This work was supported by an NSF grant (MCB-1054449) and a collaborative interdisciplinary Pilot Research Program award from The RNA Institute at University at Albany to PTXL.

1. Vorbereitung von RNA-Molekülen für Einzelmolekül-zupfen <ol><li> Klonieren der Sequenz von Interesse. Klonierung der DNA-Sequenz, die dem RNA-Struktur in einen Vektor. </li><li> Synthese und Reinigung der Transkriptionsvorlage. Synthetisieren eine Transkription Vorlage durch PCR. [Ort Tabelle 1 hier] nächstes reinigen die PCR-Produkte mit Hilfe eines PCR-Reinigungs-Kits, und konzentrieren sich die Probe auf&gt; 200 ng / ul. Weil die gereinigte DNA wird für die Transkription verwendet wird, sollte RNase freies Wasser in den Elution und Konzentration verwendet werden. </li><li> In-vitro-Transkription. Synthese von RNA durch in vitro-Transkription bei 37 ° C über Nacht, um RNA-Ausbeute zu maximieren. [Ort Tabelle 2 hier] Nach der Transkription, fügen 1 ul DNase I, um die DNA-Vorlage für 15 min bei 37 ° C zu verdauen. Reinige den RNA unter Verwendung einer Silica-Spin-Säule. </li><li> Synthese der biotinylierten Griff A. Erste, produzieren die unveränderte Griff A durch PCR unter Verwendung von Primern Af und Ar und konzEntrate die amplifizierte DNA auf&gt; 200 ng / ul. Als nächstes übernehmen Biotin-Modifikationen in den PCR-Produkt mit einer Primer-Extension-Reaktion. [Ort Tabelle 3 hier] HINWEIS: Das biotinylierte Griff A (Biotin-HA) können direkt in der Annealing ohne Reinigung verwendet werden. Wie das Biotin-HA mit RNA geglüht werden, ist es entscheidend, RNase-freiem Wasser in beiden Stufen zu verwenden. </li><li> Synthese der Digoxigenin-modifizierten Griff synthetisieren B. Digoxigenin durch PCR modifiziert Griff B (dig-HB) unter Verwendung von Primer Bf und Digoxigenin-modifizierten Oligo Dig-Br (3). Nächsten, reinigen das PCR-Produkt und konzentrieren sich die Probe auf&gt; 200 ng / ul. </li><li> Annealing-RNA an den Griffen. Glühen die RNA mit Griffen. [Ort Tabellen 4 und 5 hier] </li><li> Reinigen geglüht Probe. Hinzufügen 3 Volumen Ethanol der wärmebehandelten Probe und gut mischen. Speichern der Mischung bei -70 ° C für mindestens 1 Stunde. Spin-Down bei 15.800 xg und Überstand verwerfen. Trocknen Sie die Pellets mit einer Gefriertrocknungsanlage. Das Pellet in100 ul RNase freiem Wasser. ANMERKUNG: Die Probe kann nun verwendet werden kann und bei -20 ° C gelagert werden. </li></ol> 2. Kalibrierung und Betrieb der optischen Pinzette <ol><li> Kalibrieren Pixelgröße von Video-Monitor <ol><li> Verwenden Sie den optischen Falle zu fangen eine Perle mit bekanntem Durchmesser (Größe Standard). </li><li> Machen Sie Bilder der gefangenen Perle mit Imaging-Software (Abbildung 4). </li><li> Bestimmung der Durchmesser der Kugel mit der Bildverarbeitungssoftware auf der Basis der Schwerpunktmethode. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang zu einem Durchmesser von Perlen unterschiedlicher Größe zu bestimmen. </li><li> Passen die gemessenen und bekannten Durchmesser der Kügelchen durch eine lineare Regression auf die physikalische Grße eines Pixels zu erhalten. </li></ol></li><li> Stellen Sie sicher, Entfernung Kalibrierung <ol><li> Verwenden Sie den optischen Falle zu fangen eine Perle. </li><li> Bestimmt die Pixelposition seines Schwerpunkts von der Bildaufnahmesoftware und notieren Sie die Position mit den Minitweezers. </li><li> Steuern die Wulst zu DIFFe<html> mieten Positionen und wiederholen Sie die Positionsbestimmung. </li><li> Konvertieren der X und Y-Positionen des Wulstes von Pixeln m