The scientific advice of Drs. Timothy McMahon and Siqing Shan is appreciated. The presenters thank Drs. David Kirsch and Patricia Steeg for the generous gift of the fluorescently labeled Mouse Sarcoma and metastatic MDAMB-231 cells, respectively. This work was funded in part by the U.S. Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Prime Award Number N66001-10-C-2134, and in part by the Department of Radiation Oncology, Duke University Medical Center.

HINWEIS: Alle in diesem Protokoll beschriebenen tierbezogenen Verfahren sind zuvor von der Duke University Institutional Animal Care und Verwenden Committee (DUIACUC) genehmigt worden. 1. Cancer Cell, Kultur und Einspritzung <ol><li> Pflegen fluoreszenzmarkierten metastasiertem Krebszellen (zB menschliche MDAMB231-GFP-Brustkrebszellen, Geschenk von Dr. Patricia Steeg, NCI und YFP-markierten Maus-Sarkom-Zellen, Geschenk von Dr. David Kirsch, Duke University Medical Center, Abteilung für Radioonkologie) in geeigneten Kulturmedium (zB Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin / Streptavidin) bei 37 ° C, bis ca. 90% konfluent. </li><li> Trypsinieren Zellen, waschen Sie sie 2-mal mit PBS, zählen, und dann spritzen sie in die Schwanzvenen von Isofluran betäubt 10 Wochen alte weibliche Nacktratten bei 5.000.000 Zellen pro Tier, mit einer Spritze mit einer 27 G-Nadel. Chirurgische Ebene anesthesIA wird durch das Fehlen einer Reaktion auf Zehenklemm verifiziert. </li></ol> 2. Überwachung von Metastasen Mit MicroCT <ol><li> Untersuchen Ratten einmal wöchentlich mit einem Mikro-CT / Mikro Irradiator, um das Vorhandensein von Metastasen über etwa 2 mm im Durchmesser im Durchmesser zu erfassen. Die Mikro-CT wird in Betrieb genommen, wie zuvor beschrieben 12. <ol><li> Betreff Ratten zu 3% Isofluran-Narkose vor der Bildgebung. Bestätigen tiefer Narkose durch toe Prise. </li><li> Nach Beginn der Anästhesie, schnell Ratten übertragen, um die Abbildungsaufnahmevorrichtung in der Abbildungskammer und schließen über ein Nasenkegel auf eine Isofluran-Luft-Gemisch bei 2,5 bis 3%. Stellen Sie die Position der Ratte in der Wiege in einer Weise, die ihre Brustkorb wird in der Photonenstrahl der MicroCT Scanner positioniert, mit den externen Positionskontrollen und Lasertrennzeichen auf dem Imaging-Docking-Station. Stellen Sie sicher, die Tür zum Imaging-Kammer geschlossen ist, um die Ermittler von den Gammastrahlen abzuschirmen. </li><li> Kontrollieren Sie die Position des Tieres wieder mitDie Farbvideokamera. Führen Sie eine niedrig auflösende CT-Bildgebung Testlauf, und verwenden Sie das resultierende Bild, um das Sichtfeld auf die xyz Abmessungen der Brusthöhle ein. </li><li> Bild der Ratte Thorax mit einer 2 mm Al-Filter bei 40 kVp, 2,5 mA und 0,008 Voxel bei 7 FPS und senden Sie das Tier in seinen Käfig. Imaging von einem Tier sollte nicht mehr als 15 oder 20 Minuten dauern. Sie ein Tier, das der Operation an die Firma von anderen Tieren unterzogen wurde, bis vollständig erholt nicht zurück. Sie ein Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis er wieder zu sich kam, um ausreichende Brustlage zu halten. </li><li> Bestätigen Metastasen durch das Auftreten von relativ strahlenundurchlässige Objekte, die nicht durch intrathorakale Blutgefäße erklärt werden kann (1A) </li></ol></li></ol> 3. Fenster Kammerchirurgie <ol><li> Anästhesie, Vitalzeichen und Schwanzvenenkatheter <ol><li> Wählen Tiere mit Vorhandensein von Metastasen. Injizieren Tieres mit einer intraperitonealen dose von 50 mg / kg Pentobarbital. Bestätigen Operationsebene Anästhesie durch toe Prise bevor Sie fortfahren. Hinweis: Anästhesie-Protokolle sollten auf den jeweiligen Versuchsaufbau angepasst werden. Pentobarbital wurde hier als ein lang wirkendes Narkosemittel gewählt, um die tiefe Narkose für langwierige Verfahren zu induzieren, und bietet die Möglichkeit, einfache Wieder Dosierung. , Ist der Verlust der Tiere eine Überdosierung ist jedoch ein allgemeines Problem mit Pentobarbital Narkose. Eine weitere Option, die autonomen Reflexe in einem größeren Ausmaß als Pentobarbital bewahrt wird Ketamin in Kombination mit Sedativa wie Xylazin oder Medetomidin, die jedoch erlaubt nur bei einem einzigen Wiederdosierungszyklus. </li><li> Rasur Tiere auf der Seite des Körpers, die den metastatischen Krankheit hat, und im Halsbereich, mit einer Schermaschine. Wischen Sie alle verbleibenden losen Haare aus der Haut. Nach lose Haare entfernt wird, gelten Tier Salbe für die Augen, um sie vor dem Austrocknen zu schützen. HINWEIS: athymischen Nacktratten können Rest Haar, das requi habenres Entfernung vor mit chirurgischen Verfahren fortfahren. Es ist sehr