This article was supported by Award Number R01GM087227 from the National Institute of General Medical Sciences, the Norman Ackerman Advanced Research Program, and the Robert A. Welch foundation (Grant A-1769).

1. SPPS: CK (TMR) TATG (fTAT) Synthese Anmerkung: dfTAT wird in zwei Schritten hergestellt: Synthese des Monomers fTAT durch Festphasenpeptidsynthese, gefolgt von einer Disulfidbindung Dimerisierung dfTAT bilden. <ol><li> Quellen 500 mg Rink-Amid-MBHA-Harz in Dimethylformamid (DMF) in einem Standard-50 ml-SPPS-Gefß 1 Stunde. </li><li> Zuführen Fmoc-Abspaltung durch Inkubieren der Fmoc geschützten Harzes in einer 20% igen Piperidin-Lösung (20% Piperidin in DMF, 10 ml (0,30 mmol). Führen Entschützungsschritte zweimal (1 x 5 min und 1 x 15 min) mit einem Waschschritt mit DMF (der Waschschritt ein Spülen des Harzes mehrere Male mit einem Gesamtvolumen von etwa 150 ml DMF gelöst und das Lösungsmittel durch Vakuumfiltration) dazwischen Reaktionen. </li><li> Synthetisieren CK (TMR) RKKRRQRRRG (fTAT) auf der Rink-Amid-MBHA-Harz. Verwenden der folgenden Fmoc-geschützten Aminosäuren Fmoc-Lys (Mtt) -OH (nur am N-Terminus), Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc- Gln (Trt) -OH und Fmoc-Cys (Trt) -OH. Die Reaktion mit N 2 (20 psi), um die Reaktion zu rühren. Führen Sie alle Reaktionen bei RT. <ol><li> Führen Sie jede Aminosäure Kupplungsreaktion 4 Stunden. Für jede Kupplung Verwenden der Fmoc geschützten Aminosäure (1,2 mmol), N, N, N &#39;, N&#39; -Tetramethyl- O- (1-benzotriazol-1-yl) uroniumhexafluorphosphat (HBTU) (0,44 g, 1,1 mmol ) und Diisopropylethylamin (DIEA) (0,51 ml, 3,0 mmol) in DMF gelöst. Nach 4 Stunden Kopplung, Waschen des Harzes mit DMF und führen Sie die Fmoc Entschützungsschritt, wie in Schritt 1.2 beschrieben. </li><li> Wiederholen, bis die lineare Peptidkette fTAT (Linear Peptidkette: CKRKKRRQRRRG kein TMR) synthetisiert. </li><li> Dann waschen Harz gründlich mit ersten DMF und nach, dass mit Dichlormethan (DCM). Mit einem Gesamtvolumen von etwa 150 ml DMF oder DCM Spülen Sie den Harz mehrere Male und das Lösemittel durch Vakuumfiltration. </li><li> Use MALDI-TOF, um zu bestätigen, dass das erhaltene Peptid hat das korrekte Molekulargewicht. <ol><li> Einen Matrixmischung durch Zugabe von 1 mg Matrix zu einer Lösung von 50 ul 0,01% TFA in Wasser-Lösung und 50 ul Acetonitril besteht. </li><li> Um linearen Peptidkette Masse zu bestätigen, verwenden α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure. Führen Sie eine analytische HPLC des rohen Peptids und sammeln Sie 50 ul von der Oberseite des reinen Peak. </li><li> Um die Probe vorzubereiten, um auf der MALDI Teller Teller: In 8 ul der Peptid bis 2 &amp; mgr; l der Matrix-Lösung und auf den MALDI-Platte trocken oder auf einer 37 ° C Wärmeplatte in die Luft. Anmerkung: Arginin ist bekannt, dass eine Aminosäure schwierig Paar in SPPS sein. Erfolgreiche Kopplung durch Ausführen einer Kaiser-Test 14 (zB Ninhydrintest) etabliert. Dieser Test ermöglicht den Nachweis von freien Aminen, die auf dem Harz abgekoppelt bleiben könnten. Im Falle einer blauen Farbe festgestellt wird (Anzeichen für die