe. </li><li> Stabile Probenhalter: Wir finden, dass die meisten im Handel erhältlichen Probenhalter der schwächste Teil des Mikroskops sind. Sie sind oft wackelig und nicht gerade. Das ist eine Katastrophe für hochauflösende, multi-point 4D-Bildgebung. Wir entwerfen unsere eigenen Probenhalter, die gerade sind und fest sitzen auf der Bühne. Sie können auch nach unten geschraubt werden, wenn nötig. </li><li> Multi-Punkt-Akquisition: unsere Imaging-System ist mit dem Nikon &quot;Perfect Fokus&quot;-System, das ist im Grunde ein Laser-basierte Auto-Fokus-Mechanismus ausgestattet. Allerdings ist Autofokus nicht unbedingt nötig mit 4D-Bildgebung, insbesondere, wenn das System nicht driften nicht viel. </li></ol></li></ol> 4. Imaging <ol><li> Schalten Sie das System: Laser, Bühne, Steuerung, Kamera und Computerter Software. </li><li> Legen Sie die Platte auf der Bühne Halter ordnungsgemäß gesichert und stabilisiert. </li><li> Verwenden Auge Port an Ort und die Orientierung der Hefe zu bestimmen. </li><li> Mit Hellfeld, beurteilen Zelle Gesundheit und Lebensfähigkeit nach Form und Textur. </li><li> Schalten Sie epifluoreszenten Licht nach dem jeweiligen Fluorophor (z. B. FITC Filter für GFP), und konzentrieren sich auf Zellen, die den Phänotyp, die Gegenstand Ihrer Forschung. Zellen, die stark fluoreszierende sind in mehr als einer Wellenlänge kann tot sein, und daher autofluoreszierenden. Wir visualisieren den Kern mit einem tdTomato Fluorophor fusioniert mit einem SV40 NLS (NLS-TFP). TFP ist doppelt so groß wie GFP, und ist daher oberhalb der Diffusion Grenze des Kerns, also es funktioniert sehr gut als nukleares Marker. Wir können auch anregen TFP mit einem grünen (488 nm) Laser gleichzeitig als GFP, sondern sammeln die grünen und roten Emissionen in zwei separate PMTs zur spektralen Auflösung. </li><li> Passen Sie die folgenden Einstellungen, um das Rauschen zu minimierenund Übersättigung: <ol><li> Laserleistung - Bleichen und Phototoxizität vs Helligkeit des Bildes in Betracht gezogen werden. </li><li> Gain: beeinflusst die Empfindlichkeit der Kamera, damit Rauschabstand Signal. </li><li> Lochblendendurchmesser - sollte entsprechend der Laser mit der kürzeren Wellenlänge eingestellt werden. Der Durchmesser der Blende bestimmt die Dicke (Höhe) des optischen Abschnitts abgebildet. So wird das Öffnen der Lochkamera zu sammeln mehr Licht (wir mehr Photonen in), aber Auflösung in z (weniger Konfokalität) zu verringern. </li></ol></li><li> Nützliche Tipps: <ol><li> Wenn verschiedene Fluorophore kongruenten Wellenlänge emittieren, verwenden Sie die Spectral Detector-Funktion, die die Wahl des virtuellen Filter ermöglicht. Beachten Sie, dass spektrale Detektoren weniger empfindlich als normale PMTs sind. </li><li> Wenn verschiedene Fluorophore durch den gleichen Laser angeregt werden, verwenden Sie die Zeile Scan-Funktion. </li><li> A Galvano-Scanner ermöglicht mehr Sensibilität, hat aber ein höheres Risiko für Ausbleichen. A Resonant Scanner ermöglicht schneller eincquisition und senkt damit das Risiko für Ausbleichen, ist aber weniger empfindlich. </li><li> Durchschnittlich zwischen 2 und 16 Bildern, erhöht sie Signal-Rausch-Verhältnis, sondern macht Akquisition langsamer und natürlich ist mehr Belichtung der Probe zu dem Laser ist. </li><li> Dauer des Erwerbs-abhängig von der biologischen Fragestellung (zB JUNQ und IPOD-Bildung erfolgt ~ 2 h). Wir haben Hefe mit dem Resonanzabtaster für bis zu 30 h in 3D Zeitraffer abgebildet. </li><li> Zeitraffer Intervallen Kleinere Abstände wird ein kohärenter Film, aber vielleicht Photobleichung und damit Verlust des Signals führen. </li></ol></li></ol>