wichtig, um alle Haare gründlich zu entfernen, wie es mit chirurgischen Verfahren und Bildgebung stören. </li><li> Befestigen Sie das Tier in Rückenlage auf einer Metallplatte, die auf einem 37 ° C Wasserbad zirkuliert Heizkissen platziert wird. Die vorderen und hinteren Enden an der Platte mit Klebeband befestigt. HINWEIS: Es ist sinnvoll zu steuern und aufzeichnen Vitalfunktionen, wie Herzfrequenz und arterieller Sauerstoffsättigung des Blutes mit Hilfe eines Pulsoximeter, im gesamten chirurgischen und experimentellen Verfahren. </li></ol></li><li> Intubation <ol><li> Um einen Katheter zur Belüftung des behandelten Tieres, zuerst eine transversale zervikalen Hautinzision, gefolgt von der mittleren Trennung der Längsmuskulatur ventral der Trachea. </li><li> Verwenden Sie ein wiederholtes Öffnen-to-Schließvorgang mit einem scharfen Zange, einen Durchgang für das Nahtmaterial durch die dorsale Seite der Luftröhre zu schaffen. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt in die Luftröhre auf T-er ventralen Seite, nicht mehr als halbkreisförmige, etwa zwischen dem zweiten und dritten Trachealring. Lassen Sie eine ausreichend lange Teil der Luftröhre auf der dorsalen Oberfläche freigelegt, um die Fixierung des Luftröhrenkatheter zu ermöglichen. </li><li> Legen Sie eine 2,5 bis 3,0 mm &quot;Y&quot; Trachealkanüle in die Luftröhre, und ziehen Sie sie mit einem 4-0 Monofilamentnaht. Sicherstellen, dass die Kanüle an eine druckgeregelte Ventilator mit einer Flasche zum Ablaufkanal, der mit 6 cm Wasser gefüllt ist verbunden, um positive Lungendruck aufrechtzuerhalten. Einströmende Gas sollte 100% Sauerstoff, es sei denn experimentell anders gewünscht. </li><li> Legen eines Katheters mit einem 25-27 G Nadel und mit heparinisierter Kochsalzlösung gefüllt in eine der Schwanzvenen von Ratten, und befestigen mit Klebeband. HINWEIS: Stellen Sie sicher, Durchgängigkeit der Schwanzvenenkatheter während des gesamten Verfahrens durch mehrmaliges Einspritzen einer kleinen Menge heparinisierter Kochsalzlösung in die Schwanzvene. Auch oro-Intubation, dh die Führung eines LuftröhrenRohr über der Mündung des betäubten Tieres und an der Kehlkopf in die Luftröhre, ist eine mögliche Alternative zur Tracheotomie Verfahren, die hier beschrieben wird. Jedoch erfordert dieses Verfahren eine spezielle Ausbildung und Erfahrung, um eine Beschädigung der Luftröhre zu verhindern, und auch um die versehentliche Kanülierung der Speiseröhre zu verhindern. </li></ol></li><li> Die Anwendung der Lungenfenster <ol><li> Entfernen Sie die Haut von der Seite der Brust, wo der metastasierten Erkrankung befindet, indem Sie einen Schnitt, und dann Abtrennen der Haut mit stumpfer Präparation. Hinweis: Die Haut kann ausgeschnitten und entfernt im Anschluss an Ablösung werden </li><li> Gehen Sie durch Sezieren der zwei Schichten überlagern Muskulatur (pectoralis, serratus und Latissimus), jedoch den Zwischenrippenmuskeln intakt. Erstellen einer Perforation in den Brustraum von ungefähr 1,5 cm im Durchmesser, durch Entfernen von Abschnitten der in der Regel zwei benachbarten Rippen. Idealerweise suchen Sie die Perforation in der Region des sechsten und siebten ribs. </li><li> Osteotomie: <ol><li> Um Blutungen und Schäden an der Lungenoberfläche zu minimieren, fest halten die Rippe während des Schneidens mit einer Zahn chirurgische Zange geschnitten werden. Verwendung von chirurgischen Scheren, schneiden die mediale Seite des ersten Rippe unter einem Winkel von etwa 45 °, so dass die spitze Seite der verbleibenden Rippenknochen draußen zeigt. </li><li> Anschließend schneiden die lateralen Seite der Rippenknochen in einer ähnlichen Weise wieder Verlassen der spitzen Seite der Rippenknochen nach außen zeigen, um Schäden an der Lungenoberfläche zu verhindern. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang für die benachbarten Rippe, dann schneiden Sie die Zwischenrippenmuskeln und entfernen Sie das Stück herausgeschnitten. Während dieses Vorgangs halten Lungendruck in einer Weise, daß die mechanische Wechselwirkung zwischen der Lungenoberfläche und dem Brustkorb, minimiert. Tun Sie dies durch entsprechende Regelung Inspiration Druck auf den Ventilator. </li></ol></li><li> Einsetzen des Fensters: <ol><li> Legen Sie eine maßgeschneiderte Lungenfenster, bestehend aus einem Deckglas, das istauf einer Plexiglas Buchse (1B) befestigt ist. Befestigen des Fensters an der Buchse durch Kleben, oder durch Aufbringen einer sehr kleinen Menge an Vakuumfett. Legen Sie die Fenster so, dass Oberflächenmetastasen sind in der Nähe der Mitte des Fensters. Passen Sie bei Bedarf die eingelegte Loch, um die Mikrometastasen in