Einheit unter Verwendung des kalibrierten Pixelgröße. </li><li> Vergleichen der X und Y zwischen den Positionen von Video-und die Minitweezers gemessen. Die beiden Sätze von Werten sollten übereinstimmen. Als die Bildauflösung&gt; 0,1 um, bewegen Sie den Wulst über 1 um zwischen den Messungen, um die Genauigkeit zu gewährleisten. Wenn der Abstand Kalibrierung ist nicht vergleichbar mit dem in den Minitweezers gespeichert, kalibrieren Sie das Instrument. </li></ol></li><li> Trap Steifigkeit Kalibrierung <ol><li> Nehmen Sie ein Wulst mit der optischen Falle und halten Sie sie immer noch. </li><li> Notieren Sie die Kraft der Falle mit einem Bypass-schnelle Datenerfassung mit einer Geschwindigkeit&gt; 5 kHz für 3 Sekunden. </li><li> Erzeugen ein Leistungsspektrum von der Aufnahme der Wulst Bewegung mit der Software. Passen das Leistungsspektrum zu einer Lorentz (Abbildung 5) 38: 542 / 51542eq1.jpg &quot;width =&quot; 200 &quot;/&gt; (Gl. 1) in dem S (f) ist die Leistung bei der Frequenz f ist, f c die Grenzfrequenz, und S 0 die asymptotische Kraft. Die Eckfrequenz f c ist die Frequenz, bei der die Leistung des Wärmebewegung auf die Hälfte des asymptotischen Wert verringert. Als f c variiert mit Laserleistung und Korngröße, kalibrieren jeden gefangen Perle einzeln. </li><li> Berechnen Sie die Federkonstante der Falle, κ, von f c: <img alt="Gleichung 2" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51542/51542eq2.jpg" width="100" /> (Gl. 2) in dem γ ist der Widerstandskoeffizient des Wulst (Gl. 3). Verwenden Sie die Federkonstante Erweiterung Änderungen eines RNA aus Kraftänderung zu bestimmen. </li></ol></li><li> Law Test-Stokes &#39; <ol><li> Nehmen Sie ein Wulst mit der optischen Falle. Bewegen des Wulstes hin-und Kraft mit unterschiedlicher Geschwindigkeit. </li><li> Notieren Sie sich die Bewegung der Raupe und Kraft mit den Minitweezers. </li><li> Berechnen des Radius des Wulstes. HINWEIS: Die Reibungskraft, F d, die durch die Bewegung eines kugelförmigen Teilchens in einer Flüssigkeit erzeugt wird, durch das Stokessche Gesetz beschrieben werden: <img alt="Gleichung 3" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51542/51542eq3.jpg" width="150" /> (Gl. 3) wobei r der Radius der Kugel, v die Geschwindigkeit ist und h die dynamische Viskosität der Flüssigkeit, die in Referenztabellen zu finden ist. Verwendung der gemessenen Kraft F D, kann der Radius des Wulstes mit Gleichung berechnet werden. 3 (Figur 6) und ist mit dem von der Bildaufnahme-Software bestimmt zustimmen. Die Stokes &#39;Gesetz Test effektiv testet die Gesamt Kalibrierungen und die Leistung des Gerätes. </li></ol></li></ol> 3. Nanomanipulation von RNA-Einzelmolekülen <ol><li> Fluidik machen. <ol><li> Bohren sechs Löcher (2 mm Durchmesser) auf einem Deckglas Nr. 2 (7a) und schneiden Sie drei Schlitze (2 mm Breite) in doppelseitigen Klebeband Polyimid (Abbildung 7b) mit einem Laser-Graveur. </li><li> Machen Sie eine Flusskammer durch Zwischen zwei Deckglas mit zwei Schichten von doppelseitigen Klebeband Kapton. Legen Sie eine Mikropipette und zwei Bypassrohre zwischen dem Band (7c). </li><li> Die Flusskammer auf einem Metallrahmen zu montieren durch pass fluidischen Löcher (Abbildung 7d). </li><li> Verbinden der Fluidkanäle der Kammer auf 10 ml Spritzen mit Puffer der Wahl durch Polyethylenschläuche (7e) gefüllt. </li><li> Die gesamte Kammer Halterung auf der optischen Pinzette zwischen den beiden Zielen. Sicherzustellen, dass die Vorderseite der Kammer mit dem Fluidkanäle nach rechts zeigt. Ziehen Sie die richtige