<ol>
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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Unsere Intuitionen über biochemische Prozesse stammen aus Tischgerät Experimente, in denen ein gut gemischte Lösung der Reaktanten und Produkte dürfen Gleichgewicht in einem Becherglas zu erreichen ist. In einem solchen Szenario kann die Konzentration einer bestimmten chemischen Spezies als eine einzelne Zahl, die das Verhältnis einer molaren Menge von Molekülen mit einem makroskopischen Volumen ausgedrückt. Vieles, was wir über Proteinstruktur und-funktion stammt von Methoden, die das klassische, bulk Reaktion Bild widerspiegeln: Western Blots, Zentrifugationen und spektrophotometrischen Messungen an Extrakten aus Homogenaten von ganzen Populationen von Zellen durchgeführt. Da die Technologie, die wir verwenden, um an Zellen unter Vergrößerung betrachten verbessert sprunghaft, wird es immer deutlicher, dass die Bedingungen, unter denen die meisten biochemischen Reaktionen in vivo nur die geringste Ähnlichkeit mit denen des klassischen Tischgerät Szenario tragen. Nicht nur ist der Innenraum des Cella dicht Umfeld verpackt, in dem Gedränge Effekte wesentlich verändern die Aktivitäten der verschiedenen Reaktanten, es ist auch genau das Gegenteil von gut gemischt. Dies erklärt die häufige Disparität zwischen in vitro und in vivo Wirkungsgrade einer Vielzahl von komplexen makromolekularen Reaktionen. Nirgendwo sind Intuitionen, die aus klassischen in vitro biochemischen Experimenten anfälliger zu täuschen wie in Fragen rund um die in vivo Faltung, Fehlfaltung und Aggregation von Proteinen. Nach den Untersuchungen der Proteinchemie in loser Schüttung Reaktionen das Problem der Falten für ein bestimmtes Protein als ein einfaches Ja oder Nein Frage behandeln kann, muss jeder Versuch, die Dynamik der gesamten Bevölkerung von Makromolekülen in einer lebenden Zelle zu verfolgen sensibel sein für die gesamte Verteilung der möglichen konformativen Ergebnisse verfügbar zu einer Polypeptidkette, insbesondere dem Risiko von Fehlfaltung und Aggregation. Zum Beispiel könnte untersuchen wir eine Bulk-Zelle lyübersättigen eines aggregierende Protein durch Western-Blotting, und bestimmen, dass das Protein überwiegend unlöslich und nicht ubiquitiniert ist. Jedoch in der lebenden Zelle eine diskrete Subpopulation des Proteins, schwer zu detektieren, wenn eine Mittelung über viele Zellen, kann löslich und ubiquitiniert in einem bestimmten Kompartiment wo die lokale Konzentration der Spezies ist extrem hoch. Das letztere Szenario kann mehr wichtige Konsequenzen für die Lebensfähigkeit der Zelle als der größere bulk Sub-Population. Weiterhin, während eine Vielzahl von Chaperone pleiotrope Verhaltensweisen und Funktionen in vitro zeigen, wird es immer deutlicher, dass in der Zelle ihre diskrete Funktionen räumlich und zeitlich begrenzt sind. In der neu entstehenden Paradigma für das Verständnis der Biochemie, wird ein variabler Konzentration Eigenschaft jedes spezifische Nano-Umgebung, in der Zelle, und die molekularen Ereignisse, die biologische Prozesse zugrundeliegen muss nicht nur in Zeit getestet werden, sondern auch in spacE. Die 4D-Bildgebung hier vorgestellte Ansatz ermöglicht