Angesichts der Komplexität der Ubiquitinations- und Deubiquitinationsreaktionen in den Zellen ist es wichtig, In-vitro-Assays mit definierten gereinigten Komponenten zu etablieren. Dies hilft, die Mechanismen der Ubiquitination und Deubiquitination zu verstehen und auch zu bestimmen, wie Mutationen im Zusammenhang mit Genen, die die Enzyme kodieren, die für diese Reaktion verantwortlich sind, menschliche Krankheiten verursachen können. Wir können die Bereiche und Motive in diesen Komponenten identifizieren, die diese Reaktionen antreiben.
Wir können auch Bildschirmtests mit hohem Durchsatz entwickeln, die verwendet werden können, um auf kleine Molekülinhibitoren zu untersuchen, die als potenzielle Therapeutika entwickelt werden können. Um mit der Bakterienlyse zu beginnen, fügen Sie PMSF und Antiprotease-Cocktail in den eiskalten Lysepuffer A. Fügen Sie 25 Milliliter des Lysepuffers A in die Flasche mit Bakterienpellet ein und setzen Sie das Pellet wieder auf. Übertragen Sie das lysathaltige Bakterien in ein Rohr zur Beschallung.
Verwenden Sie einen Sondenschalltonor, um das Lysat bei 70%Output-Amplitude für 30 Sekunden, vier- bis fünfmal zu beschallen. Dann Zentrifuge bei 21.000 mal g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Inkubation der Bakterien lysiert mit GSH-Perlen für fünf Stunden nach dem Manuskript, übertragen Sie die Perlen zusammen mit 10 Milliliter Puffer in eine leere Chromatographie-Säule.
Dann fügen Sie 1,5 Milliliter Puffer A mit 25 Millimolar Glutathion in die Spalte und sammeln Sie die Elution durch Schwerkraft in 1,5 Milliliter Mikroröhren. Wiederholen Sie das Elutionsverfahren viermal mit frischem Puffer A eine weitere Behandlung der eluierten Fraktionen nach dem Manuskript. Zunächst sollten die Bakterienpellets His-BAP1 und MBP-DEUBAD in 25 Millilitere eiskaltelysepuffer B.Mix 25 Milliliter jedes Lysats wieder ausgesetzt und 15 Minuten lang auf Eis brütet werden.
Das Lysat 21.000 mal g 20 Minuten lang beschallen und zentrifugieren. Nach der Lysatzentrifugation das Lysat durch einen 0,45 Mikrometer Porenspritzenfilter in eine Flasche filtern und mit den Nickel NTA Perlen vermischen. Bei vier Grad Celsius mit Schütteln für fünf Stunden inkubieren.
Danach drehen Sie die Perlen bei 25.000 mal g für drei Minuten. Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand in einem 50-Milliliter-Rohr zu speichern, während der Durchfluss durchfließt. Waschen Sie die Perlen mit fünf MilliliterPuffer B, die 20 Millimolar Imidazol enthalten, sechsmal mit dreiminütiger Zentrifuge.
Nach der letzten Wäsche die Perlen mit 10 Milliliter Puffer B in eine leere Chromatographiesäule geben und einen Milliliter Puffer B mit 200 Millimolar-Imidazol hinzufügen. Sammeln Sie die Elution durch Schwerkraft in 1,5 Milliliter Mikroröhren, die DTT und EDTA enthalten. Wiederholen Sie den Elutionsvorgang viermal und bündeln Sie die gewünschten eluierten Fraktionen in einem 15-Milliliter-Rohr.
Fügen Sie Puffer C hinzu, um den eluierten Komplex dreimal zu verdünnen. Dann die verdünnte Elution auf die vorbereiteten Amyloseperlen in Röhren übertragen und über Nacht bei vier Grad Celsius mit Schütteln bebrüten. Am Morgen zentrieren Sie die Rohre bei 2, 500 mal g für drei Minuten und halten Sie den Überstand in einem 15 Milliliter Rohr als Durchfluss.
Waschen Sie die proteingebundenen Perlen mit fünf MilliliterPuffer C fünf- bis sechsmal. Dann fügen Sie 500 Mikroliter Puffer D in den gereinigten His-BAP1/MBP-DEUBAD-Komplex auf den Amylose-Agarose-Perlen hinzu, um eine 50%ige Perlenlösung herzustellen. 20 Mikroliter der 50%perlenlösung in ein Mikrozentrifugenrohr übertragen und 20 Mikroliter des zweifachen Laemmli-Probenpuffers für die SDS-PAGE- und Coomassie-Blauanalyse hinzufügen.
Bewahren Sie die verbleibende Perlenlösung bei minus 80 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung auf. Nach der Kultur der HEK293T-Zellen, Platte 12 Millionen Zellen in 20 Milliliter von kompletten Medien in einem 15 Zentimeter Kulturgericht, einen Tag vor der Transfektion. Nach einem Tag, unter der Zellkulturhaube, aspirieren Medien und Versorgung mit 12 Milliliter serum freie Medien.
Transfekte die Zellen mit 21 Mikrogramm pCDNA flat-H2A mit 63 Mikroliter PEI bei einem Milligramm pro Milliliter. Wechseln Sie nach 12 Stunden auf das komplette Medium. Nach der Ernte der Zellen nach dem Manuskript, resuspendieren Sie das Zellpellet in etwa 10 Bände Puffer E enthalten NEM, um Deubiquitinasen zu hemmen und Sie brüten auf Eis für 20 Minuten.
Nach der Zentrifugation bei 3.000 mal g für fünf Minuten, entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie das Chromatinpellet zweimal mit 10 Bändepuffer E und waschen Sie dann zweimal mit Puffer F.Resuspend das Chromatin in fünf Milliliter Puffer F und behandeln Sie das Pellet mit Mikrokokken-Nuklease in der Konzentration von drei Einheiten pro Milliliter für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation einen 40-Mikroliter-Aliquot der Mischung zur Analyse nukleosomaler DNA-Fragmente in ein 1,5-Milliliter-Rohr übertragen.
40 Mikroliter Phenol-Chlorform und 20 Mikroliter sechsfachen DNA-Ladepuffer hinzufügen. Wirbel und Drehen bei 18.000 mal g für zwei Minuten. Dann übertragen Sie 15 Mikroliter der wässrigen Phase in einem 2%Agarose-Gel, um die DNA zu laden.
Nachdem Die Reaktion und Zentrifugation nach dem Manuskript gestoppt wurde, inkubieren Sie die lösliche Chromatinfraktion mit Anti-Flag-Harzperlen in einem 15-Milliliter-Rohr über Nacht bei vier Grad Celsius mit Schütteln. Waschen Sie die Perlen sechsmal mit Puffer G.Transfer die Perlen mit fünf Milliliter Puffer G in eine leere Chromatographie-Säule. Verdünnen Sie die gebundenen Nukleosomen der Perle mit 260 Mikroliter Puffer G, die 200 Mikrogramm pro Milliliter Flaggenelutionspeptid und ein bis fünf molar Tris bei pH acht enthalten.
Elute die Nukleosomen dreimal, eine Stunde im kalten Raum. Um einen Ubiquitinationstest durchzuführen, fügen Sie zunächst ein Mikrogramm der gereinigten Nukleosomen in 40 Mikroliter Puffer H hinzu. Danach fügen Sie einen Enzymlösungsmix mit 250 Nanogramm UBE1, 672 Nanogramm UB und E2 UB konjugierenden Enzymen und einem Mikrogramm BMI1-RING1B E3-Ubiquit-Ligase-Komplex in die Röhre ein. Inkubieren Sie die Reaktion für drei Stunden bei 37 Grad Celsius mit gelegentlichem Schütteln.
Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 40 Mikroliter des zweifachen Laemmli-Probenpuffers hinzufügen und die Histon-H2AK119-Ubiquitination durch Western-Blotting analysieren. Zur Durchführung des In-vitro-Deubiquitinations-Assays setzen Sie die gereinigten Nukleosomen in 40 Mikroliter Puffer I und einem Mikrogramm von Bakterien gereinigt His-BAP1/MBP-DEUBAD Perlen. Legen Sie die Röhre in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius für drei Stunden, um die Deubiquitinationsreaktion mit gelegentlichem Schütteln durchzuführen.
Dann stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 40 Mikroliter des zweifachen Laemmli Puffer summieren und durch Immunoblotting analysieren. In diesem Experiment zeigt Die Coomassie-Blaufärbung für eine typische Reinigung des GST-BM1-RING1B-Komplexes mit GST-Affinitätsperlen, dass die Bänder bei erwarteten Molengewichten um 45 Kilodalton bzw. 13 Kilodaltonwandern. Ebenso führte die Reinigung des His-BAP1 MBP-DEUBAD-Komplexes zu relativ hohen homogenen Präparaten mit Bändern um 90 Kilodalton bzw. 55 Kilodalton.
Auf der anderen Seite besteht die gereinigte nukleosomale Fraktion im Wesentlichen aus einem 147 Basispaarband, das auf das Vorhandensein einer hoch angereicherten mononukleosomalen Fraktion hinweist. Die Coomassie-blaue Färbung von gereinigten Nukleosomen zeigt ein typisches Bandmuster der vier Histon-Untereinheiten mit stoichiometrischen Mengen. Die Ubiquitination des Histon-H2A mit dem BMI1-RING1B-Komplex zeigt eine zeitabhängige Zunahme der ubiquitinierten Form des Proteins, während gleichzeitig die Konzentrationen der nicht modifizierten Form verringert werden.
Die Ubiquitinationsreaktion ist insgesamt, da praktisch alle H2A-Proteine in H2A K119ub umgewandelt werden. Auf der anderen Seite wurde Deubiquitination Assay durchgeführt native Nukleosomen. Nach der Inkubation dieser Nukleosomen mit BAP1-DEUBAD wurde eine zeitabhängige Reduktion des H2A K119ub-Signals beobachtet.
Der Erfolg von Ubiquitinations- und Deubiquitinationsreaktionen hängt von der Art und Weise ab, wie das Protein gereinigt wird. Wir brauchen einen guten Ertrag, und die Puffernutzung für die Proteinresuspension und -reinigung sollte mit biochemischen Reaktionen kompatibel sein. Wenn diese Ubiquitination und Deubiquitination Assays gut etabliert sind, können wir die Affektoren und Inhibitoren sowie die Auswirkungen von krankheitsassoziierten Genmutationen testen.
Diese Methode wurde durch den Beitrag mehrerer Laboratorien etabliert und ist sehr nützlich, um die Mechanismen der Ubiquitination und Deubiquitination zu verstehen. Mehrere Chemikalien sind gefährlich und müssen in der Haube manipuliert werden. Dazu gehören Phenol-Chloroform, Säuren, Basen und Reduktionsmittel.
