We would like to thank Prof David Walker for his technical advice and provision of equipment in the development of this technique. This work is supported by the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program. This work was partly supported by the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program.

HINWEIS: Die folgenden Versuchsverfahren wird von der Tierethikkommission an der Monash University genehmigt und in Übereinstimmung mit den Australian Code of Practice für die Pflege und Verwendung von Tieren zu wissenschaftlichen Zwecken (2006) durchgeführt. Erwachsene weibliche C57BL / 6 Mäuse verwendet, um die repräsentative Ergebnisse zu generieren wurden aus den Monash Tierdienstleistungen erhalten. Die Mäuse wurden in einen bestimmten Erreger frei, kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit Zimmer mit einem 12 Stunden Licht-Dunkel-Zyklus gehalten. Diese Mäuse hatten freien Zugang zu Nahrung und Wasser. 1. Initial Setup <ol><li> Schließen Sie den Laptop / Desktop bis zum Datenerfassungsmaschine für die Aufnahme über ein USB-Kabel. </li><li> Schließen Sie den Brückenverstärker von &quot;Ausgang 1&quot; bis &quot;Eingang 1&quot; des Datenerfassungsmaschine über eine BNC-Kabel. </li><li> Legen Sie die Druckwandler in &quot;Kanal 1&quot; des Oktal-Brücke Amp. Schalten Sie die Datenerfassung Maschine auf und öffnen Sie die Analyse-Software. Die Software sollte automatischdie Geräte-Setup automatisch erkennen (siehe Materialien und Ausrüstung Tabelle). </li><li> Offener Kanal Einstellungen im Setup-Tool-Bar der Software gefunden. Ändern Sie die Anzahl der Kanäle auf 1 aufgezeichnet. </li><li> Richten Sie das Barometer auf Raumdruck und die Wassersäule Gerät, um den Brückenverstärker kalibrieren zu messen. Die Wassersäule Vorrichtung zwei 5 ml-Spritze serologische Pipetten durch einen Kunststoffschlauch verbunden ist. </li><li> Füllen Sie die Spalten mit Wasser und sorgen für die Wasserstände mit einem Lineal ausgeglichen sind. Schließen Sie ein Stück Kunststoffschlauch an die Spitze der jeweiligen Pipette. Abbildung 2 zeigt die Wassersäule aufzubauen. </li></ol> 2. Brückenverstärker Kalibrierung Hinweis: Um in die Wassersäule Kalibrieren Sie den Brückenverstärker eine Injektion von Luft erforderlich ist, um eine 1 cm H 2 O Ablenkung zu schaffen. Dies wird unter einem Satz von Bedingungen erfolgen und ist abhängig von Vorrichtung des Benutzers. Zur Klarstellung diese Schritte demonstrate wie dieses Labor würde die Kalibrierung durchzuführen. <ol><li> Zurückzuziehen 1-ml-Spritze auf 300 ul; ist, die Spritze an den Absperrhahn am Ende der Rohrleitung auf der rechten Seite der Wassersäule. HINWEIS: Sicherstellen, dass der Hahn geöffnet ist an der Spritze und der Wassersäule, und geschlossen, um die Raumluft. Wenn die Wasserstände sind an dieser Stelle nicht ausgeglichen ist, drehen Sie den Hahn, so dass sie offen für Raumluft und der Wassersäule ist, wird dieser das Wasser wieder auszugleichen. Der Schlauch auf der linken Seite der Wassersäule sollte mit dem Druckwandler verbunden ist, um die Druckänderung durch Eintauchen der Spritze induziert wurden. </li><li> Befestigen Sie den Schlauch von der Wassersäule auf der linken Seite, um den Anschluss auf der Druckwandler (obere Ring des Wandlers). </li><li> Wählen Sie das Scroll-Down-Menü gefunden neben dem Hauptbildschirm auf Kanal 1 auf der rechten Seite der Software, und wählen Sie &quot;Brücke Amp&quot; (siehe Materialien und Ausrüstung Tabelle). </li><li> Eingebendie Einstellungen zu 5 mV, 20 Hz Tiefpass, kreuzen Sie