Arbeit in der Autoren Labor wird durch einen Zuschuss aus dem National Institute of General Medical Sciences (GM41628) und durch einen Zuschuss an die Stowers Institut für medizinische Forschung von der Helen Nelson Medical Research Fund in der Greater Kansas City Community Foundation unterstützt.

1. Erzeugung und Kultur der HEK293 Stabile Zelllinien, Ganzkörperansicht oder Mutant Versionen von FLAG-Epitop-markierten INO80 oder Andere INO80 Komplexe Untereinheiten <ol><li> Klon-cDNA in voller Länge oder mutierte menschliche INO80 ATPase-Untereinheit oder eine andere INO80 in den Säugetierexpressionsvektor pcDNA5 / FRT mit einer in-frame, N terminalen FLAG-Epitop-Tag kodiert. </li><li> Bestätigung der Sequenz der insertierten cDNAs durch DNA-Sequenzierung, bevor fortgefahren wird. </li><li> Um die Transfektion durchzuführen, wachsen Flp-In HEK293-Zellen in 10 cm-Gewebekulturplatten in einem Medium, das DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium), 5% Glutamin und 10% FBS (fötales Rinderserum). </li><li> Wenn die Zellen ~ 70% Konfluenz in den einzelnen Gewebekulturschale ein Gemisch von 40 ul FuGENE6 Transfektionsreagenz, 0,5 ug der geeigneten pcDNA5 / FRT-Expressionsplasmid, und 9,5 ug pOG44, die Flp-Rekombinase kodiert, in einem Gesamtvolumen 800 ul. </li><li> 48 Stunden später, Trypsinize und split Zellen in einem Verhältnis von 1:30 in 10-cm-Schalen, und sie wachsen in DMEM mit 5% Glutamin, 10% FBS und 100 ug / ml Hygromycin B für 3 - 4 Wochen. Ändern Sie den Kulturmedium, wenn es zu vergilben beginnt (in der Regel alle 3 - 5 Tage). </li><li> Um positive Klone, die die höchste Stufe der FLAG-markierten Protein exprimieren zu identifizieren, wählen Sie einzelne Hygromycin B-resistente Kolonien und sie auf einer einzigen Vertiefung einer 24-Well-Platte. <ol><li> Sobald die Zellen Konfluenz erreichen 80%, Ernten der Zellen aus jeder Vertiefung in ~ 1 ml PBS und Pellet durch Zentrifugation bei 1.000 × g für 5 min. </li><li> Nach Entfernen des Überstands, Resuspendieren des Zellpellets in 60 ul SDS-PAGE-Probenpuffer. </li><li> Betreff Hälfte des Zellpellet resuspendiert SDS PAGE und Western-Blot auf die Expression des FLAG überwachen getaggt Köder-Protein; speichern Sie die andere Hälfte für zukünftige Analysen. </li></ol></li><li> Wenn kein FLAG-markierten menschlichen INO80 Protein in Zelllysaten detektiert, erweitern Sie den ersten klonalen Zell popuweitere nung durch Plattierung Zellen aus einzelnen Vertiefungen einer 24-Well-Platte in 15 cm Gewebekulturschalen. <ol><li> Zellen aus 15-cm-Schalen, resuspendieren nahezu konfluenten Zellen in eiskalter PBS und in ein 50 ml konisches Röhrchen geerntet. </li><li> Zu bringen, um ein Endvolumen von 50 ml durch Zugabe von zusätzlichem PBS. </li><li> Pellet-Zellen bei 1000 × g für 5 min entfernt und so viel wie möglich von dem Überstand. </li><li> Zellpellet in 1 ml Lys450-Puffer (20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 450 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, 10 mM KCl, 4 mM MgCl 2, 0,2 mM EDTA, 10% Glycerin, 1 mM DTT, 200 uM PMSF und 1: 1.000 Protease Inhibitor Cocktail). HINWEIS: hier und anderswo, DTT, PMSF und Protease-Inhibitor-Cocktail immer Puffer hinzuzufügen unmittelbar vor Beginn eines Experiments. </li><li> Immuno-Niederschlag FLAG-markierten Proteine ​​aus der resultierenden Ganzzelllysat mit 20 ul Anti-FLAG-Agarose-Gel, und zu analysieren, die die Flagge Eluate mittels Western Blot. [Für Details immunoprecipitation Verfahren siehe Schritt 5] </li></ol></li><li> Bereiten gefrorenen Bestände der gewünschten klonalen Zelllinien 12 und speichern sie in flüssigem Stickstoff bis zur Verwendung. </li></ol> 2. Wachsende HEK293 Zelllinien in Rollerflaschen Für große Vorbereitung INO80 Komplexe, Kulturzellen in 10 - 20 Rollerflaschen; eine typische Ausbeute aus jeder Rolle Flasche ist ~ 1 ml gepackte Zellen. <ol><li> Zu jedem Rollflasche, 200 ml DMEM, 5% Glutamin und 10% Kälberserum, ohne Hygromycin B. </li><li> Übertragen Sie alle Zellen aus einer nahezu konfluenten 15 cm Schüssel in jeder Rolle Flasche </li><li> Ort Rollerflaschen in einem 37 ° C Inkubator Rollflasche und drehen sich mit 0,2 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Sobald Zellen zu erreichen ~ 70% Konfluenz, abgießen und entsorgen Sie die Medium. </li><li> Fügen ~ 50 ml eiskaltem PBS zu jeder