Anwesenheit freier Amine), Kupplungs sTEPs werden wiederholt. </li></ol></li></ol></li><li> CK (-NH-TMR) TATG (fTAT), spalten die Mtt-Schutzgruppe an der &amp; egr; -Aminogruppe von Lys an CK (-NH-Mtt) TATG mit einer Lösung aus 1% Trifluoressigsäure (TFA) und 2% Triisopropylsilan zusammen (TIS) in DCM. <ol><li> Die Entfernung von MTT Schutzgruppe würde das Auftreten einer gelben Farbe führen, Inkubation des Harzes mit 20 ml der obigen Lösung für 5 min, wiederholen, bis keine gelbe Farbe beobachtet wird. Dazwischen das Harz mit DCM und DMF. Zusätzlich seit TIS ist ein Aasfresser, die die MTT abfangen würde, sobald keine gelbe Farbe erscheint in der Lösung in Gegenwart von MTT. </li><li> Hinzufügen eines zusätzlichen Lösung mit 1% TFA in DCM (kein TIS) zu dem Harz keine MTT mehr versichern wird entfernt und die Lösung bleibt klar. </li></ol></li><li> Lösen die drei Komponenten: Carboxytetramethylrhodamin (TMR), HBTU und DIEA (4, 3,9 und 10 Äquivalenz in Bezug auf die Menge des Harzes (in mg)) in DMF und diese Mischungzu dem Harz und die Reaktion O / N mit trockenem N 2, um Unruhe zu schaffen. </li><li> Nach der Fmoc-Entschützung und Aminosäure-Konjugation, das Harz mit DCM und trocknen lassen. Für eine vollständige Spaltung des Peptids von dem Harz, wird eine Lösung aus 92,5% TFA, 2,5% H 2 O, 2,5% TIS, 2,5% Ethandithiol (EDT) (Gesamtvolumen = 4 ml), um die Peptidyl-Harz für 3 h bei RT zur Entfernung der Schutzgruppen und Abspaltung vom Harz zu erzielen. <ol><li> Ausfällung der rohen Peptidprodukte mit kaltem wasserfreiem Ethylether (Et 2 O) durch Ablassen der Lösung aus Stufe 1.6 werden in 40 ml Et 2 O, drehen diese hinunter auf 4 ° C und 4.000 × g für 20 - 25 min. Wiederholen Sie diesen Schritt, um Waschen des Niederschlags mit kaltem wasserfreiem Et 2 O ermöglichen </li><li> Resuspendieren des Präzipitats in Wasser (5 ml, oder bis Niederschlag vollständig gelöst ist), und lyophilisiere. Dann resuspendieren in 0,1% wässriger TFA / Acetonitril erhaltenen Produkte. </li></ol></li> &lt;li&gt; Eine HPLC-Analyse mit einer analytischen C18-Säule (5 &amp; mgr; m, 4 x 150 mm), um jedes Peptid zu analysieren. Verwenden einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml / min und Detektion bei 214 nm und 550 nm. </li><li> Zuführen semipräparative HPLC auf einer C18 10 x 250 mm-Säule zur Peptidreinigung. Verwenden einer Fließgeschwindigkeit von 4 ml / min und Detektion bei 214 nm und 550 nm. Für alle Durchläufe verwenden linearen Gradienten von 0,1% wässriger TFA (Lösungsmittel A) und 90% Acetonitril, 9,9% Wasser und 0,1% TFA (Lösungsmittel B). </li><li> Bestätigen Sie die korrekte Identität der Peptide durch MALDI-TOF nach Herstellerprotokoll: fTAT, erwartete Masse: 2,041.17, beobachtete Masse: 2.040,66. DEAC-K9, erwartete Masse: 1,412.97, beobachtete Masse: 1,415.59. Verwenden ein α- Cyano-4-hydroxyzimtsäure-Matrix für den MALDI-TOF. </li></ol> 2. Oxidation: dfTAT Erstellung <ol><li> Belüften phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,4 für 1 Stunde (mindestens 5 ml für die Reaktion weiter unten). </li><li> Löse fTAT (0,3 mg, 1,5 x 10 -4 mmol) in aerATED PBS pH 7,4 (5 ml). Sicherzustellen, dass der pH-Wert zwischen 7,0 bis 7,5 nach der Zugabe des Peptids. Wenn nicht Natriumhydroxid hinzufügen (1 M, in kleinen Schritten 1-5 ul), um den pH-Wert wieder auf 7,4 zu bringen. </li><li> Anmerkung: Sauerstoff, gelöst in PBS wirkt die Thiolgruppen auf fTAT oxidieren und eine Disulfidbindung bilden. </li><li> Nutiert die Reaktion O / N, damit sie bis zum Abschluß (100% Ausbeute, basierend auf HPLC-Analyse) zu reagieren. Man reinigt das Produkt mittels Umkehrphasen-HPLC und Massenspektrometrie (MALDI-TOF) analysiert, wie in Schritt 1.9. Erwartete Masse: 4,080.34, beobachtete Masse: 4,084.21. </li><li> Lyophilisiere reinen dfTAT (0,71 x10 -4 mmol) und resuspendieren in 200 ul Wasser (Konzentration reiner dfTAT = 356,3 &amp; mgr; M). </li></ol> 3. Mess dfTAT Konzentration <ol><li> Resuspendieren eines Aliquots des gereinigten dfTAT (typischerweise 1 &amp; mgr; l in Abhängigkeit von der Menge an Peptid gereinigt) in einem 149 ul 50 mM TCEP Lösung. </li><li> Anmerkung: In diesem Schritt dfTAT in seine mo reduziertennomer Gegen fTAT um die Absorption Abschrecken, der aufgrund der großen Nähe des TMR-Fluorophor in dfTAT (der Extinktionskoeffizient ε der TMR in dfTAT wird im Vergleich zu der ε von TMR in reduzierter fTAT reduziert) zu eliminieren. </li><li> Die Probe wird für etwa 20 min reagieren (analytische HPLC kann verwendet werden, um die Bildung von fTAT bestätigen). </li><li> Hinzufügen all der Lösung auf die Quarzküvette und Messung der Absorption bei 556 nm. </li><li> Unter Verwendung des Beerschen Gesetzes (A = εcl: ε = 91.500 M -1 cm -1), um die Konzentration von fTAT berechnen, bestimmen die Konzentration von dfTAT, und teilen [fTAT] durch zwei. </li></ol> 4. Cellular Lieferung Experimente <ol><li> Pflanzensamen, die Zellen (HeLa, HDF, etc.) In einer Schale auf einer Konfluenz von 80-90% (zB 8-Well-oder 24-Well-Schale). 90% Konfluenz in einer 37 ° C - wachsen Zellen in einem geeigneten Medium, bis 80 (zB DMEM mit 10% FBS und Pen / Strep ergänzt)befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2. </li><li> Die Zellen werden dreimal (3x) mit PBS (durch Zugabe von 200 ul PBS und dann Entfernen dreimal). </li><li> Einen 5 uM Arbeitskonzentration von dfTAT durch in NRL-15 Medien Verdünnen einer Stamm der dfTAT (in Wasser) (für ein 8 gut austeilen das Gesamtvolumen sollte 200 ul sein). Eine Konzentration von 5 uM dfTAT führt zu effizienten Lieferung (hohe cytosolische Lieferung in über 90% der in einer Schale vorhanden Zellen) in den meisten auf dem neuesten Stand (Abbildung 3) getesteten Zelltypen. Jedoch können niedrigere oder höhere Konzentrationen für Zelltypen mit einem hohen oder niedrigen Neigung zum Eindringen mehr ausreichend sein. HINWEIS ÜBER DIE MEDIEN: NRL-15 ist für die Lieferung von dfTAT verwendet, da es nicht Cystein, das die Disulfidbindung in dfTAT reduzieren könnten. Jedoch zeigen unsere Daten, dass sowohl reguläre L-15 (mit Cystein) und DMEM kann als Abgabemedien verwendet werden. L-15 das Reduktions Aminosäure Cystein, aber Cystein presumab enthältly oxidiert in den Medien, um Cystin bilden (DMEM mit Cystin formuliert). dfTAT