Ziel und die Messingstifte des Rahmens (7e) anschließen, um Befestigungslöcher auf Ter Pinzette. Schrauben anziehen, um die Kammer Position zu fixieren. </li></ol></li><li> Mischen der wärmebehandelten Probe und Perlen. Mischen Sie die Probe mit geglüht Anti-Digoxigenin-beschichteten Kügelchen (dig-Kugeln), und lassen Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 5-10 min zu bleiben. Typischerweise wird 1 ul der wärmebehandelten Probe mit 5 ul DIG-Kügelchen in 1 ml Puffer gemischt. HINWEIS: Die Menge der Kügelchen in der Strömungskammer geladen werden, sollten so gewählt werden, um sicherzustellen, eine angemessene Menge der Kügelchen von der Umgehungsröhre geliefert werden. Das Verhältnis der wärmebehandelten Probe an die Perlen nicht leicht quantifiziert werden. Im Idealfall haben die meisten Kügelchen keine RNA, so dass nur ein kleiner Anteil der Perlen kann nur ein RNA-Molekül pro Kügelchen haben. Da die Proben geglüht und die Partikelsuspension schwer zu quantifizieren sind, ist die beste und einzige Möglichkeit derzeit, das Mischungsverhältnis variieren und testen Sie die Mischung auf der Pinzette. </li><li> Liefern Kügelchen zu der Reaktionsstelle in der Strömungskammer (dh wenige Mikrometer über der micropipette Spitze, 7c). <ol><li> Laden Sie eine Suspension von Streptavidin-beschichtete Beads (Perlen-Hals) in eine 1-ml-Spritze. </li><li> Verbinden Sie die Spritze mit der fluidischen Gasweg des unteren Kanal der Strömungskammer (Abbildung 7a). </li><li> Schieben Sie die Spritze mit dem Strep-Perlen in die Kammer fließen. </li><li> Bewegen Sie die gesamte Kammer mit Motorsteuersoftware, um die optische Falle in der Nähe der Öffnung des unteren Bypassrohr (7b) zu platzieren. Dann durch einen Trackball betreiben die optische Falle, um eine Streptokokken-Perle zu erfassen. </li><li> Bewegen der Wulst in der Nähe der Spitze der Mikropipette mit der Motorsteuerungssoftware. </li><li> Ziehen Sie die Spritze in die Mikropipette verbunden, um die Perle auf der Mikropipette saugen. </li><li> Gelten Strom sanft, indem Sie die Spritze mit dem Mittelkanal zu spülen, besonders Streptokokken-Perlen. </li><li> Ebenso liefern die Mischung der Probe und die DIG-Perlen (siehe Schritt 3.2) an den oberen Kanal der Kammer. </li><li> Nehmen Sie ein DIG-Wulst und bringen es nah an der Strep-Wulst mit der optischen Falle. </li><li> Reinigen Sie den mittleren Kanal, der durch die Anwendung Fluss. HINWEIS: Der Strep und DIG-Kügelchen werden so ausgewählt, um verschiedene Größen aufweisen, so dass sie optisch unter dem Mikroskopaufnahme unterschieden werden (Abbildung 4). </li></ol></li><li> Fishing &quot;ein Einzelmolekül-Tethering zwischen einem Paar von Perlen. <ol><li> Legen Sie die DIG-Wulst vertikal auf der Oberseite des Strep-Wulst (Abbildung 4). </li><li> Bewegen Sie die DIG-Wulst nach unten in Richtung der Streptokokken-Perle durch die Lenkung der Falle. Öffnen Sie ein Kraft-Weg-Diagramm-Fenster auf Computer, um Kraft Veränderungen sichtbar zu machen. </li><li> Beim Kontakt der beiden Perlen, bewegen Sie den DIG-Wulst senkrecht weg von der Strep-Perle. </li><li> Wenn keine spezifischen Kontakt gemacht wird, bleibt die Kraft, fast Null. Wenn die beiden Wülste von Molekülen verbunden ist, steigt die Kraft beträchtlich, wenn die beiden Wülste trennt. Dieses Verfahren, das allgemein als &quot;fishing&quot; bezeichnet wird, ist oft perfORMED mehrmals auf jedes Paar von Perlen, um eine effektive Einzelmolekül-Halteseil finden. </li></ol></li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

