Os autores agradecem a Ina Wolter pelo seu excelente assistência técnica. Ratos transgênicos VGAT-Vênus foram gerados pelos drs. Y. Yanagawa, M. Hirabayashi e Y. Kawaguchi no Instituto Nacional de Ciências Fisiológicas, Okazaki, Japão, usando pCS2-Venus fornecido pelo Dr. A. Miyawaki.

Declaração de Ética: Todos os procedimentos e manutenção de animais foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais, a lei alemã Bem-Estar Animal, o Conselho Europeu a Directiva 86/609 / CEE do Conselho relativa à protecção dos animais, e as orientações das autoridades locais (Berlim, T-0215/11 ) 1 Preparação de fatias Agudo-hipocampo <ol><li> Tome um rato transgênico (17 a 24 dias de idade), expressando a proteína fluorescente Venus / YFP sob o promotor vGAT, que rotula a maioria dos interneurônios inibitórios corticais 13. Decapitar os ratos. Dissecar o cérebro rapidamente (&lt;40 segundos) em semifrozen, carbogenated (95% de O2 / 5% de CO 2) à base de sacarose líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF-sacarose, Figura 1A). </li><li> Avaliar o cérebro de rato dissecado por Vénus / YFP fluorescência com uma lâmpada de 505 nm e um filtro de emissão de LED 515, montado sobre um par de óculos. </li><li> Remover o terceiro frontal do córtex e Cerebellum; em seguida, separar os hemisférios, todos com um bisturi. Retirar a superfície dorsal do córtex para proporcionar uma superfície plana para colar o cérebro para baixo, como previamente descrito 14. </li><li> Cortar fatias transversais (300 um) da formação do hipocampo de um vibratome, os hemisférios deve ser cercado com semifrozen, carbogenated sacarose-ACSF (Figura 1B) 14. Remover regiões adicionais de rostral do córtex, mesencéfalo e tronco cerebral. Transferir cada fatia de uma câmara de retenção submersos contendo sacarose-ACSF, que é carbogenated e aquecida a 35 ° C. </li><li> Deixe as fatias de recuperar a 35 ° C por 30 min a partir do momento da última fatia de entrar no ACSF aquecido. Faça isso a fim de reativar os processos metabólicos e facilitar a relacração de processos neuronais cortadas. Em seguida, a transferência para a temperatura ambiente durante o armazenamento (Figura 1C). </li></ol> 2 Fabricação e Enchimento de gravação pipetas <ol><li> Pupipetas remendo ll de capilares de vidro, de modo que uma resistência de 2-4 mohms pipeta é conseguido quando cheio com filtrada (filtro de seringa, tamanho de poro: 0,2 um) uma solução intracelular contendo 0,1% de biocitina (para marcação intracelular). Manter a solução intracelular arrefecidas em gelo para evitar a degradação dos seus constituintes. </li><li> Encha pipetas remendo para identificação de correntes pós-sinápticos com uma solução contendo um baixo Cl fisiologicamente relevante - concentração (E R (Cl) = -61 mV; ver lista solução). </li><li> Para gravações emparelhados para identificar as respostas mediadas pelo receptor pré-sináptico, preencha pipetas de patch com a solução intracelular com baixo Ca 2 + capacidade tampão para evitar a interferência com a liberação do transmissor pré-sináptica, bem como quatro vezes maior Cl - concentração (E R (Cl) = -20 mV) para melhorar a relação sinal-ruído de IPSCs observados 5, permitindo a avaliação precisa de resp farmacológicoonsiveness. Note que a alteração Cl - concentração pode alterar a cinética da IPSC 15. </li></ol> 3. Whole Cell Gravação patch-clamp de FS-ins <ol><li> Carbogenate ACSF e alimentar através do sistema de perfusão à câmara de gravação, por meio de uma bomba peristáltica (que também remove o ACSF da câmara de registo através de uma linha de sucção, a Figura 2A). Ligue todos os equipamentos da instalação, em preparação para a gravação. </li><li> Transferir uma fatia para a câmara de gravação e fixe com um anel de platina amarrado com fibras individuais de seda. Posicionar a fatia de modo a que o estrato piramidal (str.) De CA1 corre verticalmente através do campo de visão, que permite o acesso com duas pipetas de tanto o str. radiatum e str. oriens simultaneamente (Figuras 2C e 4A). </li><li> Coloque a câmara para a instalação e começar a perfusão de carbogenated e aquecida (32-34 ° C) a