Flasche. Halten Flaschen horizontal, leicht schwenken, um die Zellschicht zu lösen. </li><li> Übertragen Sie die resuspendierten Zellen auf 250 ml plastic konischen Flaschen und auf Eis. </li><li> Spülen Rollerflaschen mit zusätzlichen PBS, sequentiell übertragen sie von Flasche zu Flasche. Wenn Spüllösung nicht mehr klar ist (in der Regel nach Gebrauch auf etwa 5 Flaschen spülen), fügen Sie ihn der Zellsuspension. </li><li> Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 400 × g für 10 min. </li><li> Vorsichtig resuspendieren Zellen in PBS, kombinieren sie zu einem einzigen 250-ml-Erlen Flasche, und auf Eis zu halten, bis die Weiterverarbeitung. </li></ol> 3. siRNA-vermittelten Knockdown von INO80 Untereinheiten in Zellen, Another FLAG-markierten INO80 Subunit Um INO80 Subkomplexe fehlt eine einzige Untereinheit zu erhalten, zu nutzen FLAG-Immunkomplexe aus INO80 siRNA behandelten Zellen oder Zellen, die stabil shRNA reinigen. Die &quot;umgekehrte&quot; siRNA (small interfering RNA) Transfektion hier beschriebene Protokoll ist für HEK293 Zellen, die in 15 cm-Schalen optimiert. Das Protokoll ist für eine einzelne 15-cm-Schale von Zellen und shoULD sich dementsprechend abhängig von der Anzahl der Zellen benötigt skaliert werden. Biochemisch nützlich Mengen INO80-Komplex aus siRNA-behandelten Zellen herzustellen, sollte man Skalierung auf bis zu 40 Kulturen in 15 cm-Schalen gewachsen; 4 ml gepacktes Zellpellet - diese werden ca. 2 ergeben. <ol><li> HEK293-Zellen wachsen die gewünschte Untereinheit des Komplexes INO80 stabil exprimieren, um in der Nähe von Konfluenz in 15 cm-Schalen. </li><li> Hinzufügen eines Volumens von siRNA Resuspensionspuffer (20 mM KCl, 6 mM HEPES, pH 7,5, und 0,2 mM MgCl 2) ausreicht, um eine 50 uM Stammlösung von siRNA in ein Röhrchen lyophilisiert siRNA herzustellen. Pipettieren die Lösung auf und ab ein paar Mal und Inkubation auf einem Kolbenpendel für 30 min bei RT, um sicherzustellen, dass die siRNA vollständig aufgelöst. </li><li> Bereiten Sie eine Transfektionscocktail enthält siRNAs und Transfektionsreagenz. Mix 10 ul der 50 uM siRNA-Stammlösung mit 32 ul Lipofectamine RNAiMAX und zu 4 ml Opti-MEM hinzufügen Reduzierte Serum Medium mit sehr schonende Durchmischung; alNieder alle Reagenzien auf RT vor Gebrauch ins Gleichgewicht. </li><li> Inkubieren der Mischung bei RT für 30 min. </li><li> Bereiten Flp-In HEK293-Zellen die gewünschte INO80 Untereinheit für die Transfektion stabil exprimieren. <ol><li> Während der Inkubation von Schritt 3.4, waschen Zellen in den 15-cm-Schalen einmal mit PBS RT. </li><li> Nach dem Entfernen PBS, Behandlung Zellen mit 1 ml Trypsin nur, bis sie zum Abheben der Platte beginnen. </li><li> Sofort 10 ml Vollmedium (DMEM + 5% Glutamin + 10% FBS), um Zellen mit Trypsin behandelt und vorsichtig mischen. Sammle die Zellen durch Zentrifugation bei 1.000 xg für 5 Minuten bei RT. </li><li> Zellpellet in ~ 4 ml Vollmedium, und zählen Sie die Zelle mit einer Aufwirbelung Hämocytometers. </li><li> Verdünnte Zellen mit komplettem Medium auf eine Konzentration von ~ 5,4 × 10 6 / ml. </li></ol></li><li> Zu jeder 15 cm Schüssel, fügen Sie 15 ml komplettem Kulturmedium, gefolgt von 4 ml Transfektion Cocktail. Vorsichtig schwenken, um die mittel-und Transfektionscocktail gewährleisten thoroughly gemischt. Schließlich, fügen Sie einem ml Zellsuspension und wieder vorsichtig schwenken, um Zellen gleichmäßig zu verteilen. </li><li> Nach 60 h der Kultur in einem 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator, entfernen Sie vorsichtig Medium, Zellen in eiskaltem PBS, und fahren Sie sofort auf Kernextrakte herzustellen. </li></ol> 4. Herstellung von Kernextrakten Dieses Verfahren ist aus dem Protokoll von Dignam 13 modifiziert und kann nach oben oder unten in Abhängigkeit von der Größe des Ausgangszellpellets skaliert werden. Typischerweise 1 ml gepacktes Zellpellet ergibt 1 ml des endgültigen Kernextrakt. Alle Puffer sollten eiskalt sein, und alle Schritte sollten in einem Kühlraum oder auf Eis durchgeführt, wenn ein geeignetes Kühlraum nicht zur Verfügung steht. <ol><li> Isolierung der Kerne: <ol><li> Sanft Zellen übertragen zu einem geeignet bemessenen (15 oder 50 ml) abgestuft konischen Rohr und Schleudern bei 1000 × g für 10 min bei 4 ° C ist. </li><li> Entfernen Sie den Überstand, und messen die Lautstärke des gepackten Zell pellassen. 