Finanzielle Unterstützung für die meisten Studien wurde von der schwedischen Medical Research Council (Stipendium 5942) zur Verfügung gestellt.

1. Animals <ol><li> Kleine Nagetiere wie Ratten, Mäuse und Meerschweinchen haben als Tiermodelle verwendet worden. Leider neigen erwachsenen Mäusen (viele Mausstämme wurden bewertet), um fehlende oder nur eine sehr geringe Anzahl von potenziellen Elternteil Mikrogefäßen (von denen die Angiogenese entstehen können) innerhalb ihrer mesenterialen Fenster, was Studien mit Mäusen unzuverlässig. Deshalb hat der Test vor allem für Ratten entwickelt. </li><li> Die Ratten, die zu einer Standard-Umgebung für mindestens 7 Tage nach Auslieferung vom Züchter sind akklimatisiert, sind in der Regel paarweise in einem Standard-Käfig untergebracht unter einem 12-Stunden Licht / Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Wasser und Pellets. Jedes Tier ist markiert. Wir verwenden meist jungen erwachsenen Ratten (in der Regel 7-10 Wochen alt verschiedener Stämme aber in der Regel männlichen Sprague-Dawley Ratten; bei Ratten jünger als 5-6 Wochen im Alter von der Zahl der einheimischen Mikrogefäßen eher gering zu sein) aus verschiedenen Züchtern erhalten. In der Zeit vor dem Experiment und während des Experiments werden die Tiere gewogen jeden zweiten Tag, und immer am Tag des Opfers. Wenn die Tiere behandelt werden, gleichzeitig ip (für die Induktion der Angiogenese, siehe unten) und sc oder iv oder po, sie werden gewogen jeden Tag. Dies ermöglicht die Einrichtung von Versuchs-und Kontrollgruppen gleich Körpergewicht zu Beginn des Experiments, und erlaubt die Überwachung der Einfluss der Behandlung auf Körper-weight-gain im Verlauf des Experiments. Da erwachsenen männlichen Ratten robust wachsen physiologisch (Gewinnung etwa 40-60 g pro Woche, je nach Art der Belastung), ist Gewichtszunahme Retardierung ein sensibles Ersatz-Marker der Toxizität, systemische Wohlbefinden, Appetitlosigkeit und Gedeihstörungen. </li></ol> Wir arbeiten in einem High-Standard-Tierstation und erhebliche Anstrengungen unternommen werden, um die Höhe der Belastung durch die Tiere erlebt zu minimieren. Die aktuellen ethischen Richtlinien sind die von Workman P. et al. (Richtlinien für das Wohlergehen und die Verwendung von Tieren in der Krebsforschung. Br. J. Cancer 102, 1555-77, 2010). The Animal Ethikkommission der Universität Göteborg genehmigt diese Studien. 2. Pro-angiogenen intraperitoneale Behandlung <ol><li> Der Kandidat pro-angiogenen Faktor getestet werden gelöst und verdünnt in die Endotoxin-freie Kochsalzlösung zur Infusion von Patienten verwendet werden (auch bei extrem niedrigen Niveau, ist die Endotoxin-pro-angiogenen). Alle Lösungen sind bis frisch am Tag der Injektion, sterilfiltriert (Millipore 0,22-um Filtration) gemacht, geprüft neutralen pH-Wert (7.1-7.3), und verwendet bei Raumtemperatur. Der Test-Agent wird bei niedrigen oder sehr niedrigen Konzentrationen injiziert. Zum Beispiel, Ratte rVEGF 164 (564-RV/CF; R &amp; D Systems Europe, Ltd, Oxon, UK) ist, die die vorherrschende VEGF-A-Isoform bei Ratten ist, auf 96 pmol / ml in Endotoxin-freie Kochsalzlösung verdünnt, gefroren und aufgetaut und einem Volumen von 5 ml injiziert ip in der Ratte. Wir verwenden eine 5-ml-Spritze mit 0,8-mm-Nadel (grüne Nadel, 21G) für ip-Injektion. Diese Behandlung, zweimal täglich über 4,5 Tage, dh. Gegeben, von Montag Morgen (Tag 0) bis Freitagmorgen (Tag 4), führt zu einem robusten sprießen Angiogenese Reaktion in den mesenterialen Test Gewebe mit einem Spitzenwert von rund Day 21. Die Verwaltung der Lösung ip sorgt dafür, dass das gesamte Volumen in die Bauchhöhle (und nicht in den Darm, Blase oder jedes andere Organ) geliefert wird. Die schnelle Injektion von 5 ml ermöglicht taktile Bestätigung durch den Betreiber, dass der Flüssigkeitsstrahl hat durch die Bauchdecke in die Bauchhöhle geleitet. Nach, vor oder gleichzeitig mit der IP-pro-angiogenen Therapie kann jeder testen Mittel der Wahl systemisch verabreicht werden. </li></ol> 3. Systemische Administation der Angiogenese-modulierenden Agents <ol><li> Jede Route anderes als die ip route kann verwendet werden, da ip Behandlung der laufenden angiogenen Reaktion durch die Induktion der Entzündung oder möglicherweise durch die Aktivierung der Mastzellen im Test Gewebe, was zu einer starken pro-angiogene Reaktion führen kann beeinflussen können. Neben oralen Verabreichung oder einzelne Injektion sc oder iv, benutzen wir oft sc Verabreichung mit osmotische Minipumpen (eine oder mehrere, mit unterschiedlichen Volumina und Pumpzeiten) zu der Lösung mit einer konstanten Rate von bis zu liefern, um zwei oder mehrere Wochen. </li><li> Die kontinuierliche