gravação de umCSF a um caudal de 5-10 ml / min. </li><li> Avalie a qualidade fatia sob a ótica IR-DIC em 40X objetivo, e visualize com uma câmera CCD visualizado em um display. Assuma boa qualidade fatia se um grande número de células contrastadas, moderadamente piramidais CA1 redondas (CA1 PC) pode ser visto em str. pyramidale em profundidades de 20-30 mM abaixo uma superfície lisa e levemente crateras (Figura 2C). Fatias de má qualidade contêm um grande número de alto contraste, as células encolhidas ou inchados, com uma superfície de corte irregular. </li><li> Identificar FS putativos interneurônios sob iluminação de epifluorescência como aqueles que expressam Venus / YFP (Figura 2B), com grande somata multipolar dentro ou perto do str. pyramidale. Selecione as células razoavelmente profunda dentro da fatia (50-100 um, Figura 2C), a fim de melhor preservar a sua integridade morfológica. </li><li> Monte o eletrodo de registro no suporte da pipeta sobre a headstage; então apply uma baixa pressão, positivo (20-30 mbar) através da linha de tubos. Diminuir a pipeta para a superfície da fatia, ligeiramente deslocada para o centro do neurónio seleccionado. </li><li> Obter configuração de gravação de células inteiras, como descrito anteriormente 14,16 e ver também Figuras 2D e 2E: <ol><li> Alvo de um celular: Aumenta a pressão para 70-80 mbar e reduzir rapidamente a pipeta através da fatia um pouco acima da soma da célula selecionada (Figura 2D, em cima). </li><li> Aproxime-se da célula: Pressione a pipeta contra a membrana da célula para produzir uma &quot;covinha&quot; sobre ele (Figura 2D, em cima). Executar este passo rapidamente, a fim de evitar a rotulagem biocitina de células vizinhas. </li><li> Criar um selo giga-ohm: Solte a pressão e, simultaneamente, aplicar um comando de tensão 20 mV para a pipeta. Um selo giga-ohm (1-50 GÊ; Figura 2D, fundo e figura 2E meio) Neossoloaliado desenvolve rapidamente. Uma vez selado, aplicar o potencial de repouso da membrana esperado (tipicamente entre -70 e -60 mV) como um comando de tensão. </li><li> Romper o patch: Uma vez fechado, romper o remendo de membrana com um curto pulso de pressão negativa; conseguindo assim a configuração de célula inteira (Figura 2E, parte inferior). </li></ol></li><li> Compensar capacitância de célula inteira e resistência em série (R S). R s é normalmente 5-20 mohms e estável por até 120 min. Abandonar as células se o potencial de membrana (V M) em break-through é mais despolarizada que -50 mV; R S é inicialmente maior do que 30 mohms; ou R S alterações por mais de 20% ao longo da gravação. </li><li> Identificar FS-ins por sua resposta (no modo atual-clamp) para uma família de hiper a despolarização pulsos de corrente (-250 a +250 pA, figura 2F, em cima). FS-ins têm relativamente despolarizado V M (tipicamente -50 to -60 mV), o curto tempo de membrana constante (&lt;20 ms) e responder a uma 500 pA despolarizante de injecção de corrente, com um trem de potenciais de acção (AP) a frequências&gt; 100 Hz 11 (Figura 2F, fundo), que são marcadamente diferentes daqueles em PCs CA1 (Figura 2F, no meio). </li></ol> 4. Extracelular Estimulação Elétrica para evocar respostas GABA B R-mediadas <ol><li> Para observar as respostas synaptically evocados, posicionar um eletrodo extracelular estimulação (uma pipeta de patch cheio de 2 M NaCl; Resistance: 0,1-0,3 mohms) na fatia na fronteira de str. radiatum e str. lacunosum-moleculare. Posicione o eletrodo de 200-300 mM lateral à soma para evitar a estimulação elétrica direta do celular e minimizar artefatos de estimulação (Figura 3A). </li><li> Uma vez que o eléctrodo de estimulação está posicionado, obter gravação de células inteiras dea célula e escolhido avaliar o fenótipo fisiológico no modo de corrente grampo como na secção 3.9 (Figura 3B). </li><li> Com o neurônio registrado em tensão-clamp (V M -65 mV), entregar a estimulação elétrica de axônios pré-sinápticos a 50 V (~ 500 uA estímulo eficaz) a cada 20 segundos, utilizando um isolado de tensão constante estimulador. Use único estímulos (100 ms de duração, Figura 3C, em cima) para observar GABA B R IPSCs mediadas, e