bleibt daher intakt in diesen Medien und Lieferwerk in der gleichen Effizienz wie die mit nrL15 erhalten. </li><li> Inkubieren Zellen mit dfTAT (5 &amp; mgr; M) mit oder ohne Ladung (z. B. EGFP (10 &amp; mgr; M)) und halten bei 37 ° C für 1 Stunde (Inkubationszeit reduziert, sondern dfTAT erfordert typischerweise etwa 30 bis 45 min, um die endosomale Leck induzieren ). </li><li> In L-15-Zellen zu waschen mit Heparin (1 mg / ml) (3 Waschungen werden empfohlen) zu dfTAT entfernen, um die Plasmamembran der Zellen gebunden wird. </li><li> Zellen mit Zell-undurchlässige Kernfärbung, Inkubation z. B. Sytox Blau, Sytox Green (2 uM in NRL-15), um zu bestimmen, ob die Plasmamembran der Zellen beeinträchtigt wird gemäß (toten Zellen, die während lebende Zellen werden nicht gefärbt werden) Protokoll des Herstellers. </li><li> Bildzellen mit einem Fluoreszenzmikroskop (100x Ölimmersion oder 20x-Objektiv). Bild dfTAT mit einem RFP-Filter (Ex =560 ± 20 nm / Em = 630 ± 35 nm). Anmerkung: Die erfolgreiche Bereitstellung führt zu einer diffuse Fluoreszenz dfTAT gesamten Zelle (Beurteilung der Abgabe von Protein oder Peptid von Interesse wird auf Anwendung abhängt). Färbung von Nukleoli von fTAT (das reduzierte Produkt der dfTAT auf cytosolischen Eingabe) kann als Indiz dafür, dass die nachgewiesene Fluoreszenz intrazellulär verwendet werden. fTAT wird innerhalb weniger Stunden abgebaut. Zu diesem Zeitpunkt wird die Fluoreszenz der Abbaufragmente als punktförmige angezeigt. Dies ist nicht zu verwechseln für die punktförmige Verteilung, die auch zu sehen ist, wenn dfTAT bleibt erfolglos Inneren Endosomen gefangen (dies kann passieren, wenn dfTAT bei zu niedrigen Konzentration vorhanden ist) sein. </li></ol> 5. Controling Konzentration der MOI Lieferung <ol><li> Identifizieren Sie die erforderlich ist, um eine effiziente Freisetzung von zytosolischen dfTAT in der verwendeten Zelltyp zu erreichen &quot;optimale Lieferung&quot; Konzentration. Führen Fluoreszenzmikroskopie auf Zellen mit increasin inkubiertg Konzentrationen dfTAT. Die optimale dfTAT Konzentration wird als die minimale Konzentration, die zum Löschen cytosolischen führt definierten &quot;Diffus&quot; TMR Fluoreszenz in etwa 100% der Zellen in einer Kultur. </li><li> Variiert die Konzentration des MOI in Coinkubation Protokoll verwendet, während die Konzentration von dfTAT Konstante (zB unter Verwendung von optimalen Lieferkonzentration dfTAT&#39;S). Änderung der Inkubationszeit auf weniger als 1 Stunde könnte auch eine Option, um die Menge zu variieren MOI geliefert werden. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Die zur dfTAT Lieferung verwendet wird, sollte nicht übermäßig sein konfluenten Zellen (&gt; 90% Konfluenz), da dies die Abgabeeffizienz beeinflussen könnten. Die Zellen sollten auch gesund sein: toten Zellen in der Kultur kann apoptotischen Fragmente mit dem dfTAT können (zB DNA aus degradierten Kerne) interagieren, zu lösen. Dies wiederum kann mit der Lieferung Effizienz und die Qualität der Bildgebung stören. Zellen sollten gründlich gewaschen werden, um FBS zu entfernen, bevor dfTAT. BSA vorhanden ...