die Mitte des Fensters durch eine Vergrößerung der Bohrung leicht auf der jeweiligen Seite zu bringen. HINWEIS: Metastasen auf der Pleuraoberfläche als deutlich erkennbare weiße Punkte oder Bereiche innerhalb der ansonsten rosa-lachsfarben gesunden Teile der Lungenoberfläche, die vorwiegend entlang der Risse erscheinen identifiziert werden. Während Mikro sich an anderen Bereichen der pleuralen außen auftreten, die untersuchten Zelllinien fast immer angezeigt Oberflächenmikrometastasen im perforierten Bereich, einmal Metastasen röntgenologisch festgestellt werden kann. </li><li> Nach dem Einlegen der Buchse in die Perforation und das Erstellen direktem Kontakt mit der Pleura des lung, Naht die Kanten des Fensterrahmens an das umgebende Interkostalmuskel, unter Verwendung von 4,0 Monofilamentnahtmaterial (Abbildung 1C). Verwenden Sie einen leichten Anstieg der Inspiration Druck auf das Beatmungsgerät an Restluft zu helfen, zu entkommen und um eine Dichtung zu schaffen. Anmerkung: Die Atmungsrate von Ratten kann stark variieren, abhängig von dem Zustand der Anästhesie, Status der Erregung oder Angst, die Sauerstoffkonzentration des eingeatmeten Luft (FiO 2), usw. Es ist empfehlenswert, die Atmungsrate zwischen 70 und 90 bpm einzustellen. Die Inspiration Druck sollte mit Vorsicht eingestellt werden und nicht mehr als ca. eingestellt werden. 8 cm H 2 O (0,6 mmHg), um Schäden an der Lungenoberfläche zu vermeiden. </li></ol></li><li> Die Position des Tieres in einer speziell entworfenen Rückhalter dafür ausgelegt ist, Z-Richtungsbewegung (1D) auf einer Stahlplatte, die auf einem thermo (elektrische) Heizdecke positioniert zu beseitigen, unter einem Fluoreszenzmikroskop. Steuern Sie den Körper des TieresTemperatur unter Verwendung eines rektalen Thermistor. Passen die Schrauben des Tieres Rückhalter und der Inspirationsdruck an dem Beatmungsgerät eine optimale Steuerung der Querbewegung zu erzielen. Hinweis: Natürliche Atmung in Säugetieren umfasst alle drei Richtungen der Lungenbewegung und Brust-Erweiterung: bilaterale, dorsoventralen und kraniokaudale. Um den natürlichen Atembewegung so weit wie möglich zu erhalten, ist es wichtig, in Z-Richtung Kompression auf das notwendige Maß zu minimieren. Weil die Z-Dimensionszwang hat das Potential, um Artefakte, die den Blutfluss und andere Parameter beeinträchtigt, ist es ratsam, die Bedingungen während der Serie von wiederholten Messungen im gleichen Tier konstant zu halten. </li></ol></li></ol> 4. Bildgebung und Messung von Mikrozirkulationsblutfluss <ol><li> Sammeln roter Blutkörperchen durch Herzpunktion und beschriften mit Dil (1,1 = -dioctadecyl-3,3,3 =, 3 = Tetramethyl-Indocarbocyanin Perchlorat), wie zuvor beschrieben &lt;sup&gt; 10. </li><li> Injizieren 300 ul markierte rote Blutzellen in die Schwanzvene der Ratte vor der Fensterkammer Operation durchgeführt wird, um erste Durchgang Adhäsionseffekte das Glasfenster zu vermeiden. Beseitigen Sie alle Luftblasen in der Spritze oder eines Katheters, wie Einführung von Luft in die Vene werden weitere Injektionen zu hemmen. </li><li> Bildblutung mit einem Mikroskop-CCD-Kamera bei -40ºC Chip Kühltemperatur und ungefähr 100facher Gesamtauflösung (dh mit einem 10x Mikroskopobjektiv und 10X vorgeKameraAugen). Verwenden Sie Standard-Rhodamin / TRITC Filtersätze (Anregung 450 bis 490 nm, Emission&gt; 515 nm). Notieren Sie sich die tatsächliche Bildrate und Pixelauflösung der resultierenden Bildsequenzen. Nehmen Sie mindestens 200 (im Idealfall rund 300) Bilder pro Stapel, erfolgreiche Analyse der Strömungsgeschwindigkeit zu gewährleisten. </li><li> Aufzufüllen Fluidverlust in dem Tier durch Injektion von etwa 1 ml Salzlösung ip jeden hr. HINWEIS: Experimentelle Einstellungen, eine Intervention beinhalten, wie zBein Medikament, das die Blutströmungsgeschwindigkeit in einem Lungen Krebsmetastase ändert, erfordert die wiederholte Messungen der Blutströmungsgeschwindigkeit in der Lungenmetastasenkrebs. Für diesen erweiterten Experimenten, ist es wichtig, um das Tier mit ausreichend Flüssigkeit aufzufüllen. </li><li> Euthanize die Tiere durch Infusion von 3 ml 3N KCl in die Schwanzvene </li><li> Werten Sie die Bildstapeln mit Hilfe eines veröffentlichten öffentlich zugängliche Matlab-basierten Computer-Algorithmus, schaffen Strömungsgeschwindigkeit Graustufen- und Farb codierte Karten für alle Blutfluss Spuren 10,11. Anschließend werten die resultierenden Graustufenbilder unter Verwendung gewerblicher oder öffentlich zugängliche Bildanalyse-Software, wie zum Beispiel Bild J nach Schwellen off-Werte, die keine Bewegung der Blutzellen anzugeben, dh keine aktiven Gefäßsystem. </li></ol>