1 ml gepackte Zellen entspricht ~ 3 x 10 8 HEK293-Zellen. </li><li> Hinzufügen 5 gepackten Zellvolumina Puffer A (10 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl 2, 10 mM KCl und frisch zuge 1 mM DTT, 200 uM PMSF und 1: 1.000 Protease Inhibitor Cocktail). Zellpellet durch vorsichtiges Pipettieren. </li><li> Inkubieren auf Eis für genau 10 min. </li><li> Pellet die Zellen bei 1.000 g für 10 min bei 4 ° C, und entfernen Sie den Überstand. </li><li> Die Grße des Zellpellets sollte während der Inkubation in Puffer A bis zu 2-fach erhöht </li><li> Die Zellen in zwei gepackte Zellvolumen Puffer A, und übertragen Sie die Zellsuspension auf einem passenden Dounce Gewebehomogenisator. Wenn die mit weniger als 2 ml gepackter Zellen, mit einem 7 ml Homogenisator; für 2 - 4 ml gepackte Zellen, verwenden Sie ein 15 ml-Homogenisator; und für 10 oder mehr ml gepackter Zellen, verwenden Sie ein 40 ml-Homogenisator. </li><li> Homogenisierung der Zellsuspension mit dem losen Glaspistill der Dounce Homogenisator until 90% der Zellen färben sich positiv mit 1% Trypanblau. </li><li> Die Suspension in einem 45-ml-Hochgeschwindigkeitszentrifugenröhrchen und Schleudern bei 25.000 xg für 20 min bei 4 ° C in einem JA-17-Rotor oder ähnliches (siehe Tabelle der Werkstoffe / Zubehör). </li><li> Von der Kernpellet, den Überstand, der cytosolischen Proteine ​​oder Proteine, die bei der Fraktionierung aus dem Kern entweichen enthält. </li></ol></li><li> Extrahieren Kerne mit Salz: <ol><li> Fügen Puffer C (20 mM HEPES, pH 7,9, 25% Glycerin, 1,5 mM MgCl 2, 0,2 mM EDTA und frisch zuge 1 mM DTT, 200 uM PMSF und 1: 1.000 Protease Inhibitor Cocktail) in den Kernpellet; verwenden 2,5 ml Puffer C für jeweils 3 ml Ausgangszellvolumen (~ 1 x 10 9 Zellen). </li><li> Mit einem Glasstab oder einer Pipette zu verdrängen das Kernpellet von der Wand des Rohres und übertragen die gesamte Mischung auf einem Dounce-Homogenisator mit einer geeigneten Größe. </li><li> Resuspendieren der Kerne durch Homogenisieren the Mischung mit zwei Schlägen aus einer losen Stößel. </li><li> Übertragen Sie die Kernfraktion resuspendiert in ein gekühltes Becherglas. Wähle einen Becher derart, daß die Suspension wird das Becherglas auf mindestens 0,5 cm tief füllen. </li><li> Die Kernproteine ​​aus Chromatin oder andere unlösliche Strukturen zu extrahieren, schrittweise Erhöhung der Salzkonzentration der Suspension auf 0,42 M NaCl durch tropfenweise Zugabe von 5 M NaCl unter leichtem Rühren der Suspension mit einer Pipette oder Glasstab auf Eis; Wenn alle 5 M NaCl wurde zugegeben, sollte die Lösung sehr viskos oder gelartigen. Berechnung des Volumens von 5 M NaCl nötig, um die Lösung auf eine Endkonzentration von 0,42 M NaCl nach der folgenden Formel zu bringen: <img alt="Gleichung 1" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51720/51720equation1.jpg" width="500" /></li><li> Die viskose Suspension sorgfältig Transfer in 10 ml Polycarbonat Rohre für einen Typ 70.1 Ti-Rotor (oder gleichwertig) oder 70 ml Polycarbonat-Flaschen für einen Typ 45 Ti or ähnlich Rotor (siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung). Dicht schließen mit Parafilm bei Verwendung von 10-ml-Röhrchen mit Kappe oder Montage, wenn unter Verwendung von 70-ml-Flaschen. </li><li> Langsam rocken die verschlossenen Röhrchen bei 4 ° C für 30 min mit einem Kolbenpendel. </li><li> Dreh die Proben in einem 45 Ti-Typ oder 70.1 Ti-Rotor für 30 Minuten bei 120.000 × g bei 4 ° C ist. </li><li> Den Überstand in einem einzigen Kunststoffrohr oder Flasche. Dieser Überstand ist die Kernextrakt und das Pellet enthält Chromatin und andere Kerntrümmer. </li><li> Teilen Sie die Kernextrakt in handliche Teilmengen, einfrieren in flüssigem Stickstoff, und speichern Sie sie bei -80 ° C. </li></ol></li></ol> 5. Immunoaffinitätsreinigung des Menschen INO80 oder INO80 Subkomplexe <ol><li> Zum Auftauen gefrorenen Kernextrakt, Ort Röhrchen, die den Extrakt auf den Tisch-oder Walzenrohre zwischen den Händen, bis die gefrorene Material wird zu einem Brei. Dann legen Sie die Röhrchen auf Eis oder im Kühlraum, bis der Extrakt ist komplett thawed. </li><li> Übertragen der aufgetauten Zellkernextrakt 10 ml Ultrazentrifugenröhrchen aus Polycarbonat und Spin bei 100.000 × g für 20 min bei 4 ° C in einem Typ 70.1 Ti-Rotor oder gleichwertig jede