Die Verabreichung von Proteinen, Peptiden oder zell undurchlässigen kleinen Molekülen in lebende Zellen ist häufig bei vielen biologischen oder biotechnologischen Anwendungen (zelluläre Bildgebung, funktionelle Assays Reprogrammierung, etc.) 1-4 wünschenswert. Vielen Lieferansätze bereits berichtet wurden, einschließlich Mikroinjektion, Elektroporation oder Verwendung von Trägermitteln (z. B. zellpenetrierenden Peptide wie TAT, Lipide) 5-7. Jede Technik hat in der Regel spezifische Vor- und Nachteile, die diese Ansätze angemessen für bestimmte Anwendungen, aber nicht für andere machen könnten. Häufige Probleme beinhalten schlechte Lieferung Effizienzen und / oder Mangel an Kontrolle, wie viel Material 8,9 geliefert, Toxizität oder nachteilige physiologische Auswirkungen 10,11, mangelnde zeitliche Kontrolle, Lieferung in wenigen Zellen, nicht aber in einer Gesamtbevölkerung (z. B. Mikroinjektion) 12, und komplexe chemische Konjugation oder Formulierungssysteme 11. s = &quot;jove_content&quot;&gt; Kürzlich haben wir einen neuen Liefer Strategie, die diese Einschränkungen umgeht entwickelt. Diese Strategie stützt sich auf ein Peptid mit dem Namen dfTAT (Dimer Fluoreszenz TAT) 13. dfTAT wird aus der gut bekannten zellpenetrierenden Peptid (CPP) TAT abgeleitet. dfTAT enthält zwei disulfidgebundenen Kopien TAT mit dem Fluorophor Tetramethylrhodamin markiert. Trotz ihrer Ähnlichkeiten, TAT und dfTAT unterscheiden sich erheblich in der Aktivität. TAT wird typischerweise durch Endozytose in die Zellen internalisiert. Das CPP bleibt jedoch meist innerhalb Endosomen gefangen (dies in der Regel auf eine punktförmige Verteilung des Peptids in Zellen führen, wenn durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht). Wie TAT wird dfTAT effizient von Zellen Endozytose. Allerdings bedeutet dfTAT nicht in Endosomen gefangen zu bleiben. Stattdessen vermittelt es endosomalen Leckage in einer Weise, die sehr effizient ist. Die endosomolytische Aktivität dfTAT können dann genutzt werden, um Makromoleküle durch eine einfache Inkubation Assay zu liefern. ntent &quot;&gt; Das aktuelle Verständnis der Lieferprozess ist wie folgt. dfTAT induziert Makropinozytose. Dadurch Zellen mit dfTAT inkubiert nehmen lösliche Proteine, Peptide oder kleine Moleküle (Moleküle von Interesse, MOI) in Medien präsent durch Flüssigkeitsphasen- Endozytose (siehe Abbildung 1). Die Wechselwirkungen zwischen dfTAT und MOI sind nicht erforderlich, solange beide Entitäten Verkehr zusammen im endocytischen. Wie dfTAT erreicht eine bestimmte Schwelle im Lumen endozytischen Organellen, ihre endosomalen Leckageaktivität (die molekularen Details ausdrückt bleiben werden vollständig charakterisiert). Der Inhalt des Lumens leaky Organellen und damit die MOI, wird dann in den Zellen freigesetzt wird. Dieser Ansatz ist daher sehr praktisch, da keine Konjugation oder Zubereitung Schemata mit MOI erforderlich. Da außerdem dfTAT ist nicht direkt Modifizieren einer MOI, sollte es auch nicht mit MOIs Funktion stören, wenn intrazelluläre Abgabe erreicht wird. Darüber hinaus ist die Konzentration vondfTAT verwendet Lieferung ist unabhängig von jenem des Innenministeriums in Medien. Zum Beispiel kann dfTAT Konzentration zwischen verschiedenen Versuchen konstant gehalten wird, um reproduzierbare Effizienzen in endosomalen Leckage zu gewährleisten. Im Gegensatz dazu kann die Konzentration des MOI in Medien allmählich geändert werden, um gewünschte Niveaus erreichen MOI in Cytosol abgegeben. Die hohe Effizienz bei der endosomalen Leck dfTAT erreicht ist bemerkens unschädlich, viele der Zellen, die bisher getestet. Das ist eine Überraschung, weil endozytischen Organellen sind wichtiger Bestandteil der Zellen und würde man erwarten, dass die dramatische Leckage durch dfTAT vermittelt würden von schädlichen Zellreaktionen begleitet werden. Doch behandelten Zellen vermehren sich mit der gleichen Geschwindigkeit wie unbehandelte Zellen und keine wesentlichen Veränderungen in ihrem Transkriptom anzuzeigen. Darüber hinaus können innerhalb von Minuten mit reproduzierbaren Abgabeeffizienzen wiederholt werden, was darauf hinweist, dass die Zellen entweder toleriert oder erholen sich von den Lieferprozess ohne Verlustihre Fähigkeit zur Endozytose oder endosomalen Leckage. Subtile zellulären Reaktionen während dfTAT Lieferung und die molekularen Details, was diese Reaktionen könnte bleiben, erkundet zu werden werden stattfinden könnte. Doch durch das hohe Wirtschaftlichkeit, Bequemlichkeit der Protokolle, und das Fehlen von Toxizität, diese Lieferansatz sofort in vielen zellbasierten Anwendungen als nützlich erweisen. Die hier angegebenen Protokollen arbeiten daran, dass diese Technologie zugänglich zu der Forschungsgemeinschaft ausgerichtet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Heparin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CAS 9041-08-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nrL15 L-15 (&#8211;) cysteine</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td></td>
			<td>Special order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-protected Amino acids</td>
			<td>Novabiochem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dfTAT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>model IXB1</td>
			<td>equipped with a heating stage maintained at 37 &#176;C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C humidified, 5% CO2 incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