intercalar com os trens de múltiplos estímulos (a 200 Hz) para produzir uma maior liberação do transmissor. </li><li> Banheira aplicar antagonistas dos receptores ionotrópicos do glutamato (receptores de AMPA: DNQX [10 mM]; receptor de NMDA: d-AP5 [50 uM]) para revelar o isolado monossináptico IPSC (Figura 3C, média superior). Além disso isolar o IPSC GABA B R-mediada com a aplicação de um bloqueador de GABA A R (gabazine [10 mM]; Figura 3C meio lower). </li><li> Confirme a resultante slow-corrente para o exterior (Figura 3C inferior, expandido) como sendo GABA B R-mediada pela posterior aplicação de CGP-55.845 [5 mM] (Figura 3C inferior, sustentada em cinza) </li></ol> 5. emparelhados Gravações de synaptically acopladas FS-IN e PCs CA1 <ol><li> Avaliar o controle pré-sináptica GABA B R-mediada da transmissão sináptica inibitória com gravações simultâneas, realizadas entre synaptically-acoplados em pares e PC, conforme descrito abaixo. </li><li> Em primeiro lugar, estabelecer uma gravação de células inteiras de um interneuron pré-sináptico (como na seção 3) e confirmar o fenótipo FS (Figura 4A). </li><li> Então remendar um vizinho CA1 PC (20-100 distância um, Figura 4A) e aplicar breve suprathreshold despolarização pulsos de corrente (1 ms de duração, 1-5 nA amplitude) para a pré-sináptico IN (realizada em modo atual-clamp) para provocar APs. Se um co sinápticannection está presente, APs no resultado da IN em IPSCs no CA1 PC, realizado em tensão-clamp (compensar R S a cerca de 80%). </li><li> Se necessário, preencher um novo eletrodo de registro e registro de novos PCs CA1 até que uma conexão é encontrada. </li><li> Uma vez que uma conexão é estabelecida, obter pares de APs na pré-sináptico FS-IN para avaliar tanto a resposta sináptica unitário e comportamento dinâmico. Usar um protocolo típico de dois estímulos despolarizantes emparelhado-pulso com um intervalo de 50 ms (Figura 4B). </li><li> Coletar vestígios de controle em condições basais. Em seguida, aplicam-se as de GABA B baclofeno R agonistas selectivos (10 uM) para o ACSF de perfusão, activando assim Rs GABA B, seguido por o antagonista CGP-55845 (5 uM), para bloquear completamente os efeitos mediados pelo receptor. Recolhe ~ 50 traços durante o estado estacionário para cada condição da droga (Figura 4B e C). </li><li> Uma vez que a gravação for concluída, selar a membrana somática, formando uma outside-out patch: Lentamente retirar a pipeta do corpo celular em V-clamp e como os R S aumenta, reduzir a V M a -40 mV. Fazê-lo para facilitar a formação do penso fora para fora; em seguida, retire a pipeta da banheira. </li></ol> 6 Análise de propriedades eletrofisiológicas <ol><li> NOTA: Uma multidão de diferentes pacotes de software estão disponíveis para a aquisição de dados eletrofisiológicos. Aqui, WinWCP, um programa do Windows no pacote de Strathclyde Eletrofisiologia Software livre é usado, que permite a gravação de até 16 canais de entrada analógica e saída de 10 sinais digitais. </li><li> Filtro passa-baixa todos os dados 5-10 kHz e amostra a 20 kHz. </li><li> Analisar dados fisiológicos com uma suíte de análise off-line. NOTA: Stimfit, um pacote de software de fonte aberta, que inclui um shell Python, é usado neste caso; no entanto outras alternativas podem ser facilmente usados ​​em seu lugar. <ol><li> Analisar passiva membrana pROPRIEDADES de neurônios registrados, adquiridas em pinça de corrente, de potencial de repouso da membrana. </li><li> Medir o potencial de membrana em repouso média da linha de base de respostas registados a partir do início da gravação. </li><li> Calcule a resistência de entrada, usando a lei de Ohm, a partir da resposta de tensão para os mais pequenos pulsos de corrente hiperpolarizantes (≤ -50 PA). Para melhorar a relação sinal-ruído, vários traços médios. Nota: os exemplos são tipicamente médias de 10-50 varreduras individuais. </li></ol></li><li> Estime o tempo membrana aparente constante ajustando uma curva monoexponencial para a decadência das respostas aos mais pequenos pulsos de corrente hiperpolarizantes. </li><li> Analisar potencial de ação de forma de onda para determinar o