Niederschlag, die während des Gefrier-Auftau-Zyklus gebildet haben können. </li><li> Den Überstand in einem 15 ml konischen Röhrchen. Fügen Sie frisches DTT, PMSF und Protease Inhibitor Cocktail, um Endkonzentrationen von 1 mM DTT, 200 uM PMSF und 1: 1.000 Protease Inhibitor Cocktail. </li><li> Anti-Flag Agarose zur Immun vorzubereiten, Transfer 200 ul 50% Gülle von Anti-Flag Agarose-Kügelchen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit einem P200 oder ähnliche Pipette mit einer Spitze, aus dem das Ende wurde mit einem sauberen Skalpell oder Rasierklinge. </li><li> Pellet die Perlen durch Zentrifugation in einer Tischmikrozentrifuge bei 8.000 g für 30 sek. Entfernen Sie den Überstand und Waschen der Kügelchen durch Resuspendieren der Beads in 1 ml Lys450 Puffer und Pellet die Perlen bei 8.000 g für 30 sek. Waschen Sie die bEADS zwei weitere Male. </li><li> Resuspendieren gewaschen Anti-FLAG-Agarose-Kügelchen in etwa 100 ul des Kernextrakt mit einem P200 oder ähnliches Volumen einstellbare Pipette mit einer Spitze, aus dem das Ende wurde mit einem sauberen Skalpell oder einer Rasierklinge und, mit der gleichen Spitze, Übertragung geschnitten die resuspendierten Perlen an den 15 ml konischen Röhrchen, die den Extrakt. Ein paar Mal wiederholen, bis alle Perlen haben an den 15-ml-Tube überführt. </li><li> Inkubieren des Extrakts / Perlen-Mischung für 4 h bei 4 ° C unter langsamer Rotation auf einer Labor-Rotator. OPTIONAL: Fügen Sie in einer Konzentration von 25 Einheiten / ml Benzonase zu entfernen verunreinigende DNA. </li><li> Sammeln Sie die FLAG-Agarose durch Zentrifugation bei 1.000 × g für 5 min bei 4 ° C ist. </li><li> Resuspendieren in 10 ml Lys450 zu waschen, Inkubation 5 min bei 4 ° C unter leichtem Schütteln auf einem Kolbenpendel. Pellet die Kügelchen bei 1.000 × g für 5 min bei 4 ° C ist. </li><li> Resuspendieren in 100 bis 150 ul Lys450 und Transfer Perlen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Co150 ul Lys450, bis alle die Perlen auf die Mikrozentrifugenröhrchen überführt worden - ntinue um die 15 ml konischen Röhrchen mit 100 zu spülen. </li><li> Spin-down die Perlen bei 8.000 xg für 30 sec bei 4 ° C in einer Mikrozentrifuge. Waschen dreimal mit 1 ml Lys450 und einmal mit 1 ml EB100-Puffer (10 mM HEPES pH 7,9, 10% Glycerin, 100 mM NaCl, 1,5 mM MgCl 2, 0,05% Triton X-100, und frisch zuge 1 mM DTT, 200 uM PMSF , und 1: 1.000 Protease Inhibitor Cocktail). </li><li> Zur Elution gebundener Proteine, 200 ul EB100-Puffer mit 0,25 mg / ml 1x FLAG-Peptid. Inkubieren 30 min bei jeder 4 ° C auf einem Kolbenpendel. </li><li> Pellet die Kügelchen bei 8.000 xg für 30 sec bei 4 ° C in einer Mikrozentrifuge. Den Überstand, der den eluierten INO80 Komplex enthält, in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Wiederholen Sie die Elution vier weitere Male, und bündeln alle Überstände in einem einzigen Rohr. </li><li> Um restliche FLAG-Agarose-Perlen aus der eluierten Proteinfraktion zu entfernen,passieren die Eluat durch eine leere Spin-Säule. </li><li> Konzentrieren die eluierte Proteinfraktion ~ 10-fach unter Verwendung einer Ultrafilterzentrifuge Gerät (50.000 Molekulargewichtsgrenze). </li><li> Um das FLAG-Peptid zu entfernen, übergeben Sie die konzentrierte Proteinfraktion nacheinander durch zwei Entsalzungssäulen. </li><li> Teilen das gereinigte entsalzte Proteinfraktion in 20 ul-Aliquots in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C gelagert. </li><li> Analysieren Sie die Zusammensetzung der Untereinheiten INO80 oder INO80 Subkomplexe auf Silber-gefärbten Gelen oder durch Western Blotting, und schätzen ihre Konzentrationen von semi-quantitativen Western-Blot unter Verwendung von rekombinanten Präparaten INO80 Untereinheiten bekannter Konzentration als Standards. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Strukturelle und funktionelle Untersuchungen mit mehreren Untereinheiten Säuger Chromatin-Remodeling-Komplexe aus höheren Eukaryoten durch die Schwierigkeit der Herstellung von biochemisch nützlichen Mengen solcher Komplexe, die mutierte oder fehlende bestimmte Untereinheiten Untereinheiten insgesamt behindert. Es gibt eine Reihe von technischen Hürden: Erstens hat die genetische Manipulation in Säugerzellen technisch anspruchsvoll und zeitaufwendig gewesen. Anders als Hefezellen, deren Genom kann leicht bearbeitet...