sensitive Modellierung Proteinfehlfaltungen in lebenden Zellen, aber es kann verwendet werden, um eine beliebige Anzahl von anderen biologischen Prozessen zu untersuchen und wie sie im Raum reguliert, Zeit und nach Änderungen der Umgebungsbedingungen. In diesem Papier verwenden wir den Ubc9 ts Falt-Sensor, der auf wirksame Weise zeigt die Phasen und Optionen für den Umgang mit dem Beginn der Proteinaggregation im Cytosol. Zusätzlich zu Veranschaulichung der Zellbiologie der Aggregation Qualitätskontrolle kann dieser Ansatz als ein leistungsfähiges Werkzeug für die Entschlüsselung die Wirkung von bestimmten Störungen oder genetische Mutationen auf proteostasis (beispielsweise Ubc9 ts kann zur Proteinfaltung Spannung in Reaktion auf Oxidation messen dienen, die Expression eines toxischen Zuschlagstoff oder Mutationen in der Qualitätskontrolle Weg). 4D-Bildgebung ist auch für die genaue Bestimmung von Protein Lokalisation oder Kolokalisation zwischen zwei verschiedenen Protein essentiells, und zum Erkennen Phänomene, die vielleicht nur vorübergehend, aber wichtig. Zum Beispiel, insbesondere bei einem kleinen kugelförmigen Organismus, wie Hefe, kann es den Anschein hat, dass eine Struktur oder aggregierter juxtanuclear Körperregion hat, während 4D-Bildgebung kann sich herausstellen, dass dies lediglich ein Artefakt des Winkels der Inspektion. Im Beispiel experimentieren wir hier präsentieren, zeigen wir die Verwendung eines Modells fehlgefaltete Protein, Ubc9 ts, um die Aggregation Qualitätskontrolle über Zeit und Raum im Zytosol folgen. Bei der permissiven Temperatur wird Ubc9 ts gefaltet und diffundiert im Zellkern und Zytosol. Nach wärmeinduzierten Fehlfaltung, es bildet zunächst schnell diffundierenden kleinen Aggregat Stress-Foci, die für den proteasomalen Abbau verarbeitet werden. Wenn das Proteasom partiell gehemmt wird, werden diese Spannung Foci in JUNQ und IPOD Einschlüsse im Verlauf von etwa 2 Stunden umgesetzt. Wenn Ubiquitin-vermittelten Abbau ist nicht als eine Qualitätskontrolle Option Ubc9 ts wird sofort an den IPOD Einbeziehung schützende Aggregation umgeleitet. Diese Tools bieten unglaubliche Möglichkeiten, um neue genetische Faktoren in der Aggregation der Qualitätskontrolle beteiligt zu entdecken und ihre räumliche und zeitliche Regulation in der Zelle zu erforschen.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG132</td>
			<td>Mercury</td>
			<td>mbs474790</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>con A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom plates</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>ibd81158</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4D Fluorescence Imaging of Protein Aggregation 
			Confocal 3D movies were acquired using a Nikon A1R-si microscope equipped with a PInano Piezo stage (MCL), using a 60X water objective NA 1.27, 0.3 micron slices, 0.5% laser power (from 65 mW 488 laser and 50 mW 561 laser). z-stacks were acquired every 5 min for 90 min. Each z-series was acquired with 0.5 micron step size and 30 total steps. Image processing was performed using NIS-Elements software.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d imaging of protein aggregation in live cells