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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+theophylline+and+endothelin+receptor+antagonism+improves+exercise+performance+of+rats+under+simulated+high+altitude.">The combination of theophylline and endothelin receptor antagonism improves exercise performance of rats under simulated high altitude.</a> Journal of applied physiology. 113, 1243-1252 (2012).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Es wird ein Modell vorgestellt, das möglich ist, Bild Veränderungen in der Mikrozirkulation Blutfluss und andere dynamische Prozesse in Lungenmetastasen von Ratten, mit Intravitalmikroskopie und Computerblutfluss-Analyse ist. Während andere Methoden gibt, um die Mikroskopie an exponierten Lunge in offenen Brustkorb von Nagetieren durchzuführen, ist auch dieses Modell die erste Bildlungenmetastasen durch eine Brustwand Perforation in einem geschlossenen Brust-Einstellung. Mit dieser Methode wird die Machbarkeit gezei...

The lung is one of the most important target organs of metastatic disease, and because this condition is difficult to treat successfully with chemo- and radiation therapy, a cure is still rare1,2. Specific pathophysiological and microcirculatory features of solid primary and metastatic tumors, such as microregional hypoxia, diffusion limitation and inefficient tumor vasculature, greatly contribute to their resistance to anticancer treatment3,4. Due to the microscopic scale and dynamic nature of parameters such as microvascular blood flow, intravital microscopy of the tumor in the living animal has become a very important research tool in the field5. While intravital microscopy models have been applied to tumors in different organ sites, including the metastatic lung within an open rib cage, no protocol has been developed yet for the research of pulmonary metastases in a physiologically preserving, closed-chest environment6,7. Such an endeavor is particularly hampered by the necessity to surgically access the rib cage without affecting the overall function of the lung7-9. Recently, a method was introduced to image pulmonary microcirculatory blood flow in a close-chest setting in live rats, using fluorescence intravital microscopy10. This protocol enables the systematic quantification of blood flow velocity from injected, fluorescently labeled red blood cells, using computerized analysis, while keeping the animal physiologically stable and preserving the integrity of the lung11. In this present study, it is shown how this technology can be modified to image and quantify microcirculatory blood flow in tail vein-inoculated pulmonary metastases on the pleural surface in the immunocompromised rat. This model is also the first one to study metastatic lung tumors in a closed-chest intravital microscopy setting.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Athymic nude rats</td>
			<td style="width:71px;">Charles River</td>
			<td style="width:119px;">Strain code 316</td>
			<td style="width:167px;">Female 10 week-old athymic nude rats</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">micro-CT/micro-Irradiator&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Precision X-ray Inc.</td>
			<td style="width:119px;">Xrad 225Cx</td>
			<td>Use MicroCT to detect metastases</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DiI (1,1=-dioctadecyl-3,3,3=,3=-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">468495-100MG</td>
			<td>Mix 100 ul packed red blood cells with 100 ul of 0.5 mg/ml DiI in 200 proof ethanol, 2 ml of 5% dextrose solution in water, and fill up to a 10-ml final volume with saline</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Rodent ventilator</td>
			<td style="width:71px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:119px;">TOPO Small Animal Ventilator</td>
			<td>Device is important to maintain positive lung pressure after application of pneumothorax</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Zeiss Axioskop fluorescence microscope upright</td>
			<td style="width:71px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">Axioskop</td>
			<td>Microscope for intravital imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Andor CCD camera</td>
			<td style="width:71px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;">iXonEM 885</td>
			<td>CCD camera for live imaging of blood flow</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pulse oximeter</td>
			<td style="width:71px;">StarrLife</td>
			<td style="width:119px;">MouseOx</td>
			<td>Pulse oximeter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:71px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">Axioskop</td>
			<td>Fluorescence microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated measurement of microcirculatory blood flow velocity in pulmonary metastases of rats

