Dieses Protokoll ermöglichte es, eine wichtige Frage im Bereich der Krebsmetastasierung zu beantworten. Einschließlich, wie Tumorzellen die Lunge besiedeln? Wie bleiben Tumorzellen inaktiv?
Und was sie dazu bringt, die Ruhephase zu verlassen und schließlich Metastasen zu bilden. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass der dynamische metastatische Prozess direkt in vivo, in Echtzeit, in einer realen Mikroumgebung untersucht werden kann. Diese Methode kann Einblicke in mehrere Lungenerkrankungen geben, aber sie ist besonders nützlich, um das Verhalten einzelner Tumorzellen zu verstehen, die sich in die Lunge, einen häufigen Ort der Metastasierung, ausbreiten.
Verwenden Sie zunächst eine 2-0-Seidennaht, um einen Knoten an der Basis eines 22-Gauge-Katheters zu binden und 2 Zoll lange Schwänze zu hinterlassen. Sobald die Maus vollständig betäubt ist, bewegen Sie die Maus zum Operationstisch, intubieren Sie die Maus und sichern Sie dann den Intubationskatheter, indem Sie die 2-0 Seidennaht um die Schnauze der Maus binden. Schließen Sie das Beatmungsgerät an den Intubationskatheter an.
Befestigen Sie mit Papierband die vorderen Schädel- und Hintergliedmaßen kaudal an der beheizten Operationsstufe. Legen Sie ein Papierband entlang der Länge des Rückens der Maus, um die Exposition gegenüber dem Operationsfeld zu maximieren. Heben Sie die Haut mit der Pinzette an und machen Sie einen ca. 10 mm kreisförmigen Schnitt bei ca. 7 mm links zum Brustbein und ca. 7 mm oberhalb des Unterkostalrandes.
Schneiden Sie das Weichgewebe über den Rippen aus. Heben Sie die sechste und siebte Rippe mit einer Pinzette an. Verwenden Sie eine einzelne Klinge der stumpfen Mikrosezierschere mit der abgerundeten Seite zur Lunge, um den Interkostalmuskel zwischen der sechsten und siebten Rippe vorsichtig zu durchbohren, um in den intrathorakalen Raum einzutreten.
Den Druckluftkanister am Defekt vorsichtig entladen, um die Lunge zu kollabieren und die Lunge von der Brustwand zu trennen. Feuern Sie die Druckluft in kurzen Ausbrüchen ab, um iatrogene Lungenverletzungen zu verhindern. Legen Sie den Biopsiestempel über das Schneidwerkzeug und manövrieren Sie vorsichtig die Basis des Schneidwerkzeugs durch den Interkostalschnitt.
Richten Sie den Schneidwerkzeugsockel parallel zur Brustwand aus und stanzen Sie ein 5 mm kreisförmiges Loch durch den Brustkorb. Legen Sie mit einer 5-O-Seidennaht einen Handtaschenschnurstich, etwa 1 mm vom Loch entfernt, umlaufend. Als nächstes positionieren Sie den Fensterrahmen in der Brustwand mit den Kanten des kreisförmigen Defekts, der in der Fensternut erfasst ist.
Binden Sie die 5-O-Seidennaht fest, um das implantierte Fenster sicher zu verriegeln. Tragen Sie einen gleichmäßigen und sanften Druckluftstrom für etwa 10 bis 20 Sekunden auf, um die Lunge zu trocknen. Greifen Sie mit der Pinzette den Fensterrahmen an seiner Außenkante und heben Sie ihn vorsichtig an, um die Trennung der Lunge von der Unterseite des Fensterrahmens zu gewährleisten.
Verteilen Sie eine dünne Schicht Cyanacrylatkleber entlang der Unterseite des optischen Fensterrahmens. Drücken Sie den optischen Fensterrahmen vorsichtig aber fest für 10 bis 20 Sekunden zur Befestigung auf das Lungengewebe. Geben Sie einen 5 mm Tropfen Klebstoff auf einen rechteckigen Deckzettel.
Verwenden Sie das Vakuum-Pickup-Tool, um einen 5-mm-Abdeckschein aufzunehmen. Tauchen Sie die Unterseite des Abdeckungsschlüpfers in den Klebstoff und kratzen Sie dann den überschüssigen Klebstoff dreimal gegen die Seite des rechteckigen Abdeckungsschlupfes ab, um eine sehr dünne Klebstoffschicht auf dem Deckmantel zu verrutschen. Positionieren Sie den Abdeckungsschlupf vorsichtig in einem Winkel innerhalb der Aussparung in der Mitte des optischen Fensterrahmens, direkt über dem Lungengewebe.