<html> Umbau und Fehlerbehebung in Vorbereitung der Proben Tweezing Wahl des Klonens von Vector. Obwohl die hier beschriebenen allgemeinen Schema (Figur 3) erfordert keine besondere Klonierungsvektor wird der Vektor bevorzugt, keine intrinsische T7 oder T3-Promotor für die Leichtigkeit der Transkription, so dass ein Promotor mittels PCR an den gewünschten Positionen eingebracht werden müssen. Reihenfolge und Länge...

Die Entwicklung der optischen Pinzette Technik seit langem mit ihrer Anwendung in der biologischen Forschung begleitet. Wenn das optische Falleneffekt zuerst entdeckt wurde, beobachtet Arthur Ashkin, dass Bakterien in verunreinigtem Wasser kann an der Laserfokus 1 gefangen werden. Seitdem, Trapping Bakterien hat sich zu einem unbeabsichtigten, lustiges Experiment für Generationen von Studenten der Biophysik sowie eine ernsthafte Recherche-Tool, um mikrobielle Physiologie 2,3 studieren. Das optische Einfangen Technik verwendet fokussierten Laserstrahls, um einen mikroskopischen Objekt 1 immobilisieren. Praktisch wird ein Laserfalle als ein optischer Feder, die auch Maßnahmen Kraft (F) auf dem eingeklemmten Gegenstand durch die Verschiebung von der Mitte der Falle (AX). Innerhalb kurzer Reichweite, F = κ x AX, in κ die Federkonstante der Falle. Die optische Falle kann verwendet werden, um Kraft in Pikonewton (pN) Präzision, um ein Micros auszuübenkopische Objekt und messen ihre Position mit Nanometer (nm) Genauigkeit. In den vergangenen zwei Jahrzehnten haben optische Pinzette zu einem der am häufigsten verwendeten Einzelmolekültechniken in der Biophysik. Die Technik wurde verwendet, um das Falten und Mechanik der DNA 4-6, 7-9 RNA und Proteine ​​10,11 studieren. Optische Pinzetten wurden auch verwendet, um die DNA-Replikation 12 13 RNA-Transkription und Proteinsynthese 14,15 sowie viele andere biomolekulare Ereignisse 16-18 beobachten. In RNA Strukturforschung sind Einzelmolekül-Ansätze beschäftigt vor allem auf die robuste Klappenergielandschaft von RNA zu erkunden. Eine RNA-Sequenz kann in der Regel in mehrere stabile, sich gegenseitig ausschließende Strukturen falten, aufgrund der einfachen chemischen Zusammensetzung und Basenpaarung Regeln der RNA. Es ist seit langem bekannt, dass RNA strukturellen Polymorphismus, wie er in Riboswitches 19,20 auftritt, spielt eine wichtige Rolle bei der Genregulation. Ein Vor kurzet genomweite Umfrage hat ergeben, dass Temperaturschwankungen so gering wie ein paar Grad Struktur und die Proteinsynthese eines großen Teils des zellulären Transkriptoms 21 stark beeinflussen. Dieses Beispiel deutet an, dass die biologische Rolle von RNA-Faltung Alternative ist vielleicht noch wichtiger und durchdringend, als bisher angenommen. Struktur Polymorphismus jedoch eine Herausforderung für die traditionellen biochemischen und biophysikalischen Ansätzen, die durchschnittlichen Eigenschaften vieler Moleküle zu untersuchen. Zum Beispiel kann die &quot;An&quot; und &quot;Aus&quot;-Konformationen eines RNA-Schalter sich gegenseitig aus. Eine gemittelte Struktur von heterogenen Strukturen abgeleitet ist wahrscheinlich nicht eine der biologisch relevante Konformationen ähneln. Darüber hinaus untranslatierte RNA und mRNA bilden in der Regel Strukturen. Ihre Wechselwirkung mit Proteinen und regulatorischen RNAs häufig benötigt Entfaltung bestehende Struktur als Teil der Interaktion. Daher studieren RNA Entfaltung / Rückfaltung wird eine relevanteAusgabe von RNA Biologie. Um eine solche Herausforderung zu begegnen, hat die Einzelmolekül-Ansatz eingesetzt, um RNA-Struktur Polymorphismus durch das Studium ein Molekül in einer Zeit, 22-27 entwirren. Im Vergleich zu den beliebten Einzelmolekülfluoreszenzverfahren, Pinzette basierend mechanische Entfaltung bietet den Vorteil, dass Konformationen einzelner Moleküle können durch angelegte Kraft manipuliert werden und mit Nanometer-Präzision