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. However, very few methods exist to date to investigate lung metastases in a dynamic fashion at the microcirculatory level, due to the difficulty to access the lung with a microscope. Here, an intravital microscopy method is presented to functionally image and quantify the microcirculation of superficial pulmonary metastases in rats, using a closed-chest pulmonary window and automated analysis of blood flow velocity and direction. The utility of this method is demonstrated to measure increases in blood flow velocity in response to pharmacological intervention, and to image the well-known tortuous vasculature of solid tumors. This is the first demonstration of intravital microscopy on pulmonary metastases in a closed-chest model. Because of its minimized invasiveness, as well as due to its relative ease and practicality, this technology has the potential to experience widespread use in laboratories that specialize on pulmonary tumor research.

Das Gefäßsystem in soliden Tumoren ist bekannt, dass von den normalen Blutversorgung signifikant und zeigt höhere Grade der Tortuosität und höhere intervaskulären Distanzen 13. Dementsprechend Blutfließspuren in der experimentellen Lungen Brustkrebs und Metastasen Sarkom unregelmäßige Formen und große intervaskulären Lücken (2A, unteren zwei Platten) im Vergleich zu der normalen pulmonalen Mikrozirkulation (2A, oberes Feld). In einer vorherigen Studie wurde die F?...

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Automated Measurement of Microcirculatory Blood Flow Velocity in Pulmonary Metastases of Rats

A method is presented to measure microcirculatory blood flow velocity in pulmonary cancer metastases of the pleural surface in rats in an automated fashion, using closed-chest pulmonary intravital microscopy. This model has potential to be used as a widespread tool to perform physiologic research on pulmonary metastases in rodents.

Automatisierte Messung der Mikrozirkulation Blutflußgeschwindigkeit in Lungenmetastasen von Ratten

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. ...

automated-measurement-microcirculatory-blood-flow-velocity-pulmonary

Research

JoVE Journal

Medicine

8.4K Aufrufe.  Duke University Medical Center. A method is presented to measure microcirculatory blood flow velocity in pulmonary cancer metastases of the pleural surface in rats in an automated fashion, using closed-chest pulmonary intravital microscopy. This model has potential to be used as a widespread tool to perform physiologic research on pulmonary metastases in rodents.