subkutane Infusion von Test-Agenten Abfüll-und Implantation von osmotischen Minipumpen In der Regel an Tag 5, also einen Tag nach dem Ende der ip Behandlung mit VEGF, osmotische Minipumpen (z. B. Modell 2ML2, mit konstanter Pumprate von 5,0 ul / h für 14-15 Tage; Alzet osmotische Pumpen, Mountain View, CA , USA) werden unter sterilen Bedingungen mit dem Test-Agent oder das passende Fahrzeug gefüllt. Nach der Lagerung in 0,9% (w / v) NaCl über Nacht bei 37 ° C, die Pumpe (n) werden chirurgisch sc auf dem Rücken implantiert (an der Seite des Rückenmarks Column in den Bereich der Schulterblätter) von Ratten, die betäubt wurden mit Isofluran-Gas (Isoba Tierarzt; Schering-Plough Animal Health, Merck &amp; Co., Inc., Whitehouse Station, NJ, USA), zunächst in einer luftdichten Kammer und transparent anschließend über eine Maske (um den Stress verursacht die folgenden Tier zu minimieren, wird die Kammer mit Luft gespült, bevor sie wiederverwendet wird). Der Hautschnitt für Pumpe Implantation gemacht wird vernäht sofort nach der Implantation mit seidenen Faden. Da die Tiere an Gewicht zunehmen physiologisch während der experimentellen Phase und der Test-Agenten sind mit einer konstanten Rate verabreicht wird, ist die tatsächliche Dosis für einen Test Droge pro kg Körpergewicht höher gewählt werden als die durchschnittliche Dosierung zu Beginn der Infusion und niedriger als der durchschnittliche Dosis am Ende der Infusion. Kontinuierliche Infusion, wie hier beschrieben, kann als eine erweiterte Form der metronomischer Behandlung angesehen werden. </li></ol> 4. Beenden des Experiment <ol><li> Ein Tier zu einer Zeit, in einem transparenten luftdichten Kammer, die mit CO 2-Gas, die sich schnell tötet das Tier gespült platziert wird. Die Kammer ist mit Luft, bevor sie wieder verwendet werden gespült. </li></ol> 5. Harvesting Gewebeproben <ol><li> Wie in der DVD gezeigt, ist die Bauchdecke geöffnet und die kleinen Darm Mesenterium identifiziert, darunter die meisten distalen Teil, dass die Ileocoecalklappe (der Kreuzung der Dünndarm und den Dickdarm) erreicht. Vier (oder mehr) der distal gelegen &quot;Fenster&quot; sind gezählt und die Ausbreitung auf objektiven Maßstab unbehandelten Superfrost Plus-Objektträger (DAKO Denmark A / S, Glostrup, Dänemark). Es ist wichtig, um zu vermeiden, wenn möglich, Kontamination der Proben mit Blut, Darminhalt oder anderen Körperflüssigkeiten, da diese Materialien können gebeizt unspezifisch, obwohl dies nicht die Unwirksamkeit nicht die anschließende immunhistochemische Visualisierung von Mikrogefäßen. </li><li> Jeder mesenterialen Fenster Probe mit angeschlossenem kleinen Darm-Segment befindet sich auf einem Objektträger ausgestrichen und getrocknet bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Dann wird der Darm Stumpf abgeschnitten, während die intakte membranöse Mesenterium Proben bei -20 ° C über einen längeren Zeitraum gespeichert werden. Dies wird in der DVD gezeigt. </li></ol> Es sollte erwähnt werden, dass das Gewebe und zum Patent Gefäßsystem visualisiert werden können, bevor sie mit Durchlicht Intravitalmikroskopie Ernte. 6. Protokoll für die immunhistochemische Färbung von Mikrogefäßen <ol><li> Tag 0 Die Proben dürfen von -20 ° C bis Raumtemperatur, in einem Schrank bei 60 ° C getrocknet 1 Stunde auftauen und hielt über Nacht bei Raumtemperatur. </li><li> Tag 1 Legen Sie die Folien in Färbung Objektträgerhalter (in jeder zweiten Spur) in einer Küvette und waschen zweimal mit TBS (pH 7,8) für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Die Lösung wird verworfen und durch die nächste Lösung, und so weiter für alle folgenden Schritte. </li><li> Trypsin-Behandlung Füllen Sie die Küvette, dass die Färbung Diahalter mit Trypsin-Lösung (25 ° C für 20 Minuten) wird den Hafen. Entsorgen Sie die Lösung, Inkubation zweimal mit 2,5% Saccharose-Lösung (Raumtemperatur für jeweils 10 Minuten Zeit). Entsorgen Sie die Lösung und spülen Sie ein paar Mal in aqua dest (Raumtemperatur für ein paar Minuten). </li><li> Sperrung Füllen Sie die Küvette, dass die Färbung Diahalter mit 0,5% H 2 O 2 in Methanol (Raumtemperatur 30 Minuten) wird den Hafen. Entsorgen Sie die Lösung und spülen mit Aqua dest (Raumtemperatur für ein paar Minuten). Entsorgen Sie die Lösung und spülen Sie zweimal mit TBS (pH 7,4) (Raumtemperatur für 8 Minuten jedes Mal). </li><li> Incubation Alle Inkubationen werden in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur. Etwa 150 ul jeder der aufgeführten Lösungen sind pro Folie verwendet. Die Folien sind in einer feuchten Kammer gelegt und die Lösungen sind auf die Proben (nicht-membranöse Teile müssen nicht durch die Lösungen abgedeckt werden) pipettiert. Für jede