Klemmen Sie das Beatmungsgerät kurz ein, um einen Überdruck zu erzeugen, der die Lunge hyperaufbläht. Richten Sie den Deckslip parallel zum Lungengewebe aus und verwenden Sie die rotierende Bewegung, um eine direkte Ablagerung zwischen der Lungenoberfläche und der Unterseite des Decksslips zu erzeugen. Halten Sie den sanften Druck für ca. 25 Sekunden aufrecht, um den Cyanacrylatkleber einzustellen.
Trennen Sie den Abdeckschlitten mit einer Pinzette vom Vakuumaufnahmewerkzeug. Erstellen Sie einen Handtaschenschnurstich, umlaufend, weniger als 1 mm von der Schnittkante des Hautschnitts entfernt mit 5-O-Seidennaht. Stecken Sie überschüssige Haut unter den äußeren Rand des Fensterrahmens, bevor Sie das Fenster mit verriegelnden Knoten fest binden.
Dosieren Sie eine kleine Menge Klebstoff an der Metallglasschnittstelle, um eine luftdichte Abdichtung zwischen dem Abdeckschein und dem Fensterrahmen zu gewährleisten. Befestigen Sie die sterile Nadel an einer 1 ml Insulinspritze. Führen Sie die Nadel unterhalb des Xiphoid-Prozesses ein, bewegen Sie sich in Richtung der linken Schulter und treten Sie durch das Zwerchfell in die Brusthöhle ein.
Ziehen Sie die Spritze vorsichtig zurück, um Luftreste aus der Brusthöhle zu entfernen. Die multiphotonen intravitale Bildgebung einer einzelnen Lungenregion zeigte, dass das Mikrovaskuläre an drei aufeinanderfolgenden Tagen verlagert werden konnte. Der definierbare Zweigpunkt eines einzelnen Schiffes wurde an jedem aufeinanderfolgenden Tag identifiziert.
Die nicht markierten Erythrozyten erzeugten Schatten, wenn sie in größere Gefäße flossen. Der Winkel der Verzweigungspunkte relativ zum Gefäß kann verwendet werden, um die Erythrozytenflussraten zu berechnen. Die Erythrozytengeschwindigkeit wurde auch quantifiziert, indem der Maus fluoreszierende Mikrosphären injiziert wurden, und ihre Spurlängen wurden geteilt durch die Rahmenaufnahmezeit gemessen.
Die stationären und fließenden Mikrosphären waren unterscheidbar. Das Schicksal der disseminierten Tumorzellen wurde mit serieller Bildgebung über mehrere Tage verfolgt, wobei das Fenster für die hochauflösende Bildgebung der Lunge verwendet wurde. Die Tumorzelle kam am ersten Tag im Lungengefäßsystem an und setzte sich dort fest.
Die Zelle wurde jedoch am zweiten und dritten Tag nicht im Lungengefäßsystem nachgewiesen, was auf eine Rezirkulation oder Extravasation hindeutet. Die kulminierenden Schritte der metastatischen Progression in der Lunge wurden visualisiert, beginnend mit der Ankunft der Tumorzelle, der Extravasation der Tumorzelle in das Lungenparenchym und der Proliferation zur Bildung von Makrometastasen. Achten Sie darauf, ein Trauma der Lunge während der Platzierung des optischen Fensterrahmens zu vermeiden.
Die Lunge ist anfällig für Blutungen, die später die Adhärenz des Deckungsschlupfes während der Platzierung behindern. Andere Methoden, die nach diesem Verfahren durchgeführt werden können, umfassen die intravitale Mikroskopie, die, wenn sie mit einem modifizierten Ansatz zur Mikrokartographie eingesetzt wird, eine präzise Relokalisierung von Bereichen ermöglicht, die für die wiederholte Bildgebung von Interesse sind. Dieses Protokoll ermöglichte die Visualisierung der Lunge bei der Untersuchung einer Schlüsselfrage über den Mechanismus der Metastasierung.
Diese Studie birgt das Potenzial, eine neue Behandlung für Krebspatienten wieder aufzubauen.