delivery of proteins, peptides or cell-impermeable small molecules into live cells by incubation with the endosomolytic reagent dftat

Makromolekulare Lieferstrategien verwenden typischerweise die endozytischen Weg als Weg der zellulären Eintrag. Jedoch schränkt endosomalen Einschluß der Effizienz bei der Makromoleküle eine cytosolische Raum der Zellen einzudringen. Vor kurzem haben wir dieses Problem durch die Identifizierung der Reagenzien dfTAT, eine Disulfidbindung Dimer des Peptids TAT ​​mit dem Fluorophor Tetramethylrhodamin markiert umgangen. Wir haben eine fluoreszenzmarkierte Dimer des prototypischen zellpenetrierende Peptid (CPP) TAT dfTAT, die lebende Zellen eindringt und erreicht den cytosolischen Raum von Zellen mit einem besonders hohen Wirkungsgrad erzeugt wird. Cytosolische Lieferung dfTAT in mehreren Zelllinien, einschließlich Primärzellen erreicht. Außerdem dauert die Lieferung nicht merklich beeinträchtigen die Lebensfähigkeit der Zellen, Proliferation oder Genexpression. dfTAT können kleine Moleküle, Peptide, Antikörper, biologisch aktive Enzyme und einen Transkriptionsfaktor zu liefern. In diesem Bericht beschreiben wir die Protokolle DfTa beteiligtT-Synthese und Zell Lieferung. Die Handschrift beschreibt, wie die Menge des Proteins an das cytosolische Raum der Zellen zugeführt, indem die Menge an Protein extrazellulär verabreicht steuern. Schließlich werden die jeweiligen Einschränkungen dieser neuen Technologie und Schritte bei der Validierung Lieferung beteiligt diskutiert. Die beschriebenen Protokolle sollten für zellbasierte Assays als auch für die ex vivo-Manipulation und Reprogrammierung von Zellen extrem nützlich sein.