das &quot;Invert&quot; und klicken Sie auf &quot;Null&quot;. Klicken Sie auf &quot;Null&quot; um die Kurve bei ~ 0 mV eingestellt. Reduzieren Sie die Fenstergröße auf 4: 1 für einfache Betrachtung. </li><li> Mit allem, was einzurichten, drücken Sie die 1-ml-Spritze, so dass es für 3 Sekunden. Dies wird eine plötzliche Spitze auf der Software zeigen, weil der Druck geändert hat. Wenn die 300 ul gedrückt wird, wird der Druck des Wassers in der Wassersäule von 1 cm zu bewegen. Diese bekannte Wert wird dazu beitragen, kalibrieren Sie den Brückenverstärker. HINWEIS: Der Druckanstieg in der Kammer auf Grund der Vertiefung 300 ul entspricht der für spätere Berechnungen verwendet P K-Wert. </li><li> Wählen Sie &quot;Eingabeeinheiten&quot; auf der linken unteren Ecke des BRIDGE AMP Fenster gefunden. </li><li> Markieren Sie die &quot;Hintergrund Spur&quot; vor der Spitze anders als die &quot;Null-Region&quot; bekannt. <ol><li> Klicken Sie auf den Pfeil neben &quot;Punkt 1&quot; und dies wird die bac produzierenkground Signal im Bereich von -0,002 mV-0.002 mV (der Wert wird nie genau bei 0 mV). </li><li> Typ &quot;0&quot; in dem Fenster benachbart zum Hintergrundsignal-Fenster. </li></ol></li><li> Markieren Sie das &quot;erhöhte Druckbereich der Kurve&quot; aus, wenn die Spritze gedrückt. Klicken Sie auf den Pfeil neben der Nummer 2 und der Wert sollte in Bereich von 0,9-1,2 mV sein. <ol><li> Typ &quot;1&quot; in das Fenster neben dem Fenster &quot;erhöhten Druck&quot;. Für eine visuelle Klärung Schritte 2.7 und 2.8 beziehen sich auf 3. Werte außerhalb der angegebenen kann zu Schäden an der Brücke Oktal Amp zeigen Bereiche gefunden Figur. </li></ol></li><li> Gehen Sie zu &#39;definieren Einheiten &quot;in der oberen rechten Ecke des Fensters und wählen Sie&quot; cm H 2 O &quot;. Wenn diese Option nicht zur Verfügung steht, kann es manuell eingegeben werden. Klicken Sie auf OK. </li><li> Zurück zu den &quot;Brücke Amp&quot;-Menü (siehe 2.1). Wählen Sie 1 mV und setzen Verstärker auf &quot;Null&quot;;. Dies wird Kalibrierung abzuschließen und die Wassersäule sicher entfernt werden kann. </li></ol> 3. Aufnahme Lungenfunktion <ol><li> Wiegen Sie die Maus (g). HINWEIS: Eine Woche vor der physiologischen Beurteilung vorstellen die Maus an die Plethysmographie Kammerumgebung. Dies wird in Akklimatisierung zu unterstützen und reduzieren Stress, wenn dieses Verfahren zu einem späteren Zeitpunkt. Für eine schematische Gesamt Nachweis der UWBP Setup, siehe Bild 4. </li><li> Messung der Körpertemperatur mit einer rektalen Thermometers. Schmieren Sie das Thermometer mit Vaseline vor dem Einsetzen. Notieren Sie sich die Temperaturanzeige und reinigen das Schmiermittel mit 80% (v / v) Ethanol. Bei Verwendung sehr kleiner Tiere wie neonatale Maus Jungtieren kann die mittlere Körpertemperaturwert mit einem Infrarot-Thermometer anstelle bestimmt werden. </li><li> Legen Sie die Temperatur / Feuchtefühler auf der Ein-Loch-Ende der Plethysmographie Kammer. Notieren Sie die Temperatur, Luftfeuchtigkeit und barometric Druck in der Kammer Plethysmographie vor dem Platzieren der Maus innerhalb. </li><li> Platzieren Sie die Maus in die Plethysmographie Kammer, decken das offene Ende leicht. Dies ermöglicht die Maus um sich zu akklimatisieren. Schließen Sie die Kammer. </li><li> Mit der Temperatur / Feuchtefühler in der Seite der Plethysmographie Kammer mit einem Loch eingeführt, jetzt legen Sie die Wandler und die Spritze in der anderen Seite mit den beiden Löchern. </li><li> Drücken Sie &#39;Start&#39; auf dem Software-Programm