limiar, amplitude (limite de pico) e duração (largura medida a meia altura) provocada por nível de limiar de despolarização pulsos de corrente. </li><li> Analise GABA B R IPSCs mediadas de gravações de fixação de tensão. Filtrar traça off-line em500 Hz (filtro de Gauss) e avaliar a amplitude do pico e latência da resposta mediada por GABA B R (em médias de pelo menos 10 traços). </li><li> Detectar o efeito de Rs GABAB na saída inibidora de Ins como uma alteração na amplitude de pico dos IPSCs GABA A R-mediadas medidos entre pico e de linha de base anterior. Calcule a amplitude média de ≥50 vestígios para o período de controle eo estado de equilíbrio de todas as épocas farmacológicos. </li></ol> 7 Visualização e Imunocitoquímica de FS-Ins <ol><li> Após as gravações, fixar as fatias por imersão em paraformaldeído a 4% com tampão fosfato 0,1 M (PB, pH = 7,35) S / N a 4 ° C. </li><li> Se fatias necessários podem ser transferidos para PB e armazenados durante ~ 1 semana antes da transformação. </li><li> Fatias Lavar abundantemente em PB fresco e, posteriormente, em 0.025 M PB com NaCl 0,9% (PBS, pH = 7,35). </li><li> Para reduzir o anticorpo não-específico de ligação, bloquear as fatias for 1 hora à temperatura ambiente numa solução contendo 10% de soro de cabra normal (NGS), 0,3% de Triton-X100 (um detergente para permeabilizar as membranas) e 0,05% de NaN 3, fez-se em PBS. </li><li> Para etiquetar para expressão PV, utilizar um anticorpo anti-PV monoclonal de ratinho diluído em uma solução contendo 5% de NGS, 0,3% de Triton-X100, 0,05% NaN 3, em PBS. Incubar anticorpos primários durante 2-3 dias a 4 ° C 12. Lavar cuidadosamente as fatias em PBS. </li><li> Aplicar anticorpos fluorescentes anti-ratinho secundário (por exemplo, AlexaFluor-546.) Juntamente com a biotina estreptavidina-proteína de ligação, conjugado com um fluorocromo (por exemplo, AlexaFluor-647); e incuba-se uma solução contendo 3% de NGS, 0,1% de Triton-X100, 0,05% NaN 3, diluído em PBS e incubar O / N a 4 ° C. </li><li> Liberalmente lavar fatias 2-3x com PBS, seguido por 2-3 lavagens em PB. Monte as fatias em lâminas de vidro. Usar um 300 um espaçador ágar para evitar o corte entre em colapso. Fatias Cover-derrapante com um FLUOREScento de montagem médio e vedação com unhas verniz. </li></ol> 8 Imagem e Reconstrução de Visualized FS-Ins <ol><li> Visualize as fatias utilizando um microscópio confocal de varredura, com o repórter fluorochome animado com a linha de laser apropriado (laser de diodo 635 nm para AlexaFluor-647; Hélio-Neon 543 nm para AlexaFluor-546 rotulagem para PV e Argon 488 ou 515 nm para Venus / YFP). </li><li> Tome imagens numa resolução Z apropriado (tipicamente 0,5-1 uM passos, usando uma objectiva de 20X) para produzir uma-pilha Z de toda a célula. Múltiplas pilhas são normalmente necessários para a imagem de toda a célula, que pode ser digitalmente costurados fora da linha utilizando FIJI / software ImageJ (Figura 5A). </li><li> Reconstruir a célula da pilha imagem montada utilizando um método de rastreamento semi-automática (plug-in simples Neurite Tracer no pacote de software FIJI / ImageJ 17, Figura C). </li><li> Por fim, avaliar a PV-imunorreatividade do interneuron com uma lente objetiva de alta abertura numérica (60X silício-imersão, NA = 1.3). Fazer imagens da soma, dendritos proximais e axônio proximal, ou, alternativamente, de terminais do axônio se washout somática do PV é muito forte. As células são consideradas imunorreactivo para PV-se marcação imuno é visto para se alinhar com as estruturas marcadas com biocitina (Figura 5B). </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Nós descrevemos um método que combina técnicas eletrofisiológicas e neuroanatômicas para caracterizar funcionalmente neurônios morphologically- e identificados neuroquimicamente in vitro; em especial, os diversos tipos de Ins inibitórios corticais. Os principais aspectos do processo são: (1) pré-seleção de potenciais INs; (2) gravação intracelular e visualização neurônio; e, finalmente, (3) análise morfológica e imunocitoquímica de Ins gravados. Embora este estudo dirigiu-ins PV, em particular, o prot...

Circuitos neuronais do hipocampo têm sido objecto de intenso escrutínio, no que diz respeito a ambos anatomia e fisiologia, devido ao seu papel essencial na aprendizagem e na memória, bem como navegação espacial em humanos e roedores. De igual modo, o proeminente, mas simples organização laminar do hipocampo torna esta região um objecto preferido de estudos sobre as propriedades estruturais e funcionais das redes corticais. Circuitos do hipocampo são constituídos por células excitatórias principais (&gt; 80%) e um menor (10-20%), mas coorte altamente diversificada de interneurónios inibitórios 1-3. Interneurônios libertar ácido γ-aminobutírico (GABA) a partir dos seus terminais de axónios, que actua em receptores ionotrópicos rápido GABA A (GABAA Rs) e receptores de GABA B metabotrópicos lentas (Rs GABA B) 4. Estes mecanismos inibidores contrabalançar excitação e regular a excitabilidade de células principais, e, assim, otempo ir e padrão de descarga. No entanto, o GABA libertado interneurónios actua não só em células principais, mas também nos próprios 5,6 interneurónios. Receptores pré e pós-sinápticos mediar regulação por feedback e interações mútuas inibitórios entre os vários tipos de interneuron. Estes mecanismos inibitórios em redes interneuron se acredita serem fundamentais para a geração e formação de padrões de atividade da população, em especial as oscilações em diferentes freqüências 7. De célula inteira gravação patch-clamp é um método bem estabelecido para o exame das propriedades intrínsecas e interações sinápticas de neurônios. No entanto, devido à grande diversidade de tipos de Interneuron, investigação de interneurónios inibitórios requer rigorosa identificação das células gravadas. Como tipos interneuron hipocampo são características distintas morfológicas e neuroquímicas expressão do marcador, anatômico combinado e imunocitoquímica eXAME pode fornecer um meio para determinar preciso 6,8,9 identidade interneuron. No presente trabalho, descrevemos uma abordagem experimental em que de célula inteira gravações de patch-clamp de neurônios individuais ou pares synaptically acoplados são combinados com rotulagem intracelular, seguido pelo post-hoc análise morfológica e imunocitoquímica, permitindo a caracterização de lento GABA B mediada pelo receptor efeitos inibitórios em interneurónios identificados. Como exemplo, vamos nos concentrar em um tipo principal de interneuron, um subconjunto das chamadas &quot;células cesta&quot; (BC), que inerva o Soma e proximal dendritos de suas metas pós-sinápticos e é caracterizada por um &quot;spiking rápido&quot; (FS) descarregar padrão, um axónio densamente cobrindo a camada de corpo celular e a expressão da proteína de ligação a parvalbumina de cálcio (PV) 10,11. Esses interneurônios exibir grandes correntes inibitórios pós-sinápticos, bem como pré destaquemodulação sináptica da sua saída sináptica, em resposta ao GABA B R activação 12. A combinação das técnicas aqui descritas podem ser aplicadas igualmente bem para investigar mecanismos intrínsecos ou sinápticas em uma variedade de outros tipos de neurónios identificados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="725">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:175px;">Name</td>
			<td style="width:148px;">Company</td>
			<td style="width:152px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:251px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Transgenic vGAT-venus rats</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">see Uematsu et al., 2008</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Venus (515&#160;nm) goggles</td>
			<td style="width:148px;">BLS Ltd., Hungary</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Dissection tools</td>
			<td style="width:148px;">i.e. FST</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">For brain removal</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Vibratome</td>
			<td style="width:148px;">Leica</td>
			<td style="width:152px;">VT1200S</td>
			<td style="width:251px;">Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Slice holding chambers</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Custom-made in lab</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Upright IR-DIC microscope</td>
			<td style="width:148px;">Olympus, Japan</td>
			<td style="width:152px;">BX50WI</td>
			<td style="width:251px;">With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">CCD camera</td>
			<td style="width:148px;">Till Photonics</td>
			<td style="width:152px;">VX55</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">505 nm LED system</td>
			<td style="width:148px;">Cairn Research</td>
			<td style="width:152px;">OptiLED system</td>
			<td style="width:251px;">Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Multiclamp 700B&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:251px;">Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">WinWCP acquisition software</td>
			<td style="width:148px;">John Dempster, Strathclyde University</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Electrode Puller</td>
			<td style="width:148px;">Sutter</td>
			<td style="width:152px;">P-97</td>
			<td style="width:251px;">Used with box-filament</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Borosilicate pipette glass</td>
			<td style="width:148px;">Hilgenberg, Germany</td>
			<td style="width:152px;">1405020</td>
			<td style="width:251px;">2&#160;mm outer, 1&#160;mm inner diameter, no filament</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:148px;">Gilson</td>
			<td style="width:152px;">Minipuls</td>
			<td style="width:251px;">Other pumps or gravity feed could be used instead</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Digital Thermometer</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Custom made</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Digital Manometer</td>
			<td style="width:148px;">Supertech, Hungary</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="34" rowspan="2" style="height:34px;width:175px;">Isolated constant voltage stimulator</td>
			<td rowspan="2" style="width:148px;">Digitimer, Cambridge</td>
			<td rowspan="2" style="width:152px;">DS-2A</td>
			<td rowspan="2" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="17">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="34" rowspan="2" style="height:34px;width:175px;"><a name="RANGE!A19:D34">Biocytin</a></td>
			<td rowspan="2" style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td rowspan="2" style="width:152px;">B1592</td>
			<td rowspan="2">Otherwise known as &#949;-Biotinoyl-L-Lysine&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">DL-AP5(V) disodium salt</td>
			<td style="width:148px;">Abcam Biochemicals</td>
			<td style="width:152px;">ab120271</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">DNQX disodium salt</td>
			<td style="width:148px;">Abcam Biochemicals</td>
			<td style="width:152px;">ab120169</td>
			<td style="width:251px;">Alternatively NBQX or CNQX</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Gabazine (SR95531)</td>
			<td style="width:148px;">Abcam Biochemicals</td>
			<td style="width:152px;">ab120042</td>
			<td style="width:251px;">Alternatively bicuculline methiodide</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">R-Baclofen</td>
			<td style="width:148px;">Abcam Biochemicals</td>
			<td style="width:152px;">ab120325</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">CGP-55,845 hydrochloride</td>
			<td style="width:148px;">Tocris</td>
			<td style="width:152px;">1248</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Streptavidin 647</td>
			<td style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:152px;">S32357</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">anti-PV mouse monoclonal antibody</td>
			<td style="width:148px;">Swant, Switzerland</td>
			<td style="width:152px;">235</td>
			<td style="width:251px;">Working concentration 1:5000-1:10,000</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">anti-mouse secondary antibody&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:152px;">A11030</td>
			<td style="width:251px;">If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:148px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:152px;">S-1000</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Microscopy slides</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Any high quality brand&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Glass coverslips</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Usually 22 x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Agar spacers</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Agar block, cut on vibratome to 300 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Laser scanning confocal microscope</td>
			<td style="width:148px;">Olympus, Japan</td>
			<td style="width:152px;">Fluoview FV1000</td>
			<td style="width:251px;">Or other comparable system</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Fiji (Fiji is just ImageJ)</td>
			<td>http://fiji.sc/Fiji</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">See Schindelin et al., 2012</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons

GABAérgicos interneurónios inibitórios desempenham um papel central em circuitos neuronais do cérebro. Interneurônios compreendem um pequeno subconjunto da população neuronal (10-20%), mas mostram um alto nível de heterogeneidade fisiológica, morfológica e neuroquímica, refletindo suas diversas funções. Portanto, a investigação de interneurônios fornece importantes insights sobre os princípios de organização e função dos circuitos neuronais. Isso, no entanto, requer uma abordagem fisiológica e neuroanatomical integrada para a seleção e identificação dos tipos interneuron individuais. Whole-cell patch-clamp gravação de fatias cerebrais agudos de animais transgénicos, que expressam proteínas fluorescentes sob os promotores de marcadores específicos de Interneuron, fornece um método eficiente para alvejar e electrofisiologicamente caracterizar as propriedades intrínsecas e sinápticos dos tipos Interneuron específicos. Combinado com marcação com corante intracelular, esta abordagem pode ser estendida com post-hoc moanálise rphological e imunocitoquímica, permitindo a identificação sistemática dos neurônios registrados. Estes métodos podem ser adaptados para atender uma ampla gama de questões científicas a respeito propriedades funcionais de diversos tipos de neurônios corticais.

Desde que a qualidade é apreciável fatia boa, registrando tanto PCs CA1 e FS-ins podem ser alcançados com um mínimo de dificuldade. A linhagem de ratos transgênicos expressando Venus / YFP sob o promotor vGAT 13 não inequivocamente identificar FS-ins, ou de fato BCs. No entanto gravações de INs e em torno de str. piramidal, em que a densidade de FS-ins é tipicamente uma alta, resulta em um maior probabilidade de seleccionar FS-Ins (Figura 2B). FS-ins podem ser dis...