Evolutionär konservierte Familie SNF2 Chromatin-Remodeling-Komplexe sind Schlüsselregulatoren des Chromatins Organisation und DNA-Zugänglichkeit 1. Diese Umbau-Komplexe schließen immer eine zentrale SNF2 artigen ATPase Untereinheit, die in einigen Fällen, montiert mit verschiedenen Zubehör Proteine ​​und bildet mit mehreren Untereinheiten makromolekulare Baugruppen. Um die molekularen Details der ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Prozess zu untersuchen, ist es wichtig, die Beiträge der gegebenen Untermengen von Untereinheiten und / oder den Domain-Strukturen Aktivitäten der Komplexe zu verstehen. Solche Analysen erfordern die Fähigkeit, hoch gereinigten Mutante Komplexe, insbesondere Protein-Untereinheiten oder Domänenstrukturen fehlt erzeugen. Vorherige Struktur-Funktions-Studien von ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Komplexe sind allgemein für die Hefe-Modellsystem fokussiert aufgrund der überlegenen Handhabbarkeit des Hefe-Genom (siehe zB Lit. 1-4). Angesichts der Erhaltung derZusammensetzung Einheit und Funktionalität unter ortho-Remodeling-Komplexe, Untersuchungen der Struktur und Funktion der Hefe-Remodeling-Komplexen haben wichtige Einblicke in ihre Gegenstücke in höheren Eukaryoten ist. Dennoch nennenswerte Spezies-spezifische Unterschiede zwischen den Umbau Komplexe existieren, von Gewinn oder Verlust der Spezies-spezifische Untereinheiten, Gewinn oder Verlust der Arten-spezifische Domänen von konservierten Untereinheiten und Sequenzvariabilität innerhalb konservierten Domänen von konservierten Untereinheiten entstehen. Solche Unterschiede können im Prinzip durch die Notwendigkeit für höhere eukaryotische Zellen zu neuen molekularen und zellulären Umgebungen anzupassen angetrieben werden. So verstehen, wie Untereinheiten der höheren eukaryotischen Umbau Komplexe dazu beitragen, die Nukleosomen Umbauprozess ist wertvoll, denn es wirft nicht nur Licht auf die grundlegenden Mechanismen der ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Prozess, sondern kann auch wertvolle Einblicke in die Mechanismen, durch die Chromatinstruktur und Genexpression in higsie Eukaryonten reguliert. Bisher gab es nur strukturelle und funktionelle Untersuchungen mit mehreren Untereinheiten Säuger Chromatin-Remodeling-Komplexe, zum Teil aufgrund der Schwierigkeiten bei der biochemisch definiert Chromatin-Remodeling-Komplexe und Unterkomplexe beschränkt. Wir haben teilweise diese Schwierigkeiten mit den unten beschriebenen Verfahren, bei denen Immunaffinitätsreinigung verwendet wird, um intakt INO80 oder INO80 Subkomplexe aus menschlichen Zellen stabil exprimiert N-terminal FLAG-Epitop markierten Wildtyp-oder mutierte Versionen von INO80 5-7 vorzubereiten umgangen (Abbildung 1) . Intakte INO80 Komplexe aus menschlichen Zellen zu erhalten, wird Flp-vermittelte Rekombination verwendet werden, um transgene HEK293-Zelllinien, die stabil FLAG-Epitop markierten cDNAs Untereinheiten des Komplexes INO80 8-10 kodieren, zu erzeugen. Da die Überexpression von INO80 Untereinheiten kann etwas giftig sein, ist es notwendig, zu isolieren und zu pflegen klonalen Zelllinien unter selektiven CoBedingungen ausgebracht, um eine stabile Expression des Transgens in den vielen Passagen für die Erweiterung des Großzellkulturen erforderlich zu gewährleisten. Um kleinere INO80 Subkomplexe, die nur eine Teilmenge der Untereinheiten enthalten, zu erhalten, haben wir erfolgreich verwendet zwei Ansätze (Abbildung 2a, b). In der ersten, erzeugen wir HEK293 Flp-In-Zelllinien, die stabil mutierten Versionen INO80 die Domains für die Wechselwirkung mit spezifischen Untereinheiten 5 erforderlich fehlt. Alternativ wird siRNA-vermittelten Zuschlags verwendet, um die gewünschte Untereinheit von den Zellen eines geeigneten FLAG-markierten INO80 Einheit (unveröffentlichte Daten) Expression führen. Schließlich, um die Menschen INO80 Komplexe zu reinigen, ist FLAG-Agarose-Chromatographie basiert 11 verwendet, um eine INO80 haltigen Fraktion aus Kernextrakten zu bereichern, damit eine effektive Senkung der Anwesenheit von verunreinigenden Cytosolproteine ​​in der letzten Fraktion, die gereinigtes INO80 oder INO80 Subkomplexe.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax-I (stablized glutamine)</td><td>Life Technologies</td><td>35050-079</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>SAFC</td><td>12176C</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE6 transfection reagent</td><td>Promega</td><td>E2312</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B, sterile in PBS</td><td>AG Scientific</td><td>H-1012-PBS</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA5/FRT vector</td><td>Life Technologies</td><td>V6010-20</td><td></td></tr><tr><td>Flp-In HEK293 cells</td><td>Life Technologies</td><td>R780-07</td><td></td></tr><tr><td>pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector</td><td>Life Technologies</td><td>V600520</td><td></td></tr><tr><td>EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma</td><td>F2426</td><td></td></tr><tr><td>calf serum</td><td>SAFC</td><td>12138C</td><td></td></tr><tr><td>TARGETplus SMARTsiRNA pool</td><td>Dharmacon / Thermo Scientific</td><td>various</td><td></td></tr><tr><td>5x siRNA resuspension buffer</td><td>Dharmacon / Thermo Scientific</td><td>#B-002000-UB-100</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Life Technologies</td><td>13778</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduced Serum Medium</td><td>Life Technologies</td><td>51985-091</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cellgro</td><td>45000</td><td>VWR</td></tr><tr><td>TrypLE (trypsin)</td><td>Life Technologies</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>1x FLAG Peptide</td><td>Sigma</td><td>F3290</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin Chromatography Column</td><td>Bio-Rad</td><td>737-5021</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO)</td><td>Amicon</td><td>UFC805024</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Zeba Desalting Columns</td><td>Thermo Scientific</td><td>89882</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 antibody, mouse</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 antibody, rabbit</td><td>Sigma</td><td>F7425</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>benzonase</td><td>Novagen</td><td>70664</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge</td><td>Beckman-Coulter</td><td>339080</td><td></td></tr><tr><td>JA-17 rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>369691</td><td></td></tr><tr><td>10 ml polycarbonate tubes</td><td>Beckman-Coulter</td><td>355630</td><td></td></tr><tr><td>70 ml polycarbonate bottles</td><td>Beckman-Coulter</td><td>355655</td><td></td></tr><tr><td>Type 45 Ti rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>339160</td><td></td></tr><tr><td>Type 70.1 Ti rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>342184</td><td></td></tr><tr><td>BD Clay Adams Nutator Mixer</td><td>BD Diagnostics</td><td>15172-203</td><td>VWR</td></tr><tr><td>Glas-Col Tube/Vial Rotator</td><td>Glas-Col</td><td>099A RD4512</td><td></td></tr><tr><td>PCR thermal cycler PTC 200</td><td>MJ Research</td><td>PTC 200</td><td></td></tr><tr><td>roller bottle incubator</td><td>Bellco biotechnology</td><td>353348</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4</td><td>Millipore</td><td>IPFL07810</td><td></td></tr><tr><td>lubricated 1.5 ml microcentrifuge tubes</td><td>Costar</td><td>3207</td><td></td></tr></tbody></table>