Eine der wichtigsten Aufgaben jeder lebenden Zelle ist die Aufrechterhaltung der korrekten Faltung von neu synthetisierten Proteinen im Angesicht des sich ständig verändernden Umweltbedingungen und einer intrazellulären Umgebung, ist dicht gepackt, klebrig und gefährlich Proteinstabilität 1. Die Fähigkeit, dynamisch auszugleichen Protein-Produktion, Falt-und Abbau verlangt hoch spezialisierten Qualitätskontrolle Maschinen, deren absolute Notwendigkeit ist am besten, wenn es Störungen beobachtet. Krankheiten wie ALS, Alzheimer, Parkinson und bestimmte Formen der Mukoviszidose haben einen direkten Link zu Proteinfaltung Qualitätskontrolle Komponenten 2, und somit zukünftige therapeutische Entwicklung erfordert ein grundlegendes Verständnis der zugrunde liegenden Prozesse. Unsere experimentelle Herausforderung ist, zu verstehen, wie Zellen Schäden Signale integrieren und montieren Antworten, die auf verschiedene Umstände zugeschnitten sind. Der Hauptgrund, warum Proteinfehlfaltungen stellt eine existentielle threan der Zelle ist die Neigung von falsch gefalteten Proteinen zur Aggregation, wodurch eine globale Störung der überfüllten und zart intrazellulären Faltung Umgebung 1. Die Faltung der Gesundheit oder &quot;proteostasis,&quot; der zellulären Proteoms wird beibehalten, auch unter dem Zwang der Alterung, Stress und oxidativen Schäden durch das koordinierte Handeln der verschiedenen mechanistischen Einheiten in einer aufwendigen Qualitätskontrolle 3,4. Eine spezielle Maschinen molekularer Chaperone können nicht-native Polypeptide binden und fördern deren Faltung in den nativen Zustand 1, zielen sie für den Abbau durch das Ubiquitin-Proteasom-System 5 oder leiten sie an schützenden Aggregation Einschlüsse 6-9. Die juxtanuclear Qualitätskontrolle Fach (JUNQ) und das unlösliche Protein Anzahlung (IPOD) (- Modell Abbildung 1): In Eukaryoten wird die cytosolische Aggregation Qualitätskontrolle Last zwischen zwei Fächern 8-10 unterteilt.Proteine, die durch das Protein Falzqualität Kontrollapparat ubiquitiniert werden an das JUNQ, wo sie für den Abbau durch das Proteasom verarbeitet geliefert. Falsch gefaltete Proteine, die nicht ubiquitiniert sind, werden auf dem IPOD, wo sie aktiv in einem schützenden Raum zusammengefasst werden umgeleitet. Bis zu diesem Punkt hat die methodischen Paradigma der live-cell Fluoreszenzmikroskopie weitgehend Markierung von Proteinen gewesen und verfolgen ihre Orten in der Zelle an bestimmten Zeitpunkten und in der Regel in zwei Dimensionen. Wie neue Technologien begonnen haben zu gewähren Experimentatoren beispiellosen Zugang zu den Submikrometerbereich in lebenden Zellen, wurde die dynamische Architektur des Cytosol in Sicht als herausfordernde neue Grenze für experimentelle Charakterisierung kommen. Wir stellen eine Methode zum schnellen Überwachen der 3D räumlichen Verteilungen von mehrfachen fluoreszenzmarkierten Proteinen in der Hefe Cytosol über die Zeit. 3D timelapse (4D-Bildgebung) ist nicht nur eine technische Herausforderung, Rattesie, es erleichtert auch eine dramatische Verschiebung in den konzeptionellen Rahmen zur zellulären Struktur zu analysieren. Wir verwenden eine cytosolische Falt-Sensor-Protein in lebende Hefe zu deutlichen Schicksale falsch gefalteten Proteinen in zellulären Aggregation Qualitätskontrolle zu visualisieren, mit schnellen 4D Fluoreszenz-Bildgebung. Die temperaturempfindliche Mutante des Proteins Ubc9 10-12 (Ubc9 ts) ist extrem wirksam sowohl als Sensor der zellulären proteostasis und einem physiologischen Modell zum Verfolgen Aggregation Qualitätskontrolle. Wie bei den meisten ts Proteinen ist Ubc9 ts vollständig gefalteten und funktional permissiven Temperaturen durch aktive zelluläre Chaperone. Über 30 ° C, oder wenn die Zelle Fehlfaltung Stress, Ubc9 ts misfolds zugewandt und folgt dem Schicksal eines nativen globulären Protein, das fehlgefaltete hat aufgrund von Mutation, Hitzedenaturierung, oder oxidative Schädigung. Durch Fusion mit GFP oder andere Fluorophore, kann es in 3D verfolgt werden, wie es Stress-Foci bildet, oder ist dikorrigiert um JUNQ oder iPod.