Serie: Automated Measurement of Microcirculatory Blood Flow Velocity in Pulmonary Metastases of Rats

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly hydrated, forming a substantial endothelial surface layer (ESL) that contributes to the maintenance of endothelial function. As the endothelial glycocalyx is often aberrant in vitro and is lost during standard tissue fixation techniques, study of the ESL requires use of intravital microscopy. To best approximate the complex physiology of the alveolar microvasculature, pulmonary intravital imaging is ideally performed on a freely-moving lung. These preparations, however, typically suffer from extensive motion artifact. We demonstrate how closed-chest intravital microscopy of a freely-moving mouse lung can be used to measure glycocalyx integrity via ESL exclusion of fluorescently-labeled high molecular weight dextrans from the endothelial surface. This non-recovery surgical technique, which requires simultaneous brightfield and fluorescent imaging of the mouse lung, allows for longitudinal observation of the subpleural microvasculature without evidence of inducing confounding lung injury.

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx/endothelial surface layer is ideally studied using intravital microscopy. Intravital microscopy is technically challenging in a moving organ such as the lung. We demonstrate how simultaneous brightfield and fluorescent microscopy may be used to estimate endothelial surface layer thickness in a freely-moving in vivo mouse lung.

In vivo Messung der Maus Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

Forschung

Medizin

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered perfusion can aid research into the mechanisms of retinal pathologies. Intravital video microscopy of fluorescent tracers can be used to measure vascular diameters and bloodstream velocities of the retinal vasculature, specifically the arterioles branching from the central retinal artery and of the venules leading into the central retinal vein. Blood flow rates can be calculated from the diameters and velocities, with the summation of arteriolar flow, and separately venular flow, providing values of total retinal blood flow. This paper and associated video describe the methods for applying this technique to mice, which includes 1) the preparation of the eye for intravital microscopy of the anesthetized animal, 2) the intravenous infusion of fluorescent microspheres to measure bloodstream velocity, 3) the intravenous infusion of a high molecular weight fluorescent dextran, to aid the microscopic visualization of the retinal microvasculature, 4) the use of a digital microscope camera to obtain videos of the perfused retina, and 5) the use of image processing software to analyze the video. The same techniques can be used for measuring retinal blood flow rates in rats.

Intravital microscopy can be used in animals to visualize and measure retinal vascular diameters, bloodstream velocities, and total retinal blood flow.

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1). Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs(2). However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients(6), but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill&#8217;s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson&#8217;s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.

The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.

Automatisierte Messung von Lungenemphysem und Klein Airway Remodeling im Zigarettenrauch ausgesetzten Mäuse

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

Increasing Pulmonary Artery Pulsatile Flow Improves Hypoxic Pulmonary Hypertension in Piglets

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a disease affecting distal pulmonary arteries (PA). These arteries are deformed, leading to right ventricular failure. Current treatments are limited. Physiologically, pulsatile blood flow is detrimental to the vasculature. In response to sustained pulsatile stress, vessels release nitric oxide (NO) to induce vasodilation for self-protection. Based on this observation, this study developed a protocol to assess whether an artificial pulmonary pulsatile blood flow could induce an NO-dependent decrease in pulmonary artery pressure. One group of piglets was exposed to chronic hypoxia for 3 weeks and compared to a control group of piglets. Once a week, the piglets underwent echocardiography to assess PAH severity. At the end of hypoxia exposure, the piglets were subjected to a pulsatile protocol using a pulsatile catheter. After being anesthetized and prepared for surgery, the jugular vein of the piglet was isolated and the catheter was introduced through the right atrium, the right ventricle and the pulmonary artery, under radioscopic control. Pulmonary artery pressure (PAP) was measured before (T0), immediately after (T1) and 30 min after (T2) the pulsatile protocol. It was demonstrated that this pulsatile protocol is a safe and efficient method of inducing a significant reduction in mean PAP via an NO-dependent mechanism. These data open up new avenues for the clinical management of PAH.

Pulmonary hypertension is associated with a significant reduction in pulmonary artery pulsatility, contractility and elasticity, contributing to an increase in pulmonary artery pressure and pulmonary resistance. Using a hypoxic piglet model, this study demonstrated that improving pulmonary artery plasticity using a newly developed pulsatile catheter improves hypoxic pulmonary hypertension.

Zunehmende Lungenarterie Pulsatile Flow verbessert hypoxische Lungenbluthochdruck in Ferkel

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a disease affecting distal pulmonary arteries (PA). These arteries are deformed, leading to right ventricular ...