Um die Differenz zwischen fTAT und dfTAT beurteilen, werden HeLa-Zellen für 1 Stunde mit jedem Peptid inkubiert, um den Unterschied in ihrer zellulären Lokalisation zu bestimmen. Die Internalisierung der beiden CPP wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht. 2 zeigt, dass fTAT (20 uM) lokalisiert in einem punktförmige Verteilung. Diese Verteilung steht im Einklang mit dem Peptid noch im Gerät befindliche Endosomen eingeschlossen. Im Gegensatz dazu das Fluoreszenzsignal dfTAT (5 uM) zeigt eine h...

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Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

Lieferung von Proteinen, Peptiden oder Handy-undurchlässige kleine Moleküle in lebenden Zellen durch Inkubation mit dem endosomolytische Reagenz dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K Aufrufe.  Texas A&M University. We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky. 

Serie: Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

Herstellung von elektrochemischen DNA Biosensoren für die Reagenzienfreier Nachweis von Nukleinsäuren, Proteinen und kleinen Molekülen

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Forschung

Biotechnik

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

Live-Cell-Imaging von wandernden Zellen mit dem Ausdruck Fluoreszenz-markierten Proteinen in einer dreidimensionalen Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular choice for drug delivery applications, particularly since it is already FDA-approved for use in humans in the form of resorbable sutures. Hydrophobic and hydrophilic drugs are encapsulated in PLGA particles via single- or double-emulsion. Briefly, the drug is dissolved with polymer or emulsified with polymer in an organic phase that is then emulsified with the aqueous phase. After the solvent has evaporated, particles are washed and collected via centrifugation for lyophilization and long term storage. PLGA degrades slowly via hydrolysis in aqueous environments, and encapsulated agents are released over a period of weeks to months. Although PLGA is a material that possesses many advantages for drug delivery, reproducible formation of nanoparticles can be challenging; considerable variability is introduced by the use of different equipment, reagents batch, and precise method of emulsification. Here, we describe in great detail the formation and characterization of microparticles and nanoparticles formed by single- or double-emulsion using the emulsifying agent vitamin E-TPGS. Particle morphology and size are determined with scanning electron microscopy (SEM). We provide representative SEM images for nanoparticles produced with varying emulsifier concentration, as well as examples of imaging artifacts and failed emulsifications. This protocol can be readily adapted to use alternative emulsifiers (e.g. poly(vinyl alcohol), PVA) or solvents (e.g.&#160;dichloromethane, DCM).

We describe the production and characterization of nanoparticles and microparticles composed of poly(lactic-co-glycolic acid) using vitamin E-TPGS as an emulsifier. By varying formulation parameters such as the concentration of emulsifier, it is possible to produce nanoparticles with mean diameters ranging from 220 nm to&#160;1.98 &#181;m.

PLGA-Nanopartikel durch Einzel-oder Doppel-Emulsion mit Vitamin E-TPGS gegründet

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipulation von RNA-Einzelmoleküle durch Optische Pinzetten

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers that exist in biological fluids cannot be easily detected with mass spectrometry or immunoassays because they are present in very low concentration, are labile, and are often masked by high-abundance proteins such as albumin or immunoglobulin. Bait containing poly(N-isopropylacrylamide) (NIPAm) based nanoparticles are able to overcome these physiological barriers. In one step they are able to capture, concentrate and preserve biomarkers from body fluids. Low-molecular weight analytes enter the core of the nanoparticle and are captured by different organic chemical dyes, which act as high affinity protein baits. The nanoparticles are able to concentrate the proteins of interest by several orders of magnitude. This concentration factor is sufficient to increase the protein level such that the proteins are within the detection limit of current mass spectrometers, western blotting, and immunoassays. Nanoparticles can be incubated with a plethora of biological fluids and they are able to greatly enrich the concentration of low-molecular weight proteins and peptides while excluding albumin and other high-molecular weight proteins. Our data show that a 10,000 fold amplification in the concentration of a particular analyte can be achieved, enabling mass spectrometry and immunoassays to detect previously undetectable biomarkers.

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

Hydrogel-Nanopartikel Ernte von Plasma oder Urin zum Nachweis geringer Menge Proteine

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

In - vitro - Permeation von FITC-geladen Ferritine Über eine Ratte Blut-Hirn - Schranke: ein Modell für die Lieferung von Nanoformulated Moleküle zu studieren

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors within the medium to control cell behavior. However, soluble additions cannot mimic certain signaling motifs, such as matrix-bound growth factors, cell-cell signaling, and spatial biochemical cues, which are common influences on cells. Furthermore, biophysical properties of the matrix, such as substrate stiffness, play important roles in cell fate, which is not easily manipulated using conventional cell culturing practices. In this method, we describe a straightforward protocol to provide patterned bioactive proteins on synthetic polyethylene glycol (PEG) hydrogels using photochemistry. This platform allows for the independent control of substrate stiffness and spatial biochemical cues. These hydrogels can achieve a large range of physiologically relevant stiffness values. Additionally, the surfaces of these hydrogels can be photopatterned with bioactive peptides or proteins via thiol-ene click chemistry reactions. These methods have been optimized to retain protein function after surface immobilization. This is a versatile protocol that can be applied to any protein or peptide of interest to create a variety of patterns. Finally, cells seeded onto the surfaces of these bioactive hydrogels can be monitored over time as they respond to spatially specific signals.

In this method, we use photopolymerization and click chemistry techniques to create protein or peptide patterns on the surface of polyethylene glycol (PEG) hydrogels, providing immobilized bioactive signals for the study of cellular responses in vitro.

Musterung bioaktive Proteine oder Peptide auf Hydrogel mit Photochemie für biologische Anwendungen

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

Entwicklung von mikrofluidischen Geräten um die Dehnung Fähigkeit der Spitze wachsenden Pflanzenzellen in sehr kleinen Räumen zu studieren

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all variations are based on the 20 canonical amino acids (cAAs). As a way to introduce additional physicochemical properties into polypeptides, the incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) is increasingly used in protein engineering. Due to their relatively short length, the modification of ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides by ncAAs is particularly attractive. New functionalities and chemical handles can be generated by specific modifications of individual residues. The selective pressure incorporation (SPI) method utilizes auxotrophic host strains that are deprived of an essential amino acid in chemically defined growth media. Several structurally and chemically similar amino acid analogs can then be activated by the corresponding aminoacyl-tRNA synthetase and provide residue-specific cAA(s) &#8594; ncAA(s) substitutions in the target peptide or protein sequence. Although, in the context of the SPI method, ncAAs are also incorporated into the host proteome during the phase of recombinant gene expression, the majority of the cell&#39;s resources are assigned to the expression of the target gene. This enables efficient residue-specific incorporation of ncAAs often accompanied with high amounts of modified target. The presented work describes the in vivo incorporation of six proline analogs into the antimicrobial peptide nisin, a lantibiotic naturally produced by Lactococcus lactis. Antimicrobial properties of nisin can be changed and further expanded during its fermentation and expression in auxotrophic Escherichia coli strains in defined growth media. Thereby, the effects of residue-specific replacement of cAAs with ncAAs can deliver changes in antimicrobial activity and specificity. Antimicrobial activity assays and fluorescence microscopy are used to test the new nisin variants for growth inhibition of a Gram-positive Lactococcus lactis indicator strain. Mass spectroscopy is used to confirm ncAA incorporation in bioactive nisin variants.

The protocol presents the Escherichia coli-based selective pressure incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) into the lactococcal antimicrobial peptide nisin. Its properties can be changed during recombinant expression via substitution with desired ncAAs in defined growth media. Resulting changes in bioactivity are mapped by growth inhibition assays and fluorescence microscopy.

Antimikrobielle Peptide produziert durch Selektionsdruck Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different infectious diseases. In this article we demonstrate a method to produce a SAPN core containing a six-helix bundle (SHB) assembly that is capable of presenting antigens in a trimeric conformation. We describe the expression of the SHB-SAPN in an E. coli system, as well as the necessary protein purification steps. We included an isopropanol wash step to reduce the residual bacterial lipopolysaccharide. As an indication of the protein identity and purity, the protein reacted with known monoclonal antibodies in Western blot analyses. After refolding, the size of the particles fell in the expected range (20 to 100 nm), which was confirmed by dynamic light scattering, nanoparticle tracking analysis, and transmission electron microscopy. The methodology described here is optimized for the SHB-SAPN, however, with only slight modifications it can be applied to other SAPN constructs. This method is also easily transferable to large scale production for GMP manufacturing for human vaccines.

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

A detailed method is provided here describing the purification, refolding, and characterization of self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) for use in vaccine development.

Herstellung von E. coli-exprimierenden selbstmontierenden Protein-Nanopartikeln für Impfstoffe, die eine trimerische Epitop-Präsentation erfordern

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...