<html><img alt="Abbildung 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50083/50083fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50083/50083fig1.jpg" /> Abbildung 1. Modell:. Subzellulären Kompartimentierung von fehlgefalteten Proteinen Qualitätskontrolle Maschinen lenkt fehlgefaltete Proteine ​​in getrennte Kompartimente mit verschiedenen Funktionen: Lösliche Proteine, gezielt zum Abbau durchlaufen Poly-Ubiquitinierung und sind dem Ju xta-N uclear Q ualitätskontrolle Abteil (JUNQ geschickt ). Unlöslichen Proteinen, die nicht zu ubiquitiniert sind auf protektive Sequestrierung an die I nsoluble Pr otein D eposit (IPOD), angrenzend an die Vakuole, gesendet, wo sie aktiv Aggregation unterzogen werden. es.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50083/50083fig2.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2. Modeling Proteinfehlfaltungen mit GFP-Ubc9 ts. Unter normalen Bedingungen wird GFP-Ubc9 ts (grün) nativ gefaltet und diffus im Zellkern und Zytosol lokalisiert. Der Kern wird durch NLS-TFP (rot) markiert. Die Expression von Ubc9 ts wurde durch Zugabe von 2% Glucose, bevor Bildgebung in allen Experimenten geschlossen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50083/50083fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um größere Zahl anzuzeigen</a> . <ol><li> Bei Temperatur-Shift bis 37 ° C, GFP-Ubc9 ts (grün) fehlgefaltete und bildet cytosolischen Stress-Foci. Der Kern wird durch NLS-TFP (rot) markiert. </li><li> Bei Erholung von Hitzeschock bei 23 ° C, die thermisch denaturiert GFP-Ubc9 ts abgebaut wird, als durch eine verminderte Fluoreszenz Pegel angedeutet. </li><li> Nach Temperaturverschiebung bis 37 ° C mit Proteasom-Inhibierung mit 80 mm MG132, GFP-U<html> BC9 ts fehlgefaltete und in JUNQ und IPOD Einschlüsse verarbeitet. Der Kern wird durch NLS-TFP (rot) markiert. </li><li> Bei Temperatur-Shift bis 37 ° C und Ubiquitinierung Hemmung, GFP-Ubc9 ts fehlgefaltete und in den IPOD Einbeziehung verarbeitet. Der Kern wird durch NLS-TFP (rot) markiert. Das Ubiquitin Protease 4 (Ubp4) überexprimiert wird, um Ubc9 ts Ubiquitinierung blockieren. </li></ol><img alt="Abbildung 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50083/50083fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50083/50083fig3.jpg" /> Abbildung 3. Zeitrafferaufnahme JUNQ und IPOD Bildung. Bei Temperatur-Shift bis 37 ° C und Proteasom-Hemmung mit 80 mm MG132, GFP-Ubc9 ts Stress-Foci in JUNQ und IPOD Einschlüsse verarbeitet. Der Kern wird durch NLS-TFP (rot) markiert. 3D-Bilder wurden bei 4 min Intervallen erfasst. (Siehe auch Movie 1).com/files/ftp_upload/50083/50083fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.

