Die dosierte es wird für eine effiziente ChIP-Sequenzierung von Ester und Nicht-Ester-Proteine in braunem Lipidgewebe von der Maus isoliert durchgeführt. Der Hauptvorteil der Technik ist, dass das Protokoll für eine effiziente Immunpräzipitation von Chromatin-assoziierten Komplexen aus dem Lipidgewebe optimiert wurde. Vor dem Einschnitt die eingeschläferte Maus mit 70% Ethanol besprühen.
Legen Sie die Maus mit dem Rücken nach oben, dann machen Sie einen Schnitt entlang des Halses. Als nächstes, setzen BAT direkt unter der Haut zwischen den Schultern und vorsichtig entfernen Sie die dünne Schicht von weißem Fett. Vernetzen Sie jedes BAT-Pad in 10 Milliliter PBS mit 1%Formaldehyd für 15 Minuten bei 150 Umdrehungen bei Raumtemperatur.
Nach 15 Minuten die Vernetzung durch Zugabe von 2,5 Molarenglycin in die BVT ablöschen, was zu einer Endkonzentration von 125 Millimolaren führt. Legen Sie es fünf Minuten lang auf einen Shaker und drehen Sie ihn bei 150 Umdrehungen bei Raumtemperatur. Anschließend das BAT-Pad auf 500 Mikroliter hypotonischen Lysepuffer übertragen und für jedes BAT-Pad zwei Edelstahlperlen hinzufügen.
Verwenden Sie dann einen auf Perlen basierenden Gewebehomogenisator, um das Gewebe zu zerkleinern. Beginnen Sie mit fünf Minuten bei maximaler Leistung. Bei Bedarf verlängern Sie die Zeit, bis das Gewebe homogenisiert und einzelne Zellen getrennt werden.
Die Probe in ein neues Rohr geben und bei vier Grad Celsius bei 16 000 G für 10 Minuten zentrifugieren. Nach 10 Minuten den Überstand in eine neue Röhre geben und das Zellpellet auf Eis halten. Zentrifugieren Sie den Überstand bei vier Grad Celsius bei 16.000 G für 10 Minuten, um den Verlust schwimmender Zellen zu verhindern.
Entsorgen Sie dann den letzten Überstand und setzen Sie beide Zellpellets zusammen in 300 Mikroliter SDS-Lysepuffer mit einem einmaligen Proteasehemmer wieder auf. 10 Minuten auf Eis bebrüten. Als nächstes beschallen Sie die Lysate, um DNA-Fragmente zu erzeugen, die 200 bis 500 Basenpaare lang sind.
Nach der Beschallung entfernen Sie die Trümmer durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 16.000 G bei vier Grad Celsius. Um Eine Immunpräzipitation durchzuführen, halten Sie 1% der Chromatinlösung als ChIP-Eingang beiseite und halten Sie die Eingänge über Nacht bei vier Grad Celsius. Als nächstes fügen Sie den ChIP-Antikörper zu einem Milliliter Chromatinlösung hinzu und führen Sie parallele Immunpräzipitation mit entsprechendem Vorimmun-IgG oder normalem IgG derselben Spezies durch.
Alternativ können Sie einen Milliliter Chromatinlösung für eine Antikörperregelung sparen. Über Nacht bei vier Grad Celsius mit Rotation inkubieren. Um die Immunkomplexe zu sammeln, fügen Sie 50 Mikroliter Protein A Agarose 50%Slurry in die Immunkomplexe und inkubieren für eine Stunde bei vier Grad Celsius mit Rotation bei 150 RPM.
Nach einer Stunde pellet die Perlen durch Zentrifugation für eine Minute bei 1000 mal G bei vier Grad Celsius. Führen Sie sequenzielle Waschungen der Perlen auf 0,45 Mikrometer PVDF-Zentrifugalfiltersäulen mit Puffern mit zunehmender Stringenz durch, indem Sie zuerst die Perlen in den Säulen mit 500 Mikroliter n niedrigem Salzwaschpuffer übertragen. Dann pellet die Perlen in den Säulen für drei Minuten bei 2500 G.Discard den Durchfluss.
Wiederholen Sie die Wäsche mit hohem Salzwaschpuffer nach den verfahren für die Salzwäsche. Wiederholen Sie dann die Verfahren mit Lithiumchlorid und schließlich mit einem Mal TE. Nachdem die Waschungen abgeschlossen sind, werden die Immunkomplexe durch Zugabe von 300 MikroliterElutionspuffer zu den Pelletperlen in den Säulen elute. Inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für 30 Minuten auf einem Shaker bei 400 RPM.
Anschließend die Elute sammeln, indem Sie die Säulen für drei Minuten bei 2500 G in einem frischen Rohr abspinnen. Umkehren Sie die Querverbindungen, indem Sie die Elute und DieEingänge bei 65 Grad Celsius über Nacht inkubieren. Um die DNA wiederherzustellen, fügen Sie 300 Mikroliter Phenolchloroform IAA in die Elute und Eingänge mit einem Verhältnis zu eins und Wirbel für 10 Sekunden hinzu.
Als nächstes drehen Sie bei 21.000 G bei vier Grad Celsius für 20 Minuten nach unten. Bewahren Sie das Pellet auf und entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie das Pellet mit einem Milliliter kaltem 70%Ethanol.
Dann drehen Sie sich bei 21.000 G bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und trocknen Sie das Pellet an der Luft. Das Pellet in 70 Mikroliter DNAse-freiem Wasser für weitere Verfahren wieder aufhängen.
Hier ist ein Beispiel für ChIP Q PCR mit BAT isoliert von Wildtyp oder GPS2-A Knockout Mäuse. Da sich herausgefunden hat, dass GPS2 für die Expression kernkodierter mitochondrialer Gene in verschiedenen Zelllinien erforderlich ist, wurde die Rekrutierung von GPS2 an zwei spezifischen kernkodierten mitochondrialen Genen getestet. NDUFV1 und TOMM20 in BAT von Mäusen als Beispiele für ein Gewebe, das in Mitochondrien hoch angereichert ist.
Die Belegung des GPS2-Promoters wurde in GPS2-A-Knockout-Mäusen und wildtypigen Briefkameraden verglichen. Ein erwarteter Rückgang der GPS2-Bindung an selektive Zielgene in der BVT von GPS2-A-Knockout-Mäusen wurde beobachtet. Mit dem hier beschriebenen Protokoll wurde eine erhöhte Bindung der RNA-Polymerase zwei und das repressive Histonzeichen H3K9ME3 im BVT von GPS2-A Knockout-Mäusen im Vergleich zu wildtypen Briefkameraden aufgezeichnet.
Diese Ergebnisse bestätigen die Rekrutierung von GPS2 für ausgewählte kernkodierte mitochondriale Gene und zeigen, dass GPS2 erforderlich ist, um die Anhäufung von H3K9ME3 zu verhindern und somit für das Abschalten der Pol-zwei-Transkriptionsaktivität an Zielförderern erforderlich ist. Das hier beschriebene Protokoll stellt, auch wenn es speziell für das braune Fettgewebe optimiert ist, ein wertvolles Werkzeug für die Durchführung von ChIP aus anderen murinen und menschlichen Geweben dar. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Phenochloroform extrem gefährlich sein kann.
Daher ist es extrem wichtig, immer unter der Dunstabzugshaube zu arbeiten, während dieses Reagenz verwendet wird.