Transcutaneous Microcirculatory Imaging in Preterm Neonates

Microcirculatory imaging (MI) is a relatively new research tool mainly used in the intensive care setting. MI provides a clear view of the smallest capillaries, arterioles and venules. The magnifying effect visualizes the flow pattern of erythrocytes through these vessels.
It's non-invasive character makes it suitable to apply in (preterm) neonates, even in cardiorespiratory unstable patients. In adults and children, MI is mainly performed sublingually, but this is not possible in preterm infants as these cannot cooperate and the size of the probe is problematic. In preterm infants, MI is therefore performed transcutaneously. Their thin skin makes it possible to obtain high quality images of peripheral microcirculation. 
In this manuscript we will demonstrate the method of transcutaneous MI in preterm infants. We will focus on the different techniques and provide tips to optimize image quality. The highlights of software settings, safety and offline analysis are also addressed.

Microcirculatory imaging (MI) is used to monitor peripheral perfusion in critically ill or preterm neonates. This manuscript and video demonstrates the optimal approach for obtaining high-quality images.

Transkutane Mikrozirkulatorische Imaging in Frühgeborenen

Microcirculatory imaging (MI) is a relatively new research tool mainly used in the intensive care setting. MI provides a clear view of the smallest ...

A Model of Cardiac Remodeling Through Constriction of the Abdominal Aorta in Rats

Heart failure is one of the leading causes of death worldwide. It is a complex clinical syndromethat includes fatigue, dyspnea, exercise intolerance, and fluid retention. Changes in myocardial structure, electrical conduction, and energy metabolism develop with heart failure, leading to contractile dysfunction, increased risk of arrhythmias, and sudden death. Hypertensive heart disease is one of the key contributing factors of cardiac remodeling associated with heart failure. The most commonly-used animal model mimicking hypertensive heart disease is created via surgical interventions, such as by narrowing the aorta. Abdominal aortic constriction is a useful experimental technique to induce a pressure overload, which leads to heart failure. The surgery can be easily performed, without the need for chest opening or mechanical ventilation. Abdominal aortic constriction-induced cardiac pathology progresses gradually, making this model relevant to clinical hypertensive heart failure. Cardiac injury and remodeling can be observed 10 weeks after the surgery. The method described here provides a simple and effective approach to produce a hypertensive heart disease animal model that is suitable for studying disease mechanisms and for testing novel therapeutics.

A rat model of abdominal aortic constriction that induces cardiac hypertrophy and remodeling is described. An efficient, highly-reproducible, and minimally-invasive method is used to provide a simple yet useful platform for research in myocardial hypertrophy and dysfunction.

Ein Modell der kardialen Remodeling Durch Zusammenziehen der Bauchaorta bei Ratten

Heart failure is one of the leading causes of death worldwide. It is a complex clinical syndromethat includes fatigue, dyspnea, exercise intolerance, and ...

Simultaneous Electrocardiography Recording and Invasive Blood Pressure Measurement in Rats

For studies related to cardiovascular physiology or pathophysiology, blood pressure (BP) and electrocardiography are basic observational parameters. Research focusing on cardiovascular disease models, potential cardiovascular therapeutic targets or pharmaceutical agents requires assessment of systemic arterial pressure and heart rhythm changes. In situations where radio telemetry systems are not available or affordable, the technique of femoral artery cannulation is an alternative way to obtain intra-arterial pressure waveform recordings and systemic BP measurements. This technique is economical and can be performed with standard equipment in animal facilities. However, invasive arterial pressure recording requires cannulation of small arteries, which can be a challenging surgical skill. Here, we present step-by-step protocols for femoral artery cannulation procedures. Key procedures include the calibration of the data acquisition system, tissue dissection and femoral artery cannulation, and setup of the arterial cannulation system for pressure recording. Surface electrocardiography recording procedures are also included. We also present examples of BP recordings from normotensive and hypertensive rats. This protocol allows reliable direct recordings of systemic BP with simultaneous electrocardiography.

Here, we describe a setup for simultaneous recording of electrocardiography and intra-arterial blood pressure (BP) in experimental rats, which can be done with standard equipment in animal facilities and can be applied to physiological or pharmacological studies to investigate pathogenic or therapeutic mechanisms in cardiovascular medicine.

Gleichzeitige Elektrokardiographie Aufnahme und Invasive Blut Druckmessung bei Ratten

For studies related to cardiovascular physiology or pathophysiology, blood pressure (BP) and electrocardiography are basic observational parameters. ...