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Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Redes corticais são controlados por um conjunto de pequenos, mas diversificada de interneurónios inibitórios. Investigação funcional dos interneurônios, portanto, requer a gravação específica e rigorosa identificação. Descrito aqui é uma abordagem conjunta, envolvendo gravações de células inteiras de pares simples ou synaptically acoplados de neurônios com rotulagem intracelular, post-hoc Análise morfológica e imunocitoquímica.

Whole-cell Recordings patch-clamp de Morphologically- e identificados Neuroquimicamente hipocampo Interneurônios

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

whole-cell-patch-clamp-recordings-from-morphologically

Research

JoVE Journal

Neuroscience

24.3K visualizações.  Charité Universitätmedizin.  Redes corticais são controlados por um conjunto de pequenos, mas diversificada de interneurónios inibitórios. Investigação funcional dos interneurônios, portanto, requer a gravação específica e rigorosa identificação. Descrito aqui é uma abordagem conjunta, envolvendo gravações de células inteiras de pares simples ou synaptically acoplados de neurônios com rotulagem intracelular, post-hoc Análise morfológica e imunocitoquímica. 

Vídeo: Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Remendo Recordings Grampo de neurônios da retina do rato em um Preparação Slice Dark-adaptados

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Neurociência

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

Gravações patch emparelhado Grampo da Motor-neurônio e músculo alvo ósseas em Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

Gravações patch clamp em células ciliadas da orelha interna Isolado de Zebrafish

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

Todo patch clamp celular para investigar os mecanismos de estimulação neural Infrared

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

Grampo patch Gravações de Embryonic Cells Zebrafish Mauthner

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Emparelhados Recordings células inteiras em organotï¿½icas fatias do hipocampo

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Gravações de células inteiras de patch-clamp em Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subcelulares Gravações patch-clamp do domínio somatodendrítico da substância negra dopamina Neurônios

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.

Full-cell Patch-clamp Gravações para determinação eletrofisiológica de Ion Selectivity em Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to amplify the weak vibration of low-level sound signal. The morphology and electrophysiological property of outer hair cells (OHCs) develop in early postnatal ages. The maturation of outer hair cell may contribute to the development of the auditory system. However, the process of OHCs development is not well studied. This is partly because of the difficulty to measure their function by an electrophysiological approach. With the purpose of developing a simple method to address the above issue, here we describe a step-by-step protocol to study the function of OHCs in acutely dissociated cochlea from postnatal rats. With this method, we can evaluate the cochlear response to pure tone stimuli and examine the expression level and function of the motor protein prestin in OHCs. This method can also be used to investigate the inner hair cells (IHCs).

This protocol describes methods to record the auditory brainstem response from postnatal rat pups. To examine the functional development of outer hair cells, the experimental procedure of whole-cell patch clamp recording in isolated outer hair cells is described step-by-step.

Auditivo de tronco encefálico e exterior cabelo célula célula inteira Patch Clamp gravação em ratos pós-natal

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...