gemessen werden. Diese Nanomanipulationsfähigkeit kann verwendet werden, um das Aufklappen / Zusammenklappen der einzelnen strukturellen Domänen, so daß die hierarchische Falten eines großen RNA präpariert 28 werden überwacht. Alternativ kann ein einzelner Strang gerichtet, in eine von mehreren Konformere zu falten; oder eine bestehende Struktur mechanisch induziert werden, um in eine andere Konformation 29 falten. Unter biologischen Bedingungen kann eine RNA-Struktur bei Temperaturänderung oder die Ligandenbindung verändert werden. Die Fähigkeit direkt zu bearbeiten Molekular struktur öffnet eine neue Spielstätte der RNA-Struktur Studie. Grundsätzlich andere mechanische Techniken wie Rasterkraftmikroskop und magnetische Pinzette, können auch verwendet werden, um das Falten der einzelnen RNA-Moleküle zu untersuchen. Jedoch sind solche Anwendungen weitgehend aufgrund der relativ niedrigen räumlichen Auflösung 30 begrenzt. Der Einsatz von optischen Pinzetten können RNA-Strukturen, um durch mechanische Kraft entfaltet werden. Der Vorteil der mechanischen Entfaltung ist mehrfach. Kraft kann verwendet werden, um die sekundäre und die tertiäre Strukturen entfalten, wobei Metallionen und Liganden-induzierte Falten sind hauptsächlich tertiäre Strukturen beschränkt. Temperatur und Denaturierungsmittel kann erhebliche Auswirkungen auf die Aktivitäten von Wasser und gelöste Stoffe. Im Gegensatz dazu wird die Kraft lokal auf molekularer Strukturen stören aufgebracht; Die Krafteinwirkung auf die Umgebung vernachlässigbar ist. Darüber hinaus wird die thermische Schmelz besten verwendet, um das Falten der Thermodynamik von kleinen RNA-Strukturen zu untersuchen,wohingegen optische Pinzetten wurden verwendet, um RNA-Strukturen mit verschiedenen Größen zu untersuchen, die von einem Sieben-Basenpaar-Haarnadel Tetraloop 28 zu einem 400-Nukleotid-Ribozym 31. Ferner kann RNA-Strukturen mechanisch mesophilen Temperaturen entfaltet werden. Im Gegensatz zu RNAs in einem thermischen Schmelzexperiment zu entfalten, wird die Temperatur in der Regel deutlich über physiologischen Temperaturen, die deutlich erhöht RNA-Hydrolyse, insbesondere in Gegenwart von Mg 2 +-Ionen erhöht. Es ist wichtig zu beachten, dass die mechanische Wirkung der Kraft abhängig, wie es sich auf eine Struktur angewendet wird. Die aufgebrachte Kraft kippt die Falten Energielandschaft. Zum Beispiel, wenn eine Kraft auf eine Haarnadel aufgebracht wird, die Basenpaare nacheinander gebrochen, eine zu einem Zeitpunkt (Abbildung 1a). Die Rippen Gabel schreitet entlang der Schraubenachse, die senkrecht zu der aufgebrachten Kraft ist. Wenn dagegen eine minimale küssen Komplex ist unter Spannung, die beiden küssenBasenpaare, die parallel zu der aufgebrachten Kraft sind, teilen sich die Kraftbelastung (Abbildung 1b). Die unterschiedlichen Geometrien der Haarnadel und kissing Komplexes relativ zu der aufgebrachten Kraft infolge ihrer unterschiedlichen mechanischen Resonanz, die verwendet werden kann, um sekundäre und tertiäre Faltung 28,32 unterscheiden. Der theoretische Aspekt der mechanischen Entfaltung zuvor überprüft worden 8,9,30. Diese Arbeit werden die grundlegenden Ansätze zur Einrichtung und führen Sie eine Einzelmolekül-mechanische Entfaltung Assay. Versuchsaufbau. In unserem mechanisches Ziehen Experiment wurde die RNA-Probe für Pinzetten aus der RNA von Interesse durch zwei doppelsträngige DNA / RNA flankiert Griffe (2) 7. Das gesamte Molekül kann zwei oberflächenbeschichteten Mikrometergröße Kügelchen (Spherotech) über Streptavidin-Biotin-und Digoxigenin-anti-Digoxigenin-Antikörper-Wechselwirkungen bzw. angebunden werden. Einem Wulst wird durch einen Kraftmess optischen tr gehaltenAP, während die andere an der Spitze einer Mikropipette gehalten. Der relative Abstand zwischen den Kügelchen können entweder durch die Steuerung der Falle oder Bewegen der Mikropipette geändert werden. Mit diesem Ansatz kann ein einzelnes RNA-Molekül Tethering die Perlen gedehnt und entspannt werden. Herstellung der Proben. Die Synthese von RNA-Proben zum Zupfen beinhaltet einige Schritte (Abbildung 3). Zuerst wird die DNA-Sequenz, die dem RNA von Interesse zuerst in einen Plasmidvektor kloniert. Als nächstes werden drei PCR Reaktionen durchgeführt, um die zwei Handgriffe und eine Vorlage für die Transkription zu erzeugen. Die Transkription Vorlage umfasst die Griff Regionen und die eingefügten Sequenzen. Der Volllängen-RNA wird durch in vitro-Transkription synthetisiert. Zuletzt werden die RNA und chemisch modifizierte Griffe zusammen getempert, um die Moleküle zu zupfen erzeugen. Kalibrierung und Betrieb der Pinzette. Das grundlegende Design des Minitweezers Einsatzd in dieser Arbeit folgt, dass der Dual-Beam-optischen Pinzette 33. Mit vielen Verbesserungen, die Minitweezers anzuzeigen außergewöhnliche Stabilität im Vergleich zur ersten Generation optischen Pinzette. Eine Reihe von Forschungsgruppen in mehreren Ländern die Minitweezers verwenden in ihren Einzelmolekül-Forschung 14,15,34-37. Die Details der Konstruktion, Kalibrierung und Betrieb des Gerätes, einschließlich Lehrvideos, sind in der &quot;Pinzette Lab&quot;-Website (http://tweezerslab.unipr.it) zur Verfügung. Dabei sind Verbesserungen und Kalibrierungsverfahren, die auf täglicher Basis durchgeführt werden müssen, im Detail beschrieben.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="745">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">Minitweezers</td>
			<td style="width:211px;">Steven B. Smith Engineering</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"><a href="http://tweezerslab.unipr.it/">http://tweezerslab.unipr.it</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Data acquisition card</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">USB-6351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Video card</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">PCI-1407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Labview programming software</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">NI Vision Builder</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Laser engraver</td>
			<td style="width:211px;">Epilogue laser systems</td>
			<td style="width:119px;">Zing-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">PCR purification kit</td>
			<td style="width:211px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">MEGAscript T7 kit</td>
			<td style="width:211px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">MEGAclear kit</td>
			<td style="width:211px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Biotin-11-UTP</td>
			<td style="width:211px;">Thermo Fisher</td>
			<td>FERR0081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">T4 DNA polymerase</td>
			<td style="width:211px;">New England Labs</td>
			<td style="width:119px;">M0203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">Streptavidin coated microsphere</td>
			<td style="width:211px;">Spherotech</td>
			<td style="width:119px;">SVP-20-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Antidigoxigenin coated microsphere</td>
			<td style="width:211px;">Spherotech</td>
			<td style="width:119px;">DIGP-20-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Size standard microspheres</td>
			<td style="width:211px;">Spherotech</td>
			<td style="width:119px;">PPS-6K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Kapton tape</td>
			<td style="width:211px;">Kaptontape.com</td>
			<td>KPPTDE-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">No. 2 cover glass</td>
			<td style="width:211px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-543D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanomanipulation of single rna molecules by optical tweezers

Ein großer Teil des menschlichen Genoms transkribiert wird, aber nicht übersetzt. In diesem Beitrag genomischen Ära, regulatorische Funktionen von RNA haben gezeigt, dass immer mehr wichtig zu sein. RNA-Funktion hängt oft von seiner Fähigkeit, alternative Strukturen annehmen, ist es schwierig, RNA dreidimensionale Strukturen direkt Sequenz vorherzusagen. Einzelmolekül Ansätze zeigen Potentiale, das Problem der RNA strukturellen Polymorphismus durch Überwachen Molekülstrukturen ein Molekül zu einem Zeitpunkt zu lösen. Diese Arbeit stellt eine Methode, um die Faltung und Struktur der einzelnen RNA-Moleküle mit Hilfe der optischen Pinzette gerade manipulieren. Erstens, Methoden zu synthetisieren Moleküle geeignet für Einzelmolekül-mechanische Arbeit werden beschrieben. Als nächstes werden verschiedene Eichverfahren, um die entsprechenden Operationen der optischen Pinzette sicherzustellen diskutiert. Als nächstes werden verschiedene Experimente erläutert. Um den Nutzen der Technik zu demonstrieren, Ergebnisse der mechanisch Entfaltung RNA Haarnadeln und ein einzelnes RNA Kissing Komplexes sind als Beweismittel verwendet. In diesen Beispielen wurde die Nanomanipulationstechnik verwendet, um das Falten der einzelnen Strukturdomäne, einschließlich sekundären und tertiären studieren unabhängig. Schließlich werden die Beschränkungen und zukünftige Anwendungen des Verfahrens diskutiert.

Durch den Raum begrenzt ist, wird Nanomanipulation von einzelnen RNA-Moleküle, die durch die nur mechanische Entfaltung Beispiele für RNA-Haarnadeln und ein RNA mit Tertiärstruktur demonstriert. Manipulieren Einzel Hairpin Moleküle Sobald ein Halteseil zwischen den Perlen hergestellt ist, kann Verlängerung und Kraft auf das Halteseil mit einem Benutzer-definierten Protokoll bearbeitet werden. Vier gemeinsamen Manipulation Protokolle werden h...

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Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipulation von RNA-Einzelmoleküle durch Optische Pinzetten

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

nanomanipulation-of-single-rna-molecules-by-optical-tweezers

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.7K Aufrufe.  University at Albany, State University of New York. Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5’ and 3’ ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules. 

Serie: Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many interesting biological events such as histone binding and protein-mediated looping of DNA1,2, occur on this length scale. In recent years, the mechanical properties of DNA have been shown to play a significant role in fundamental cellular processes like the packaging of DNA into compact nucleosomes and chromatin fibers3,4. Clearly, it is then important to understand the mechanical properties of short stretches of DNA. In this paper, we provide a practical guide to a single-molecule optical tweezing technique that we have developed to study the mechanical behavior of DNA with contour lengths as short as a few hundred basepairs.
The major hurdle in stretching short segments of DNA is that conventional optical tweezers are generally designed to apply force in a direction lateral to the stage5,6, (see Fig. 1). In this geometry, the angle between the bead and the coverslip, to which the DNA is tethered, becomes very steep for submicron length DNA. The axial position must now be accounted for, which can be a challenge, and, since the extension drags the microsphere closer to the coverslip, steric effects are enhanced. Furthermore, as a result of the asymmetry of the microspheres, lateral extensions will generate varying levels of torque due to rotation of the microsphere within the optical trap since the direction of the reactive force changes during the extension.
Alternate methods for stretching submicron DNA run up against their own unique hurdles. For instance, a dual-beam optical trap is limited to stretching DNA of around a wavelength, at which point interference effects between the two traps and from light scattering between the microspheres begin to pose a significant problem. Replacing one of the traps with a micropipette would most likely suffer from similar challenges. While one could directly use the axial potential to stretch the DNA, an active feedback scheme would be needed to apply a constant force and the bandwidth of this will be quite limited, especially at low forces.
We circumvent these fundamental problems by directly pulling the DNA away from the coverslip by using a constant force axial optical tweezers7,8. This is achieved by trapping the bead in a linear region of the optical potential, where the optical force is constant-the strength of which can be tuned by adjusting the laser power. Trapping within the linear region also serves as an all optical force-clamp on the DNA that extends for nearly 350 nm in the axial direction. We simultaneously compensate for thermal and mechanical drift by finely adjusting the position of the stage so that a reference microsphere stuck to the coverslip remains at the same position and focus, allowing for a virtually limitless observation period.

We illustrate the use of a constant force axial optical tweezers to explore the mechanical properties of short DNA molecules. By stretching DNA axially, we minimize steric hindrances and artifacts arising in conventional lateral manipulation, allowing us to study DNA molecules as short as ~100 nm.

Stretching kurze DNA-Sequenzen mit Constant Force Axial Optische Pinzetten

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Forschung

Biotechnik

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

Multiplexed Einzelmolekül-Kraftspektroskopie Proteolyse Messungen mit magnetischen Pinzette

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

In vitro Synthese von Native, Fibröse Lange Abstände und Segmentberichterstattung Lange Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Optische Detektion von<em&gt; E. coli</em&gt; Bakterien durch Mesoporous Silicon Biosensoren

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

Magnetische Pinzette zur Messung von Dreh-und Drehmoment

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

Fluoreszenz Biomembrane Kraft Sonde: Concurrent Quantifizierung von Rezeptor-Ligand-Kinetik und Binding-induzierte intrazelluläre Signaling auf Einzelzell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the efficiency with which macromolecules penetrate the cytosolic space of cells. Recently, we have circumvented this problem by identifying the reagent dfTAT, a disulfide bond dimer of the peptide TAT labeled with the fluorophore tetramethylrhodamine. We have generated a fluorescently labeled dimer of the prototypical cell-penetrating peptide (CPP) TAT, dfTAT, which penetrates live cells and reaches the cytosolic space of cells with a particularly high efficiency. Cytosolic delivery of dfTAT is achieved in multiple cell lines, including primary cells. Moreover, delivery does not noticeably impact cell viability, proliferation or gene expression. dfTAT can deliver small molecules, peptides, antibodies, biologically active enzymes and a transcription factor. In this report, we describe the protocols involved in dfTAT synthesis and cellular delivery. The manuscript describes how to control the amount of protein delivered to the cytosolic space of cells by varying the amount of protein administered extracellularly. Finally, the current limitations of this new technology and steps involved in validating delivery are discussed. The described protocols should be extremely useful for cell-based assays as well as for the ex vivo manipulation and reprogramming of cells.

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

Lieferung von Proteinen, Peptiden oder Handy-undurchlässige kleine Moleküle in lebenden Zellen durch Inkubation mit dem endosomolytische Reagenz dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Markierungsfreie Einzelmoleküldetektion Mit Mikrotoroid optischen Resonatoren

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Optische Kontrolle von lebenden Zellen elektrische Aktivität von konjugierten Polymeren

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

Entwicklung von mikrofluidischen Geräten um die Dehnung Fähigkeit der Spitze wachsenden Pflanzenzellen in sehr kleinen Räumen zu studieren

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...