generation and purification of human ino80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes

INO80 Chromatin-Remodeling-Komplexe regulieren Nukleosomen Dynamik und DNA-Zugänglichkeit durch Katalyse ATP-abhängigen Nukleosomen Umbau. Menschliche INO80 Komplexe aus Protein-Untereinheiten 14 einschließlich INO80 eine SNF2 artigen ATPase, die sowohl als die katalytische Untereinheit und dem Stützgerüst zur Montage der Komplexe dient. Funktionen der anderen Untereinheiten und die Mechanismen, durch die sie den INO80 Komplexes Chromatin-Remodeling-Aktivität beitragen noch schwer, was zum Teil auf die Herausforderung der Erzeugung INO80 Baugruppen in menschlichen Zellen oder heterologen Expressionssystemen. Dieses Protokoll beschreibt JOVE eine Prozedur, die die Reinigung der menschlichen INO80 Chromatin-Remodeling Subkomplexe, die eine Untereinheit fehlt oder eine Teilmenge der Untereinheiten ermöglicht. N-terminal FLAG-Epitop markiert INO80 cDNA stabil in humanen embryonalen Nierenzellen (HEK) 293-Zelllinien mit Flp-vermittelte Rekombination eingeführt. In dem Fall, dass eine Untergruppe von Untereinheiten des Komplexes ist INO80 zu be gelöscht, statt einer Mutante INO80 Proteine, die die Plattform für die Montage dieser Untereinheiten sind, nicht immer zum Ausdruck bringt. Im Falle eine individuelle Untereinheit ist erschöpft sein, eine Transfekte siRNAs dieser Untereinheit in ein HEK 293-Zelllinie, die stabil FLAG getaggt INO80 ATPase. Kernextrakte werden hergestellt und FLAG Immunpräzipitation durchgeführt, um die Proteinfraktionen, die INO80 Derivate bereichern. Die Zusammensetzungen gereinigt INO80 Subkomplexe kann dann unter Verwendung von Verfahren wie beispielsweise Immunoblotting, Silberfärbung und Massenspektrometrie analysiert werden. Die INO80 und INO80 Subkomplexe entsprechend diesem Protokoll erzeugt wird, kann weiter analysiert werden unter Verwendung von verschiedenen biochemischen Tests, welche in den beiliegenden JOVE Protokoll beschrieben sind. Die hier beschriebenen Methoden können für die Untersuchung der strukturellen und funktionellen Eigenschaften einer Säuger mehreren Untereinheiten Chromatin-Remodeling-Komplexe und Modifikation angepasst werden.

Figur 1 zeigt ein Flussdiagramm eine Zusammenfassung der zur Erzeugung, Reinigung und Charakterisierung menschlicher INO80 ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Komplexen Verfahren. Wie in den 2 und 3 dargestellt, diese Verfahren ermöglichen die Erzeugung von beiden Wildtyp INO80 und INO80 Subkomplexe, die verschiedenen Untereinheiten fehlen, wodurch die nachfolgende biochemische Analysen der Beitrag dieser fehlenden Untereinheiten an enzyma...

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Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Erzeugung und Reinigung von Wildtyp-und Mutantenversionen der menschlichen INO80 Chromatin-Remodeling-Komplexes. Epitop-markierte Versionen der INO80 Untereinheiten stabil in HEK293-Zellen exprimiert, und die Gesamtkomplexe und Komplexe ohne spezifische Sätze von Untereinheiten durch Immunaffinitätschromatographie gereinigt.

Generation und Reinigung von Menschen INO80 Chromatin Remodeling Komplexe und Subkomplexe

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

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9.8K Aufrufe.  Stowers Institute for Medical Research.  Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Erzeugung und Reinigung von Wildtyp-und Mutantenversionen der menschlichen INO80 Chromatin-Remodeling-Komplexes. Epitop-markierte Versionen der INO80 Untereinheiten stabil in HEK293-Zellen exprimiert, und die Gesamtkomplexe und Komplexe ohne spezifische Sätze von Untereinheiten durch Immunaffinitätschromatographie gereinigt. 

Serie: Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous nature of most mammalian chromatin-modifying complexes. In order to overcome these hurdles, we have adapted a sequential salt extraction (SSE) assay for evaluating the relative binding affinities of chromatin-bound complexes. This easy and straightforward assay can be used by non-experts to evaluate the relative difference in binding affinity of two related complexes, the changes in affinity of a complex when a subunit is lost or an individual domain is inactivated, and the change in binding affinity after alterations to the chromatin landscape. By sequentially re-suspending bulk chromatin in increasing amounts of salt, we are able to profile the elution of a particular protein from chromatin. Using these profiles, we are able to determine how alterations in a chromatin-modifying complex or alterations to the chromatin environment affect binding interactions. Coupling SSE with other in vitro and in vivo assays, we can determine the roles of individual domains and proteins on the functionality of a complex in a variety of chromatin environments.

Sequential salt extraction of chromatin bound proteins is a useful tool for determining the binding properties of large protein complexes. This method can be employed to evaluate the role of individual subunits or domains in the overall affinity of a protein complex to bulk chromatin.

Sequentielle Salz Extraktionen für die Analyse von Bulk-Chromatin bindenden Eigenschaften von Chromatin komplexe ändern

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Forschung

Genetik

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

Chromatin Immunopräzipitation der murinen braunen Fettgewebe

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination of chromatin function and DNA-associated processes. This modification involves a sequential action of several enzymes including E1 ubiquitin-activating, E2 ubiquitin-conjugating and E3 ubiquitin-ligase and is reversed by deubiquitinases (DUBs). Ubiquitination induces degradation of proteins or alteration of protein function including modulation of enzymatic activity, protein-protein interaction and subcellular localization. A critical step in demonstrating protein ubiquitination or deubiquitination is to perform in vitro reactions with purified components. Effective ubiquitination and deubiquitination reactions could be greatly impacted by the different components used, enzyme co-factors, buffer conditions, and the nature of the substrate.&#160; Here, we provide step-by-step protocols for conducting ubiquitination and deubiquitination reactions. We illustrate these reactions using minimal components of the mouse Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), BMI1, and RING1B, an E3 ubiquitin ligase that monoubiquitinates histone H2A on lysine 119. Deubiquitination of nucleosomal H2A is performed using a minimal Polycomb Repressive Deubiquitinase (PR-DUB) complex formed by the human deubiquitinase BAP1 and the DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) domain of its co-factor ASXL2. These ubiquitination/deubiquitination assays can be conducted in the context of either recombinant nucleosomes reconstituted with bacteria-purified proteins or native nucleosomes purified from mammalian cells. We highlight the intricacies that can have a significant impact on these reactions and we propose that the general principles of these protocols can be swiftly adapted to other E3 ubiquitin ligases and deubiquitinases.

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in cellular processes and is tightly coordinated by deubiquitination. Defects in both reactions underlie human pathologies. We provide protocols for conducting ubiquitination and deubiquitination reaction in vitro using purified components.

In Vitro Ubiquitination und Deubiquitination Assays von Nucleleosomalhistones

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Biochemie

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled with high-throughput sequencing (ChIP-seq) is widely used to identify genome-wide binding locations of DNA-binding proteins. However, the ChIP-seq method is limited by its heterogeneity in length of sonicated DNA fragments and non-specific background DNA, resulting in low mapping resolution and uncertainty in DNA-binding sites. To overcome these limitations, the combination of ChIP with exonuclease digestion (ChIP-exo) utilizes 5&#8217; to 3&#8217; exonuclease digestion to trim the heterogeneously sized immunoprecipitated DNA to the protein-DNA crosslinking site. Exonuclease treatment also eliminates non-specific background DNA. The library-prepared and exonuclease-digested DNA can be sent for high-throughput sequencing. The ChIP-exo method allows for near base-pair mapping resolution with greater detection sensitivity and reduced background signal. An optimized ChIP-exo protocol for mammalian cells and next-generation sequencing is described below.

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease ChIP-Exo

Precise determination of protein-binding locations across the genome is important for understanding gene regulation. Here we describe a&#160;genomic mapping method that treats chromatin-immunoprecipitated DNA with exonuclease digestion (ChIP-exo) followed by high-throughput sequencing. This method detects protein-DNA interactions with near base-pair mapping resolution and high signal-to-noise ratio in mammalian neurons.

Hochauflösende Kartierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in Mausstammzell-abgeleiteten Neuronen mit Chromatin-Immunpräzipitation-Exonuklease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) zur Assay Dynamische Histonmodifikationen in Activated Gene Expression in menschlichen Zellen

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Biologie

Locus-spezifische Chromatinisolierung aus Hefezellen

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone octamer. Chromatin is defined as the entity of NCPs and numerous other protein complexes, including transcription factors, chromatin remodeling and modifying enzymes. It is still unclear how these protein-DNA interactions are orchestrated at the level of specific genomic loci during different stages of the cell cycle. This is mainly due to the current technical limitations, which make it challenging to obtain precise measurements of such dynamic interactions. Here, we describe an improved method combining site-specific recombination with an efficient single-step affinity purification protocol to isolate a single-copy gene locus of interest in its native chromatin state. The method allows for the robust enrichment of the target locus over genomic chromatin, making this technique an effective strategy for identifying and quantifying protein interactions in an unbiased and systematic manner, for example by mass spectrometry. Further to such compositional analyses, native chromatin purified by this method likely reflects the in vivo situation regarding nucleosome positioning and histone modifications and is, therefore, amenable to further structural and biochemical analyses of chromatin derived from virtually any genomic locus in yeast.

Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung der Chromatinforschung und Überwindung von Einschränkungen mit einem Locus-spezifischen Isolationsprotokoll mit hoher Anreicherung 

This protocol presents a locus-specific chromatin isolation method based on site-specific recombination to purify a single-copy gene locus of interest in its native chromatin context from budding yeast, Saccharomyces cerevisiae.

Einzelkopien-Genlocus-Chromatin-Aufreinigung in Saccharomyces cerevisiae

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used method for determining the interactions of different proteins with DNA in chromatin of living cells. Examples include sequence-specific DNA binding transcription factors, histones and their different modification states, enzymes such as RNA polymerases and ancillary factors, and DNA repair components. Despite its ubiquity, there is a lack of up-to-date, detailed methodologies for both bench preparation of material and for accurate analysis allowing quantitative metrics of interaction. Due to this lack of information, and also because, like any immunoprecipitation, conditions must be re-optimized for new sets of experimental conditions, the ChIP assay is susceptible to inaccurate or poorly quantitative results.
Our protocol is ultimately derived from seminal work on transcription factor:DNA interactions1,2 , but incorporates a number of improvements to sensitivity and reproducibility for difficult-to-obtain cell types. The protocol has been used successfully3,4 , both using qPCR to quantify DNA enrichment, or using a semi-quantitative variant of the below protocol.
This quantitative analysis of PCR-amplified material is performed computationally, and represents a limiting factor in the assay. Important controls and other considerations include the use of an isotype-matched antibody, as well as evaluation of a control region of genomic DNA, such as an intergenic region predicted not to be bound by the protein under study (or anticipated not to show changes under the experimental conditions). In addition, a standard curve of input material for every ChIP sample is used to derive absolute levels of enrichment in the experimental material. Use of standard curves helps to take into account differences between primer sets, regardless of how carefully they are designed, and also efficiency differences throughout the range of template concentrations for a single primer set. Our protocol is different from others that are available5-8 in that we extensively cover the later, analysis phase.

We describe a robust method for chromatin immunoprecipitation using primary T cells. The method is founded on standard approaches, but uses a specific set of conditions and reagents that improve efficiency for limited a quantities of cells. Importantly, a detailed description of the data analysis phase is presented.

Effiziente Chromatin Immunopräzipitation mit limitierende Mengen an Biomasse

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and function at specific regions is regulated by the local enrichment of histone post-translational modifications (hPTMs) and variants, chromatin-binding proteins, including transcription factors, and DNA methylation. The proteomic characterization of chromatin composition at distinct functional regions has been so far hampered by the lack of efficient protocols to enrich such domains at the appropriate purity and amount for the subsequent in-depth analysis by Mass Spectrometry (MS). We describe here a newly designed chromatin proteomics strategy, named ChroP (Chromatin Proteomics), whereby a preparative chromatin immunoprecipitation is used to isolate distinct chromatin regions whose features, in terms of hPTMs, variants and co-associated non-histonic proteins, are analyzed by MS. We illustrate here the setting up of ChroP for the enrichment and analysis of transcriptionally silent heterochromatic regions, marked by the presence of tri-methylation of lysine 9 on histone H3. The results achieved demonstrate the potential of ChroP in thoroughly characterizing the heterochromatin proteome and prove it as a powerful analytical strategy for understanding how the distinct protein determinants of chromatin interact and synergize to establish locus-specific structural and functional configurations.

By combining native and crosslinking chromatin immunoprecipitation with high-resolution Mass Spectrometry, ChroP approach enables to dissect the composite proteomic architecture of histone modifications, variants and non-histonic proteins synergizing at functionally distinct chromatin domains.

Der Ansatz kombiniert ChroP ChIP und Massenspektrometrie zu sezieren Locus-spezifische Proteomik Landschaften des Chromatin

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

Generation und Reinigung von Menschen INO80 Chromatin Remodeling Komplexe und Subkomplexe

Zusammenfassung

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Einzelkopien-Genlocus-Chromatin-Aufreinigung in Saccharomyces cerevisiae

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