der folgenden Schritte sorgfältig abschütteln alle der Lösung vor der anschließenden Lösung versetzt. <ol><li> Inkubation mit Normal (Blockierung) im Serum (Pferd) (ABC-Kit) 3 Tropfen gelbe Lösung / 10 ml Verdünnungspuffer für 20 Minuten. </li><li> Inkubation mit primärem Antikörper ARU0181, die Ratte vaskulären Endothelzellen Etiketten. Der Antikörper wird 1:600 ​​mit Verdünnungspuffer (Biosource) (100 ul verdünnt 40-fach [gefrorenen] plus 900 ul Verdünnungspuffer) und Inkubation verdünnt erfolgt über Nacht bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Tag 2 Die Folien aus der feuchten Kammer entfernt werden, wird der primäre Antikörper verworfen, und die Folien sind in einer Färbung Diahalter, die in der Küvette eingetaucht ist und zweimal mit TBS gespült platziert(PH 7,8) für 8 Minuten. <ol><li> Inkubation mit biotinylierten Antikörper (ABC-Kit) Die Folien sind horizontal in einer befeuchteten Kammer platziert und mit 1 Tropfen blaue Lösung / 10 ml Verdünnungspuffer für 30 Minuten. Entsorgen Sie die Lösung und Objektträger in eine Färbung Diahalter in die Küvette eingetaucht und gründlich zweimal mit TBS (pH 7,4) für 8 Minuten. </li><li> Die Inkubation mit dem ABC-Reagenz Die Folien sind wieder horizontal in einer befeuchteten Kammer platziert und die folgenden Lösungen sind auf die membranöse Teile der Proben pipettiert: 2 Tropfen orange Lösung plus 2 Tropfen braune Lösung / 10 ml TBS (pH 7,4) für 30 Minuten. Vorsichtig mischen 30 Minuten vor Gebrauch! Entsorgen Sie die Lösung und Objektträger in den Diahalter in die Küvette und spülen Sie zweimal mit TBS (pH 7,4) für 8 Minuten. </li></ol></li><li> Färbung mit DAB (0,05%) Dieser Schritt muss in einem gut belüfteten chemische Abzug durchgeführt werden! Legen Sie die Folien und fügen Sie die 3,3-Diaminobenzidin (DAB, Sigma-Aldrich)-Lösung mit einer Pipette: 0,1% DAB-Lösung in TBS (pH 7,4) [gefrorenen] ist 1:1 mit einem Gemisch aus 10 ul H 2 O verdünnt 2 und 7,5 ml TBS (pH 7,4). Diese Lösung wird sterilfiltriert unmittelbar vor Gebrauch (um Partikel, die das mikroskopische Bild verdunkeln, zu beseitigen). Stain die Proben für 8 Minuten. Entsorgen Sie die Lösung und Objektträger in der Färbung Diahalter in die Küvette getaucht. Spülen unter fließendem Leitungswasser und dann in Aqua dest für ein paar Minuten. </li><li> Austrocknung Die Folien sind in der Färbung Diahalter gehalten. Spülen durch das Wegwerfen und Nachfüllen der Küvette mit aqua dest / Ethanol: aqua dest, 70% Alkohol, 95% Alkohol, absolutem Alkohol, mit 2 Minuten in jeder Lösung. </li></ol> 7. Imaging und Beurteilung der mikrovaskulären Netzwerk in jedem Mesenteriale Fenster Probe nach der immunhistochemische Färbung von vaskulären Endothelzellen Wie im Film gezeigt werden Mikrogefäßen mikroskopisch visualisiert in situ in das intakte Gewebe. <ol><li> Erstens verwenden wir eine Zeichnung Mikroskop mit Vergrößerungsbereich 14 bis 34 (Leica Wilde M 3Z) zu Bleistift auf weißem Papier die gesamte Fensterfläche, sowie die gesamte vaskularisierten Bereich (VA) pro mesenterialen Fenster. VA, als Prozentsatz der gesamten Fläche ist leicht gemessen anhand elektronischer oder nicht-automatisiert Planimetrie (oder einfach durch Ausschneiden und Gewichtung des Bildes des gesamten Fensters, und die Bilder von allen vaskularisierten Teile). </li><li> Mit einer anderen Zeichnung Mikroskop einzelne microvessel Profile, die leicht erkennbar sind, werden in schwarzer Tinte auf weißem Papier bei 80 Vergrößerung in zufällig ausgewählten Bereichen gezogen. Dies ist der Ausgangspunkt für die nachfolgende computergestützte morphometrische Beurteilung der mikrovaskulären Länge (MVL), die im Grunde eine Messung der mikrovaskulären Dichte. </li><li> Optional Variablen in Bezug auf mikrovaskuläre Musterbildung, können ebenso wie die für die Beurteilung der Anzahl der mikrovaskulären Sprossen und Länge der einzelnen mikrovaskuläre Sprossen (Nr. SP und Le. SP bezeichnet) ermittelt werden. -Der optimale Kontrast zwischen der abgebildeten schwarzen Gefäßstrukturen und den weißen Hintergrund ermöglicht detaillierte Analysen der Bilder in den meisten kommerziellen morphometrische EDV-Programme. </li><li> In den meisten Fällen sind die wichtigsten Variablen VA und MVL, die, wenn miteinander multipliziert erzeugen die insgesamt mikrovaskuläre Länge (TMVL). </li></ol> 8. Statistische Analyse Wir verwenden normalerweise den Standard nicht-parametrischen Mann-Whitney-U-Test zu ungepaarten (zweiseitig) Beobachtungen zu analysieren. Ein Mittelwert von vier mesenterialen Fenster pro Tier wird als unabhängige Daten-Punkt für jede Variable der mesenterialen Fenster verwendet. Das Kriterium für die statistische Signifikanz P ≤ 0,05.