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4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

Zelluläre Lebensfähigkeit hängt rechtzeitige und effiziente Verwaltung der Fehlfaltung von Proteinen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Visualisierung der unterschiedlichen potentiellen Schicksal eines fehlgefalteten Proteinen: Rückfaltung, Abbau oder Sequestrierung in Einschlüssen. Wir zeigen die Verwendung eines Falt-Sensor, Ubc9<sup&gt; Ts</sup&gt; Zur Überwachung proteostasis und Aggregation Qualitätskontrolle in lebenden Zellen mit Hilfe der 4D-Mikroskopie.

4D-Bildgebung von Protein Aggregation in lebenden Zellen

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

4d-imaging-of-protein-aggregation-in-live-cells

Research

JoVE Journal

Biology

17.2K Aufrufe.  Hebrew University of Jerusalem. Zelluläre Lebensfähigkeit hängt rechtzeitige und effiziente Verwaltung der Fehlfaltung von Proteinen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Visualisierung der unterschiedlichen potentiellen Schicksal eines fehlgefalteten Proteinen: Rückfaltung, Abbau oder Sequestrierung in Einschlüssen. Wir zeigen die Verwendung eines Falt-Sensor, Ubc9 Ts Zur Überwachung proteostasis und Aggregation Qualitätskontrolle in lebenden Zellen mit Hilfe der 4D-Mikroskopi...

Serie: 4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Forschung

Biologie

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Imaging Protein-Protein-Wechselwirkungen In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen Mit Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Unmodified and hyperphosphorylated tau proteins were used in two in vitro aggregation assays to reveal the hyperphosphorylation-dependent fast aggregation kinetics. These assays pave the way for future screens for compounds that can modulate the propensity of hyperphosphorylated tau to form fibrils that underlie the progression of Alzheimer&#8217;s disease.

In-vitro-Assays mit Aggregation hyperphosphoryliertem Tau Protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Eine grafische Benutzeroberfläche für die softwaregestützte Verfolgung der Proteinkonzentration in dynamischen zellulären Vorsprüngen

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Methoden zur Untersuchung Veränderungen inhärenten Proteinaggregation mit dem Alter in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of pre-clinical agents labeled with fluorescent probes. With recent advancements in antibody based cytotoxic drug delivery systems, understanding the alterations induced by these agents within the realm of receptor aggregation and internalization is of critical importance. This protocol leverages the well-established methodology of fluorescent immunocytochemistry and the open source FIJI distribution of ImageJ, with its inbuilt autocorrelation and image mathematical functions, to perform spatial image correlation spectroscopy (ICS). This protocol quantitates the fluorescent intensity of labeled receptors as a function of the beam area of the confocal microscope. This provides a quantitative measure of the state of target molecule aggregation on the cell surface. This methodology is focused on the characterization of static cells with potential to expand into temporal investigations of receptor aggregation. This protocol presents an accessible methodology to provide quantification of clustering events occurring at the cell surface, utilizing well established techniques and non-specialized imaging apparatus.

Antibodies that bind to target receptors on the cell surface can confer conformation and clustering alterations. These dynamic changes have implications for characterizing drug development in target cells. This protocol utilizes confocal microscopy and image correlation spectroscopy through ImageJ/FIJI to quantify the extent of receptor clustering on the cell surface.

Konfokale Mikroskopie zeigt Zelle Oberfläche Rezeptor Aggregation über Bild Korrelation Spektroskopie

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of ...

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

4D-Mikroskopie der Hefe

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) provide accurate information about PPIs in live cells. FLIM-FRET relies on measuring the fluorescence lifetime decay of a FRET donor at each pixel of the FLIM image, providing quantitative and accurate information about PPIs and their spatial cellular organizations. We propose here a detailed protocol for FLIM-FRET measurements that we applied to monitor PPIs in live Pseudomonas aeruginosa in the particular case of two interacting proteins expressed with highly different copy numbers to demonstrate the quality and robustness of the technique at revealing critical features of PPIs. This protocol describes in detail all the necessary steps for PPI characterization - starting from bacterial mutant constructions up to the final analysis using recently developed tools providing advanced visualization possibilities for a straightforward interpretation of complex FLIM-FRET data.

We describe here a protocol to characterize protein-protein interactions between two highly-differently expressed proteins in live Pseudomonas aeruginosa using FLIM-FRET measurements. The protocol includes bacteria strain constructions, bacteria immobilization, imaging and post-imaging data analysis routines.

FLIM-FRET Messungen von Protein-Protein-Wechselwirkungen in lebenden Bakterien.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster ...