This research was supported in part by a National Research Service Award (T32GM07616) from the National Institute of General Medical Sciences.

1. Versuchsaufbau und die Probenvorbereitung <ol><li> Herzustellen Mikrotoroide Verwendung der Lithographie, Ätzen und Schmelzvorgang, wie zuvor. 6 beschrieben Herzustellen Mikrotoroide auf einem Silizium-Wafer (Chip), die typischerweise einen Außendurchmesser von 80-100 um und einem kleineren Durchmesser von 2 um. </li><li> Entspannen etwa einen Meter von single-mode optische Faser (125 um Verkleidungen, 4,3 um Modenfelddurchmesser) von ihrer Faserspule. </li><li> In der Mitte des abgewickelten Abschnittes der optischen Faser, Streifen ein kleines Segment (2,5 cm) der Polymerbeschichtung auf der optischen Faser mit Abisolierzange. Anmerkung: Dies ist der Teil der optischen Faser, die evaneszent Licht in Mikrotoroid verwendet wird. </li><li> Reinigen Sie die abisolierten Faser mit Isopropanol Alkohol und einem fusselfreien wischen. </li><li> Halten Sie diese Abschnitt der Faser an Ort und Stelle mit einem Faserhalter des Haftmagneten gemacht. </li><li> Thin das abgestreifte Faser bis ~ 500 nm von Melting und das Ziehen unter Verwendung eines Wasserstoffbrenner und zwei Schrittmotoren gegenläufig in 60 &amp; mgr; m / min. Positionieren der optischen Faser im Inneren des oberen Teils der Flamme, die sein sollte ~ 10 mm hoch. Stoppen Ziehen der Faser, wenn die Übertragung durch die Faser stoppt schwankt, das entweder visuell überwacht werden kann (durch die Beobachtung der Licht, das seitlich aus der Faser Aufblinken gestreut wird und aus) oder durch Verbinden der Faser mit einer Fotodiode, die mit einem Oszilloskop verbunden ist . </li><li> Spalten einem Ende der optischen Faser und fügen diesen in einer nackten Faser-Adapter. Dieses Ende der Faser in den Eingang des Fotoempfängers. </li><li> Faser Paar das andere Ende der Faserspule zu dem Laser unter Verwendung eines faseroptischen Kopplers. </li><li> Legen Sie die Mikrotoroid Chip auf einem Probenhalter (Edelstahl, 37,8 mm x 6,4 mm x 3,2 mm) unter Verwendung von entweder Epoxy oder doppelseitiges Klebeband. </li><li> Montieren Sie den Probenhalter auf einem Positionierungstisch, der aus einem 3-Achsen-Nanopositionierung umfasst (nanocube) Bühne (siehe Geräteliste) auf einem 3-Achsen-Mikrometer. Führen Sie alle Experimente an einem pneumatisch getrennt optischen Tisch, um Vibrationen zu minimieren. </li><li> Grobposition der Probenchip unter Verwendung des 3-Achsen-Mikrometer. </li><li> Richten Sie die Mikrotoroid haltigen Chips parallel zu der optischen Faser unter Verwendung der Nano-Positionierer. Hinweis: Richten Sie die Mikrotoroid in einem Abstand von einer Wellenlänge des Eingangslichts (~ 633 nm). Zur Visualisierung dieses Prozesses verwenden zwei Bildsäulen (Rohr mit Objektiv und Kamera siehe Ausstattungsliste) auf der Oberseite und auf der Seite des Chips angeordnet. </li><li> Optimieren Sie die Polarisation des durch die optische Faser unter Verwendung eines in-line-Polarisationssteuerung gerichtete Laserlicht (siehe Geräteliste) mit einem Drehknopf, um die Polarisation einzustellen. Anmerkung: Die optimale Polarisation erreicht wird, wenn die gemessene Tauch bei der Übertragung von der optischen Faser wird der engste. Beachten Sie diese Dip auf einem Oszilloskop (siehe Schritt 2.2 für weitere Einzelheiten). </li><li> Konstrukteine Probenkammer durch epoxying einem Deckglas über dem Probentisch mit einem Objektträger aus Glas als Abstandshalter. Hinweis: Ein Plexiglas-Gehäuse, die den gesamten Setup kann nützlich zur Minimierung von Luftströmungen zu sein. Eine kleine Öffnung gelassen werden sollten, um die Lösung zu ermöglichen, sich mit der Rohrleitung gepumpt werden. </li><li> Thermisch äquilibrieren Partikelsuspensionen oder Einzelmolekül wässrigen Lösungen zur ≥ 1 Stunde in einem Wasserbad RT (~ 500 ml). Anmerkung: Die Proben werden auf die gewünschte Konzentration in Mikrozentrifugenröhrchen unter Verwendung der vom Hersteller, beispielsweise PBS oder HEPES spezifizierten assoziierten Puffer verdünnt. Wenn keine Bindungsereignisse detektiert werden, erhöht die Salzkonzentration des Puffers. </li><li> Vortex Partikelhaltigen Lösungen (1 ml) kurzzeitig für ca. 2 Sek. </li><li> Injizieren Partikel enthaltenden Lösungen in die Probenkammer bei 1 ml / min unter Verwendung einer 1 ml-Spritzenpumpe. </li><li> Nachdem die Probenkammer gefüllt hat, schalten Sie die Spritzenpumpe. </li><li> Warten Sie 30 Sekunden vor Aufnahmedaten zu minimierendie Auswirkungen von mechanischen Schwingungen von Flüssigkeitsströmung, die die Messung beeinflussen können, resultieren. </li></ol> 2. Frequenz Locking <ol><li> Erneute Koppeln des Toroids zu der optischen Faser durch Bewegung des Probenhalters mit dem Positionierer, denn die Kupplung aufgrund der Einspritzung des Fluids gestört werden. </li><li> Lokalisieren die Resonanzwellenlänge des Mikrotoroid durch Abtasten des rechnergesteuerten Eingangslaser durch eine Vielzahl von Wellenlängen. Dieser Schritt durch Senden einer Dreieckspannung Signal an ein piezoelektrisches Element innerhalb des Lasercontroller, der die Wellenlänge des Lasers regelt. Experimente durchführen unter Verwendung von sichtbarem Licht (635 nm ± 2,5 nm), da es eine geringe Absorption von Licht in Wasser bei dieser Wellenlänge. </li><li> Messung der Lichtdurchlässigkeit durch die optische Faser durch Einstecken des Ausgangs der optischen Faser in einem Auto-ausgeglichenen Photoempfänger. Stecker des Ausgangssignals des Photoempfängers in ein Oszilloskop mit einem BNC-Kabel. Beachten Sie on das Oszilloskop, das an der Resonanzwellenlänge des Mikrotoroid, Übertragung durch die optische Faser fällt. </li><li> Befestigen Sie den Ausgang des Photoempfängers auf den Haupteingang des Frequenzverriegelungsrückkopplungsregler (siehe Geräteliste) über ein Kabel. </li><li> Führen Sie das Frequenzverriegelungsrückkopplungssteuerung im Autolock-Modus mit top-of-Spitzensperr mit einer Zitterfrequenz von 2 kHz und einer Amplitude von Wellenlängenschwingung von 19 fm. Empirisch setzen die Proportional-Integral-Differential-Einstellungen in der Software-Fenster unter Verwendung von Ziegler-Nichols-Regeln 14. Anmerkung: Diese Werte sind nur einmal zu Beginn aller Experimente eingestellt werden. </li><li> Auto-Lock, die Wellenlänge des Lasers auf die Resonanzwellenlänge des Mikrotoroid. Führen Sie diesen Schritt nach dem Füllen der Probenkammer. Hinweis: Wenn die Wellenlängenverschiebung zu groß ist, dann wird die Rückkopplungssteuerung wird Schloss verlieren und automatisch auf Scan-Modus, um die Resonanzwellenlänge Standort lokalisieren zu wechseln. Diese ocKöter für Wellenlängenverschiebungen größer als etwa eine Linienbreite (mindestens 600 fm für alle Systeme hier untersucht). </li><li> Aufzeichnen des Ausgangs des Rückkopplungsreglers auf 20 kHz unter Verwendung eines 24-Bit-Datenerfassungskarte. Exportieren Sie die Daten als Textdatei über Datenerfassungssoftware. </li></ol> 3. Datenverarbeitung und Analyse- <ol><li> Fourier-Transformation der Daten in MATLAB. </li><li> Low übergeben Sie die Daten mit Hilfe eines &quot;Backsteinmauer&quot; Filter mit einer Grenz bei 1 kHz, um die auferlegten Zitterfrequenz von 2 kHz zu entfernen (siehe Zusatzcodedatei Screenshot 1). </li><li> Rechnerisch Notch-Filter, die Daten mit Hilfe einer Fenstergröße von 16 Hz. Hinweis: Dies geschieht, um bekannten Quellen von Rauschen zu entfernen, in diesem Fall, elektronische Leitungsrauschen 60 Hz und deren Oberwellen, sowie 100 Hz (aus dem Lasertreiber) und ihre Oberschwingungen (siehe Zusatzcodedatei Screenshot 1). </li><li> Inverse Fourier-Transformation die Daten zurück in den Zeitbereich. </li><li> Medianfilter die Daten unter Verwendung eines FenstersGröße von 1.001 Proben (siehe Zusatzcodedatei Screenshot 2). </li><li> Finde Schritt Veränderungen in der Resonanzwellenlänge mit der Schritt-Suchalgorithmus von Kerssemakers et al. 15. </li><li> Erzeugen Histogramme der Amplitude von jedem Bindungsschritt. </li><li> Berechnen Partikelgröße unter Verwendung von Gl. (1) (siehe Diskussion). </li></ol>

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	<li>Lu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+nanoparticle+detection+using+optical+microcavities.">High sensitivity nanoparticle detection using optical microcavities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 5976-5979 (2011).</li><li>Su, J., Goldberg, A. F. G., Stoltz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+detection+of+single+nanoparticles+and+biological+molecules+using+microtoroid+optical+resonators.">Label-free detection of single nanoparticles and biological molecules using microtoroid optical resonators.</a> Light: Science and Applications. , (2016).</li><li>Knight, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single molecule biology. , (2009).</li><li>Jonsson, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+biospecific+interaction+analysis+using+surface+plasmon+resonance+and+a+sensor+chip+technology.">Real-time biospecific interaction analysis using surface plasmon resonance and a sensor chip technology.</a> BioTechniques. 11, 620-627 (1991).</li><li>Vollmer, F., Arnold, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whispering-gallery-mode+biosensing:+label-free+detection+down+to+single+molecules.">Whispering-gallery-mode biosensing: label-free detection down to single molecules.</a> Nat. Methods. 5, 591-596 (2008).</li><li>Armani, D. K., Kippenberg, T. J., Spillane, S. M., Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-Q+toroid+microcavity+on+a+chip.">Ultra-high-Q toroid microcavity on a chip.</a> Nature. 421, 925-928 (2003).</li><li>Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+microcavities.">Optical microcavities.</a> Nature. 424, 839-846 (2003).</li><li>Arnold, S., Khoshsima, M., Teraoka, I., Holler, S., Vollmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shift+of+whispering-gallery+modes+in+microspheres+by+protein+adsorption.">Shift of whispering-gallery modes in microspheres by protein adsorption.</a> Opt. Lett. 28, 272-274 (2003).</li><li>Vollmer, F., Arnold, S., Keng, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+virus+detection+from+the+reactive+shift+of+a+whispering-gallery+mode.">Single virus detection from the reactive shift of a whispering-gallery mode.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 20701-20704 (2008).</li><li>He, L., Ozdemir, S. K., Zhu, J., Kim, W., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+single+viruses+and+nanoparticles+using+whispering+gallery+microlasers.">Detecting single viruses and nanoparticles using whispering gallery microlasers.</a> Nat Nano. 6, 428-432 (2011).</li><li>Dantham, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+detection+of+single+protein+using+a+nanoplasmonic-photonic+hybrid+microcavity.">Label-free detection of single protein using a nanoplasmonic-photonic hybrid microcavity.</a> Nano Lett. 13, 3347-3351 (2013).</li><li>Baaske, M. D., Foreman, M. R., Vollmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+nucleic+acid+interactions+monitored+on+a+label-free+microcavity+biosensor+platform.">Single-molecule nucleic acid interactions monitored on a label-free microcavity biosensor platform.</a> Nat Nanotechnol. 9, 933-939 (2014).</li><li>Su, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Single+Exosome+Detection+Using+Frequency-Locked+Microtoroid+Optical+Resonators.">Label-Free Single Exosome Detection Using Frequency-Locked Microtoroid Optical Resonators.</a> ACS Photonics. (9), 1241-1245 (2015).</li><li>&#197;str&#246;m, K. J., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Feedback systems : an introduction for scientists and engineers. , (2008).</li><li>Kerssemakers, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+dynamics+of+microtubules+at+molecular+resolution.">Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution.</a> Nature. 442, 709-712 (2006).</li><li>Su, T. -. T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Label-free detection of single biological molecules using microtoroid optical resonators. , (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Als ein Teilchen gebunden ist, die Resonanzwellenlänge (λ) der Toroid zunimmt. Wenn ein Teilchen tatsächlich freigegeben wird, die Resonanzwellenlänge nimmt entsprechend ab (ein Untersetzungsereignis). Der Partikeldurchmesser (d) kann durch Histogramme der Amplitude jeder Wellenlänge Schritt bestimmt werden. Die Höhe jeder Wellenlänge Schritt variiert je nach Größenvariationen des gebundenen Teilchen und durch die Lage auf der Mikrotoroid wo das Teilchen bindet. Die maximale Änderung der Reso...

Einzelmoleküldetektion Experimente sind nützlich für die Verringerung der Menge an Analyt in Biosensoren verwendet wird, für die Früherkennung von Krankheiten und zur Untersuchung der grundlegenden Eigenschaften von Molekülen 3. Solche Experimente werden normalerweise mit den Etiketten sind jedoch Etiketten nicht immer möglich, für ein bestimmtes Protein zu erhalten, erhöhen die Kosten, können stören die Ereignisse untersucht und kann unbequem sein, insbesondere für die Echtzeit-Vor-Ort-Versuche oder Point-of- Care-Diagnostik. Der aktuelle Goldstandard für die markierungsfreien Biosensor ist die Oberflächenplasmonresonanz 4, aber die kommerziellen Oberflächenplasmonresonanz-Systeme haben in der Regel eine typische untere Nachweisgrenze in der Größenordnung von nM. In jüngster Zeit haben optische Resonatoren als vielversprechende Technologie für markierungsfreie Einzelmolekül Biodetektion 5 entstanden. Optischen Resonatoren Arbeit auf der Grundlage der langfristigen (ns) Führung von Licht 6,7. Licht ist evaneszenttypischerweise über eine optische Faser in diese Geräte gekoppelt sind. Wenn die Wellenlänge des Lichts geht durch die Faser entspricht der Resonanzwellenlänge des Resonators, Licht wirksam koppelt an den Resonator. Dieses gekoppelte Licht vollständig intern reflektiert innerhalb des Resonators Hohlraum Erzeugung eines evaneszenten Feldes in der Nähe des Umfangs des Resonators. Als Partikel in das evaneszente Feld und binden an den Resonator, der Resonanzwellenlänge des Resonators ändert sich proportional zu dem Volumen des Teilchens 8. In Bezug auf die Erfassungsfähigkeit, haben Mikrokugelresonatoren früher verwendet worden, um einzelne Influenza-A-Virus-Partikel zu erkennen (100 nm) 9,10. Kurzem plasmonically verstärkte Mikrokugel optischen Resonatoren sind verwendet worden, um einzelne Rinderserumalbuminmoleküle detektieren 11 und 8-mer Oligonukleotiden 12, aber dieser Ansatz begrenzt die Partikelfangbereich auf 0,3 &amp; mgr; m 2 pro deLaster. Größere Capture-Bereich Biosensoren sind ideal für die Maximierung der Wahrscheinlichkeit des Partikeldetektion. Aktuelle lösungsbasierten markierungsfreien Biosensor-Technologien mit großen (&gt; 100 &amp; mgr; m 2) Capture-Bereiche wurden auf die Erfassung Polystyrol-Partikel ≥ 25 nm beschränkt. Wir haben einen markierungsfreien Biosensor-System auf Basis von optischen Resonator-Technologie als Frequenzverriegelung Optical Whispering Evanescent Resonator (BLUME) 13 (Abbildung 1) bekannt, die in der Lage, zeitaufgelöste Detektion von Einzelmolekülen in Lösung entwickelt. FLOWER verwendet die lange Lebensdauer der Photonen Mikrotoroid optischen Resonatoren in Kombination mit Frequenzsperr Regelung, ausgeglichen Erkennung und Rechen Filterung, um kleine Partikel bis hin zu einzelnen Proteinmoleküle zu erkennen. Die Verwendung von Frequenzverriegelung kann das System immer verfolgen die Verschiebung Resonanz des Mikrotoroid als Teilchen zu binden, ohne die Notwendigkeit zu kehren oder Scannen der Laserwellenlänge übergroße Bereiche. Die Grundsätze der FLOWER verwendet werden, um die Erkennungsfähigkeiten von anderen Techniken, einschließlich plasmonischer Steigerung zu erhöhen. Im Folgenden werden die Verfahren für die Durchführung FLOWER beschrieben.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="396">
	<tbody>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl63" height="20" style="height:15.0pt;width:99pt" width="132">Tunable diode laser</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Newport</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">TLB-6300</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl63" height="20" style="height:15.0pt;width:99pt" width="132">Laser controller</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Newport</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">TLB-6300-LN</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl63" height="40" style="height:30.0pt;width:99pt" width="132">Frequency locking feedback controller</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Toptica Photonics</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Digilock 110</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl63" height="40" style="height:30.0pt;width:99pt" width="132">Auto-balanced photoreceiver</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Newport</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Model 2007</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl63" height="40" style="height:30.0pt;width:99pt" width="132">In-line polarization controller</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">General Photonics</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">PLC-003-S-90</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl63" height="40" style="height:30.0pt;width:99pt" width="132">24-bit data acquisition card</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">National Instruments</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">NI-PCI-4461</td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl63" height="60" style="height:45.0pt;width:99pt" width="132">Recombinant human interleukin-2</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Pierce Biotechnology</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">R201520</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl63" height="40" style="height:30.0pt;width:99pt" width="132">20 nm polystyrene beads</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Thermo Scientific</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">3020A</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl63" height="40" style="height:30.0pt;width:99pt" width="132">NanoCube XYZ Piezo Stage</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Physik Instrumente</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">P-611.3</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl63" height="20" style="height:15.0pt;width:99pt" width="132">Optical table</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Newport</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">VH3660W-OPT</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl63" height="40" style="height:30.0pt;width:99pt" width="132">Objective lens for imaging column</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Navitar Machine Vision</td>
			<td class="xl64">1-60228</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl63" height="40" style="height:30.0pt;width:99pt" width="132">Imaging column (adaptor tube)</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Navitar Machine Vision</td>
			<td class="xl65">1-60228</td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl63" height="60" style="height:45.0pt;width:99pt" width="132">High-Res CCD camera for imaging column</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Edmund Industrial Optics</td>
			<td class="xl64">NT39244</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free single molecule detection using microtoroid optical resonators

Nachweis kleiner Konzentrationen von Molekülen bis zur Einzelmolekül Grenze hat Auswirkungen auf Bereiche wie die Früherkennung von Krankheiten und grundlegenden Studien über das Verhalten von Molekülen. Einzelmoleküldetektionsverfahren verwenden üblicherweise Markierungen, wie Fluoreszenzmarkierungen oder Quantenpunkte sind jedoch nicht immer verfügbar Etiketten, erhöhen die Kosten und die Komplexität und kann stören die Ereignisse untersucht. Optischen Resonatoren als ein vielversprechendes Mittel zur Einzelmoleküle ohne Einsatz von Etiketten erfassen taucht. Derzeit kleinste durch eine nicht plasmonically verstärkte blanke optische Resonatorsystem in Lösung nachgewiesen Teilchen ein 25 nm Polystyrolkugel 1. Wir haben eine Technik, die als Frequenzverriegelung Optical Whispering Evanescent Resonator (Blume), die in wässriger Lösung 2 dieses Limit übertreffen können und erreichen markierungsfreie Einzelmoleküldetektion bekannt entwickelt. Als Signalstärke Waage mit Partikelvolumen, unsere Arbeit für eine&gt; 100x improvement im Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) über den aktuellen Stand der Technik. Hier die Verfahren hinter FLOWER werden in dem Bemühen, ihre Nutzung auf dem Gebiet erhöhen vorgestellt.

Partikelbindungsereignisse eindeutig als stufenartigen Änderungen in der Resonanzwellenlänge des Mikrotoroid über die Zeit (2A) ersichtlich. Die Höhen dieser Schritte sind als Histogramm in Figur 2B gezeigt. Die Abbildungen 2-4 zeigen repräsentative Spuren aus der Bindung von Exosomen (nanovesicles), 5 nm Silikonkügelchen, einzelne menschliche Interleukin-2-Moleküle sind. Die Tatsache, dass die stufenartigen Ereignissen Skala mit Teilchengröße zeigt, daß das V...

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Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Markierungsfreie Einzelmoleküldetektion Mit Mikrotoroid optischen Resonatoren

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.1K Aufrufe.  California Institute of Technology. We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented. 

Serie: Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

Multiplexed Einzelmolekül-Kraftspektroskopie Proteolyse Messungen mit magnetischen Pinzette

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Forschung

Biotechnik

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

Ein Cre-Lox P Rekombination Ansatz für den Nachweis von Cell Fusion In Vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Berührungslose, Label-freie Überwachung von Zellen und extrazellulären Matrix mittels Raman-Spektroskopie

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Optische Detektion von<em&gt; E. coli</em&gt; Bakterien durch Mesoporous Silicon Biosensoren

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma membrane1. To regulate neuronal excitability, the biophysical properties of ion channels are modified by signaling proteins and molecules, which often bind to the channels themselves to form a heteromeric channel complex2,3. Traditional assays examining the interaction between channels and regulatory proteins require exogenous labels that can potentially alter the protein&#39;s behavior and decrease the physiological relevance of the target, while providing little information on the time course of interactions in living cells. Optical biosensors, such as the X-BODY Biosciences BIND Scanner system, use a novel label-free technology, resonance wavelength grating (RWG) optical biosensors, to detect changes in resonant reflected light near the biosensor. This assay allows the detection of the relative change in mass within the bottom portion of living cells adherent to the biosensor surface resulting from ligand induced changes in cell adhesion and spreading, toxicity, proliferation, and changes in protein-protein interactions near the plasma membrane. RWG optical biosensors have been used to detect changes in mass near the plasma membrane of cells following activation of G protein-coupled receptors (GPCRs), receptor tyrosine kinases, and other cell surface receptors. Ligand-induced changes in ion channel-protein interactions can also be studied using this assay. In this paper, we will describe the experimental procedure used to detect the modulation of Slack-B sodium-activated potassium (KNa) channels by GPCRs.

Optical biosensor techniques can detect changes in mass near the plasma membrane in living cells and allow one to follow cellular responses in both individual cells and populations of cells. This protocol will describe detection of the modulation of potassium channels by G-protein coupled receptors in intact cells using this approach.

Verwenden von Label-freien optischen Biosensoren zur Modulation von Kaliumkanälen durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren erkennen

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipulation von RNA-Einzelmoleküle durch Optische Pinzetten

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

Einem mikrofluidischen Biochip-basierte Elektrochemische für Markierungsfreie DNA-Hybridisierungsanalyse

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

Ein Markierungsfreie Technik für die Raum-zeitliche Imaging von Single Cell Sekrete

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie auf Planar Unterstützte Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Mehrfarbenfluoreszenzdetektion für Droplet Mikrofluidik Verwendung von Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...