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	<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+models+of+angiogenesis.">In vivo models of angiogenesis.</a> J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+testing+with+angiogenesis+models.">Drug testing with angiogenesis models.</a> Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).</li><li>Norrby, K., Jakobsson, A., Sorbo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast-cell-mediated+angiogenesis:+a+novel+experimental+model+using+the+rat+mesentery.">Mast-cell-mediated angiogenesis: a novel experimental model using the rat mesentery.</a> Virchows Arch. B Cell. Pathol. Incl. Mol. Pathol. 52, 195-206 (1986).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+and+angiogenesis.">Mast cells and angiogenesis.</a> APMIS. 110, 355-371 (2002).</li><li>Albertsson, P., Lennernas, B., Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+meteronomic+chemotherapy:+modulation+of+angiogenesis+mediated+by+VEGF-A.">On meteronomic chemotherapy: modulation of angiogenesis mediated by VEGF-A.</a> Acta Oncol. 45, 144-155 (2006).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+apo-lactoferrin+enhances+angiogenesis+mediated+by+vascular+endothelial+growth+factor+A+in+vivo.">Human apo-lactoferrin enhances angiogenesis mediated by vascular endothelial growth factor A in vivo.</a> J. Vasc. Res. 41, 293-304 (2004).</li><li>Norrby, K., Mattsby-Baltzer, I., Innocenti, M., &amp;amp, T. u. n. e. b. e. r. g., S, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orally+administered+bovine+lactoferrin+systemically+inhibits+VEGF(165)-mediated+angiogenesis+in+the+rat.">Orally administered bovine lactoferrin systemically inhibits VEGF(165)-mediated angiogenesis in the rat.</a> Int. J. Cancer. 91, 236-240 (2001).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-molecular-weight+heparins+and+angiogenesis.">Low-molecular-weight heparins and angiogenesis.</a> APMIS. 114, 79-102 (2006).</li><li>Norrby, K., Nordenhem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dalteparin,+a+low-molecular-weight+heparin,+promotes+angiogenesis+mediated+by+heparin-binding+VEGF-A+in+vivo.">Dalteparin, a low-molecular-weight heparin, promotes angiogenesis mediated by heparin-binding VEGF-A in vivo.</a> APMIS. 118, 949-957 (2010).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+and+de+novo+mammalian+angiogenesis.">Basic fibroblast growth factor and de novo mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res.. 48, 96-113 (1994).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+and+de+novo+mammalian+angiogenesis.">Vascular endothelial growth factor and de novo mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res. 51, 153-163 (1996).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+density+in+terms+of+number+and+length+of+microvessel+segments+per+unit+tissue+volume+in+mammalian+angiogenesis.">Microvascular density in terms of number and length of microvessel segments per unit tissue volume in mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res. 55, 43-53 (1998).</li></ol>

Der Assay wurde in 1986 3 eingeführt und hat sich sukzessive weiter entwickelt und verfeinert in unserem Labor 7,10-12. Wie in Übersichtsartikeln (invited) 1, 2 diskutiert, vergleicht der Test auch mit anderen Säugetieren in vivo Angiogenese-Assay in Bezug besonders auf wichtige Funktionen wie die erwachsenen Probanden Gewebe nativ vaskularisiert und fehlt physiologischen Angiogenese; minimales Trauma, wenn überhaupt, zugefügt auf das Gewebe, wirklich quantitative Variablen gemessen werden, die fundierte statistische Analyse im Hinblick auf Dosis-Wirkungs-und molekular-Aktivitäts-Studien ermöglicht, sprießen Angiogenese auftritt, was in normalen Geweben und Tumoren überwiegen, und Toxizitätsdaten sind leicht in Ratten, die kräftig wachsen angesammelt physiologisch im Erwachsenenalter. Nachteilige Eigenschaften kann die Tatsache, dass der Test relativ zeitaufwendig ist, vor allem bei der Beurteilung der Anzahl und Länge der einzelnen Segmente und microvessel microvessel Sprossen; dass es nicht möglich real-time/serial Beobachtungen, und dass es kaum geeignet für Mäuse da viele mesenterialen Fenster in Mäusen potenzielle Eltern Mikrogefäßen Mangel, aus dem neue Kapillaren entstehen können. Real-time Beobachtungen sind jedoch durch Intravitalmikroskopie wo die exteriorisierten aber intakt mesenterialen Fenster gespreizt werden über einen Mikroskoptisch, während das Tier narkotisiert, wie in 1 beschrieben aktiviert. Bedeutsame Fortschritte bei der Angiogenese-Forschung haben in den vergangenen Jahrzehnten mit Modellen wie dem Hornhaut-Micropocket, chick Chorioallantoismembran und sc Matrigel-Plug-Assays, die nützlich, aber letztlich begrenzt Werkzeuge sind erreicht worden. Zukünftige klinische Anwendungen von anti-angiogenen und pro-angiogenen Therapien erfordern die Etablierung und Validierung von empfindlicher und biologisch relevanten, wirklich quantitative vorklinischen Modellen, wie die im aktuellen Bericht beschrieben.

Puffer und Reagenzien 0,5 M Tris-HCl (pH 7,8) Stammlösung Tris (hydroxymethyl) aminomethan (60,57 g) wird in ~ 900 ml Aqua dest gelöst, und ~ 45 ml 25% HCl (konzentriert) wird hinzugefügt, um pH 7,8 durch Verdünnung auf 1 Liter mit Aqua dest gefolgt erreichen. Tris-Puffer-Kochsalzlösung (TBS, pH 7,8) Zu 200 ml der Stammlösung hinzugefügt wird 18 g NaCl in ~ 1800 ml Aqua dest mit Einstellung des pH auf 7,8 mit der Stammlösung durch Verdünnen auf 2 Liter mit Aqua dest gelöst und anschließend. TBS (pH 7,4) Zu 200 ml der Stammlösung beträgt 18 g NaCl gelöst in ~ 1800 ml Aqua dest mit Einstellung des pH auf 7,4 mit der Stammlösung durch Verdünnen auf 2 Liter mit Aqua dest gelöst und anschließend aufgenommen. Trypsin-Lösung (0,05% Trypsin, 0,1% CaCl 2) Enthält 0,1 g Trypsin und 0,2 g CaCl 2 in 200 ml TBS (pH 7,8). Saccharose-Lösung 2,5% Enthält 5 g Saccharose in 200 ml TBS (pH 7,8). Stammlösung von 1% Natriumazid in TBS (pH 7,4) Enthält 1 g Na-Azid in 100 ml mit TBS (pH 7,4). Verdünnungspuffer: 0,1% BSA, 0,01% Na-Azid (Verwendet, um Antikörper in der Vectastain ABC Kit verdünnen). Enthält 0,1 g Rinderserumalbumin (BSA) und 1 ml 1% Na-Azid, verdünnt auf 100 ml mit TBS (pH 7,4). ABC-Kit Vectastain PK 4002, ABC-Peroxidase-Maus IgG Normale Pferdeserum; Blockierserum; gelbe Lösung: 3 drops/10 ml Verdünnungspuffer. Biotinylierten Antikörper, anti-Maus IgG; blaue Lösung: 1 drop/10 ml Verdünnungspuffer. ABC-Reagenz: orange Lösung, 2 Tropfen plus brauner Lösung 2 drops/10 ml TBS (pH 7,4). Mix dieser Lösungen 20 Minuten vor Gebrauch! Maus (monoklonalen) Anti-Ratte Endothel (Biosource International, Camarillo, CA, USA) <table border="1"><tbody><tr><td> Catalog # </td><td> ARU0181 </td></tr><tr><td> Klon # </td><td> MRC OX-43 </td></tr></tbody></table> Dieser Antikörper ist gegen alle vaskulären Endothelzellen der Ratte gerichtet ist, mit Ausnahme der in das Gehirn. Vectastain Peroxidase Avidin Biotin Complex (ABC)-Kit Das Kit enthält primärer Antikörper, biotinylierten sekundären Antikörper, Avidin-biotinylierten Enzym-Komplex (ABC) und Enzym-Substrat. Siehe <a href="http://www.vectorlabs.com/">www.vectorlabs.com</a> oder <a href="http://www.immunkemi.se/">www.immunkemi.se</a> für Protokolle. Rinderserumalbumin (BSA) (Sigma-Aldrich, Katalog # A-4503). DAB = 3,3 &#39;-Diaminobenzidin Isopac (Sigma-Aldrich, Katalog Nr. D 9015). Trypsin aus Rinderpankreas (Sigma-Aldrich, Katalog # T 4665). Vectastain Peroxidase ABC-Kit, Maus IgG (Immunkemi F &amp; E-AB, Järfälla, Schweden)

rat mesentery angiogenesis assay

Die erwachsenen Ratte Mesenterium Fenster Angiogenese-Assay ist biologisch angemessenes und ist außergewöhnlich gut auf das Studium der Austrieb der Angiogenese in vivo geeignet [siehe Übersichtswerke], die die dominierende Form der Angiogenese in menschlichen Tumoren und Non-Tumor-Gewebe ist, wie in eingeladen Beitrag diskutierten Papiere 1,2. Angiogenese in den häutigen mesenterialen Teile durch intraperitoneale (ip) Injektion eines pro-angiogenen Faktor induziert werden kann durch subkutane (sc), intravenös (iv) oder oral (po) Behandlung mit Modifizierungsmitteln der Wahl moduliert. Jeder membranösen Teil des Mesenteriums ist durchscheinend und umrahmt von Fettgewebe, so dass es ein Fenster Aussehen. Der Test weist die folgenden vorteilhaften Eigenschaften: (i) der Test Gewebe nativ vaskularisiert, wenn auch spärlich, und da es extrem dünn ist, ist die microvessel Netzwerk nahezu zweidimensional, was kann das gesamte Netzwerk zu mikroskopisch in situ beurteilt werden; ( ii) bei erwachsenen Ratten den Test Gewebe fehlt signifikanten physiologischen Angiogenese, die die meisten normalen Erwachsenen Säugetiergewebe charakterisiert; der Grad der nativen Vaskularisation ist jedoch, korreliert mit dem Alter, wie in 1 beschrieben, (iii) die vernachlässigbares Niveau von Trauma-induzierte Angiogenese sorgt für eine hohe Empfindlichkeit, (iv) der Test bildet die klinische Situation, da die Angiogenese-modulierenden Medikamenten-Test systemisch und verwaltet werden die Antworten beobachtet spiegeln den Nettoeffekt aller Stoffwechsel-, zelluläre und molekulare Veränderungen, die durch die Behandlung induziert, (v) des Assays erlaubt Einschätzungen objektive, quantitative, objektive Variablen der mikrovaskulären räumliche Ausdehnung, Dichte und Netzwerk Musterbildung, sowie der Kapillare sprießen, wodurch robuste statistische Analysen der Dosis-Wirkungs-und molekulare Struktur-Aktivitäts-Beziehungen, und (vi ) der Test zeigt, mit hoher Empfindlichkeit die toxische oder schädliche Auswirkungen von Behandlungen in Form verringerter Satz von physiologischen Körper-Gewichtszunahme, als erwachsene Ratten robust wachsen. Mast-Zell-vermittelten Angiogenese wurde zum ersten Mal gezeigt, mit Hilfe dieses Tests 3,4. Das Modell zeigt ein hohes Maß an Diskriminierung in Dosis-Wirkungs-Beziehungen und den gemessenen Wirkungen von systemisch verabreichten chemisch oder funktional eng verwandten Medikamenten und Proteinen, einschließlich: (i) niedrig dosierte, metronomisch verabreichten Standard-Chemotherapeutika, die vielfältigen, Drogen-spezifischen Effekte ergeben (dh, Angiogenese-suppressive, neutral oder Angiogenese-stimulierenden Tätigkeiten 5), (ii) natürliches Eisen-ungesättigten humanes Lactoferrin, das VEGF-A-vermittelte Angiogenese 6 stimuliert und natürliche Eisen-ungesättigten bovinem Lactoferrin, das hemmt die VEGF-A- Angiogenese 7; und (iii) niedermolekulare Heparin Fraktionen mit verschiedenen Mitteln 8,9 produziert. Darüber hinaus ist der Test sehr zum Studium der kombinierten Effekte auf die Angiogenese von Agenten, die systemisch sind in einem parallel oder sequentiell verabreicht Mode geeignet. Die Idee, dieses Video entstand aus dem späten Dr. Judah Folkman, wenn er unserem Labor besucht und erlebt die Methode demonstriert. Bewertung Papiere (angefragt) diskutieren und Beurteilung des Tests Norrby, K. In-vivo-Modellen der Angiogenese. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006). Norrby, K. Drogentests mit Angiogenese-Modellen. Expert Opin. Drug. Entdeckung. 3, 533-549 (2008).

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Rat Mesentery Angiogenesis Assay

Normalen Erwachsenen vaskularisierten Säugetiergewebe, dass physiologische Angiogenese fehlt und die nicht zur chirurgischen Intervention wird verwendet, um Studie ausgesetzt worden: (i) die Initiierung und Entwicklung der Angiogenese nach intraperitonealer Verabreichung von Test-Agenten, und (ii) die Veränderung der Angiogenese nach systemischer Gabe von ausgewählten Test-Agenten.

Rat Mesenterium Angiogenese Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

Research

JoVE Journal

Biology

13.8K Aufrufe.  University of Gothenburg. Normalen Erwachsenen vaskularisierten Säugetiergewebe, dass physiologische Angiogenese fehlt und die nicht zur chirurgischen Intervention wird verwendet, um Studie ausgesetzt worden: (i) die Initiierung und Entwicklung der Angiogenese nach intraperitonealer Verabreichung von Test-Agenten, und (ii) die Veränderung der Angiogenese nach systemischer Gabe von ausgewählten Test-Agenten.

Serie: Rat Mesentery Angiogenesis Assay

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro. He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes: Eine In-vitro-Modell für das Studium der Angiogenese (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

Forschung

Biologie

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

Optimierte Fibringel Bead Assay für das Studium der Angiogenese

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes

Maintenance of antigen-specific T cell lines or clones in culture requires rounds of antigen-induced activation separated by phases of cell expansion 1,2. Addition of interleukin 2 to the culture media during the expansion phase is necessary to prevent cell death and sufficient to maintain short-term T cell lines but has been shown to increase Th1 polarization 3. Replacement of interleukin 2 by T cell growth factor (TCGF) which contains a mix of cytokines is more effective than interleukin 2 in maintaining long-term T cell lines in vitro 3. Moreover, TCGF can easily be prepared in large amounts in the laboratory and is much cheaper than recombinant interleukin 2. 
Here, we show how to prepare TCGF from rat splenocyte culture supernatants. For this procedure, we harvest spleens from naive Lewis rats euthanized for thymus and blood collection. We prepare single-cell suspensions from the spleens, lyze the red blood cells by osmotic shock, and seed the splenocytes in culture medium. The cells are stimulated with concanavalin A, a mitogen that non-selectively activates all rat T lymphocytes, inducing the production of cytokines. The culture supernantant is collected 48 hours later andexcess concanavalin A is bound to alpha methyl mannoside to prevent it from activating T cell lines to which TCGF will be added. The TCGF is then sterile-filtered, aliquoted, and stored at -20&deg;C.

We describe the preparation of T cell growth factor used for the in vitro expansion of antigen-specific rat T lymphocyte lines.

Vorbereiten T Cell Growth Factor von Rat Splenozyten

Maintenance of antigen-specific T cell lines or clones in culture requires rounds of antigen-induced activation separated by phases of cell expansion 1,2. ...

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Optische Abbildung von Langendorff-perfundierten Rattenherzen

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

Primäre Kultur der erwachsenen Ratte Herz Myozyten

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Intracellular Refolding Assay

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds with inhibitory/stimulating activity. Molecular chaperones are proteins involved in regulation of protein folding1 and have a crucial role in promoting cell survival upon stress insults like heat shock2, nutrient starvation and exposure to chemicals/poisons3. For this reason chaperones are found to be involved in events like tumor development, chemioresistance of cancer cells4 as well as neurodegeneration5. Design of small molecules able to inhibit or stimulate the activity of these enzymes is therefore one of the most studied strategies for cancer therapy7 and neurodegenerative disorders9. The assay here described offers the possibility to measure the refolding activity of a particular molecular chaperone and to study the effect of compounds on its activity. In this method the gene of the molecular chaperone investigated is transfected together with an expression vector encoding for the firefly luciferase gene. It has been already described that denaturated firefly luciferase can be refolded by molecular chaperones10,11. As normalizing transfection control, a vector encoding for the renilla luciferase gene is transfected. All transfections described in this protocol are performed with X-treme Gene 11 (Roche) in HEK-293 cells. In the first step, protein synthesis is inhibited by treating the cells with cycloheximide. Thereafter protein unfolding is induced by heat shock at 45&deg;C for 30 minutes. Upon recovery at 37&deg;C, proteins are re-folded into their active conformation and the activity of the firefly luciferase is used as read-out: the more light will be produced, the more protein will have re-gained the original conformation. Non-heat shocked cells are set as reference (100% of refolded luciferase).

In this protocol a method to measure intracellular protein refolding after heat shock is described. This method can be used to study foldases like molecular chaperones and their co-factors or compounds able to influence their activity. Firefly luciferase activity is used as reporter to measure chaperone refolding activity.

Intrazelluläre Rückfaltung Assay

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds ...

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

Rattengekröse Exteriorisation: Ein Modell für die Untersuchung der Zelluläre Dynamik an der Angiogenese beteiligt

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

Endothelzellen Schlauchbildung Assay für die<em&gt; In-vitro-</em&gt; Studium der Angiogenese

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Mikroperfusion Technik zur Untersuchung von Mikrogefäßdurchlässigkeit Verordnung in Rattengekröse

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

In - vivo - Alkaline Comet Assay und enzymmodifizierten Alkaline Comet Assay zur Messung von DNA - Strangbrüchen und oxidative DNA - Schäden in der Rattenleber

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...