Evaluation of Coronary Flow Reserve After Myocardial Ischemia Reperfusion in Rats

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via recanalization of the coronary artery is the most effective strategy for reducing the size of ischemic myocardium. The coronary microvasculature cannot be visualized and imaged&#160;in vivo, but there are several invasive and noninvasive techniques that can be used to assess parameters which depend directly on coronary microvascular function. The endothelial function after ischemia reperfusion can be assessed also at the level of the coronary circulation via the coronary flow reserve (CFR).&#160;In this study, peak velocity of left anterior descending (LAD) coronary arteries was measured in rats in vivo via Transthoracic Doppler Echocardiography during resting and stress challenge (induced by Dobutamine). A normal heart can increase its coronary blood flow up to four times above the resting values during stress induction. Following ischemia reperfusion, we found a significantly diminished CFR, which can be used as a marker of coronary microvascular dysfunction. CFR has opened a window on the importance of microvascular dysfunction and has been shown to predict cardiovascular risk independent of whether the severe obstructive disease is present.

Coronary flow reserve (CFR), is defined as the ratio of maximal coronary blood flow to the resting coronary blood flow. We present a protocol for evaluating CFR in rats via ultrasound, which offers the opportunity to predict cardiovascular risk factors in the absence of obstructive coronary disease.

Bewertung des koronaren Flussreservats nach Myokard-Ischämie-Reperfusion bei Ratten

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via ...

Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow

The growing use of medical devices (e.g., vascular grafts, stents, and cardiac catheters) for temporary or permanent purposes that remain in the body&#39;s circulatory system demands a reliable and multiparametric approach that evaluates the possible hematologic complications caused by these devices (i.e., activation and destruction of blood components). Comprehensive in vitro hemocompatibility testing of blood-contacting implants is the first step towards successful in vivo implementation. Therefore, extensive analysis according to the International Organization for Standardization 10993-4 (ISO 10993-4) is mandatory prior to clinical application. The presented flow loop describes a sensitive model to analyze the hemostatic performance of stents (in this case, neurovascular) and reveal adverse effects. The use of fresh human whole blood and gentle blood sampling are essential to avoid the preactivation of blood. The blood is perfused through a heparinized tubing containing the test specimen by using a peristaltic pump at a rate of 150 mL/min at 37 &#176;C for 60 min. Before and after perfusion, hematologic markers (i.e., blood cell count, hemoglobin, hematocrit, and plasmatic markers) indicating the activation of leukocytes (polymorphonuclear [PMN]-elastase), platelets (&#946;-thromboglobulin [&#946;-TG]), the coagulation system (thombin-antithrombin III [TAT]), and the complement cascade (SC5b-9) are analyzed. In conclusion, we present an essential and reliable model for extensive hemocompatibility testing of stents and other blood-contacting devices prior to clinical application.

This protocol describes a comprehensive hemocompatibility evaluation of blood-contacting devices using laser-cut neurovascular implants. A flow loop model with fresh, heparinized human blood is applied to mimic blood flow. After perfusion, various hematologic markers are analyzed and compared to the values gained directly after blood collection for hemocompatibility evaluation of the tested devices.

HämokompatibilitätSprüfung von blutverfälschten Implantaten in einem Flow Loop-Modell, das den menschlichen Blutfluss imitiert

The growing use of medical devices (e.g., vascular grafts, stents, and cardiac catheters) for temporary or permanent purposes that remain in the ...

Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy

Transduction of sound is metabolically demanding, and the normal function of the microvasculature in the lateral wall is critical for maintaining endocochlear potential, ion transport, and fluid balance. Different forms of hearing disorders are reported to involve abnormal microcirculation in the cochlea. Investigation of how cochlear blood flow (CoBF) pathology affects hearing function is challenging due to the lack of feasible interrogation methods and the difficulty in accessing the inner ear. An open vessel-window in the lateral cochlear wall, combined with fluorescence intravital microscopy, has been used for studying CoBF changes in vivo, but mostly in guinea pig and only recently in the mouse. This paper and the associated video describe the open vessel-window method for visualizing blood flow in the mouse cochlea. Details include 1) preparation of the fluorescent-labeled blood cell suspension from mice; 2) construction of an open vessel-window for intravital microscopy in an anesthetized mouse, and 3) measurement of blood flow velocity and volume using an offline recording of the imaging. The method is presented in video format to show how to use the open window approach in mouse to investigate structural and functional changes in the cochlear microcirculation under normal and pathological conditions.

An open vessel-window approach using fluorescent tracers provides sufficient resolution for cochlear blood flow (CoBF) measurement. The method facilitates the study of structural and functional changes in CoBF in mouse under normal and pathological conditions.