und Rekord für ca. 15-45 Sekunden. Rekord 5-10 sec von Daten, wo das Tier bewegt sich nicht. Bewegung basalen Atemphysiologie der Tiere verändern und schlechte Ergebnisse. Atmungs sollte auf einem linearen Weg auf der Programm oszillieren. Dies sind verwendbare Daten. Hinweis: Wasserlassen oder Stuhlgang kann zu einer Erhöhung der Temperatur und Luftfeuchtigkeit innerhalb der Kammer Plethysmographie führen. Dies wird bei der Analyse Ergebnisse zu verschleiern. Im Falle eines Wasserlassen oder Stuhlgang, stoppen Sie die Aufnahme sofort und reinigen plethysmography Kammer mit 80% (v / v) Ethanol. Siehe für eine visuelle Darstellung der suboptimalen Ergebnissen, wo sollten die Daten abgelehnt Abbildung 6. </li><li> Nach der Aufnahme der 45 Sekunden, drücken Sie &quot;Stop&quot; auf der Software (siehe Tabelle Materialien und Ausrüstung)-Programm. Entfernen Sie die Maus vom Plethysmographie Kammer und sofort die Kammertemperatur und Luftfeuchtigkeit aufzeichnen. Nicht kontinuierlich Rekord für mehr als 45 Sekunden, da dies die Tier betonen. </li><li> Bringen Sie die Maus, um seinem Käfig, Spray und wischen die Kammer mit 80% (v / v) Ethanol. </li><li> Ermöglichen die Kammer zu trocknen und wieder den Ausgangswert der Temperatur und Feuchtigkeit, bevor auf die nächste Maus. Wiederholen Sie die Schritte 3,1-3,9 für nachfolgende Tiere. Hinweis: Wenn mehrere Tiere untersucht, dass die Kammertemperatur und die Feuchtigkeit in der Nähe Rückkehr zu Basislinienwerten vor jedem neuen Tier in die Kammer eingebracht. </li></ol> 4. Plethysmographie Analyse Nichtte: die Atmungsparameter wie Atemvolumen (V T) und Minutenvolumen die folgenden Variablen gemessen werden müssen berechnen: Atemfrequenz (Atemzüge / min), Gesamtatemzykluszeit (sec), Inspiration / Ablaufzeit (Ti / Te, Sekunden) und Druckänderung aufgrund jeder Atemzugvolumen (P T). 1 veranschaulicht die Variablen, die von einer Spur gemessen werden kann. Die folgenden Schritte verwenden eine Software (siehe Materialien und Ausrüstung Tabelle), diese Variablen zu messen. Bei der Analyse, zu vermeiden Regionen der Spur enthalten, Sniffing oder Bewegung. Für reproduzierbare Ergebnisse wird mindestens 5 Sekunden guter Atmungs Spur erforderlich. Ein Beispiel für verschiedene Atem Spuren beziehen sich auf die 5 und 6. <ol><li> Öffnen Sie den Bildschirm auf Vollbild stellen im Hinblick auf die 1: 1, und wählen Sie 5 Sekunden von nutzbaren Daten. Eine repräsentative Schnappschuss davon ist in 5 gezeigt. </li><li> Öffnen Sie den Mini-Daten Pad Fenster an der Spitze der Pro gefundenGramm in der Registerkarte Datapad. Wählen Sie Kanal 1 und wählen Sie &quot;Zyklus-Messungen&quot; in der linken Spalte und &quot;durchschnittliche zyklische Höhe&quot; in der rechten Spalte. <ol><li> Wählen Sie &quot;Option&quot; und setzen den Maßstab für Mindestspitzenerfassung bis 1 (ms). Dies wird Nachweis von jedem Spitzenwert zu ermöglichen und wird extrem wichtig, wenn kleine Tiere, die kleinen Schwingungen zu erzeugen. </li><li> Klicken Sie auf &#39;OK&#39;. Dies wird &quot;wegen jedem Atemvolumen Druckbiegung&quot; (P T)-Messung zu präsentieren. </li></ol></li><li> In der Mini-Datenlage, wählen Sie &#39;Zyklus Messungen&#39;, gefolgt von &#39;Ereigniszählung &quot;und klicken Sie auf&#39; OK &#39;. Dies wird die &quot;Frequenz&quot; (f) Messung zu präsentieren. <ol><li> Frequenz muss an Atemzügen / min umgerechnet werden. Dies wird durch Multiplizieren des Wertes von 60 Sekunden und Teilen der Antwort der Gesamtzeit der Aufnahme (min) durchgeführt. </li></ol></li><li> In der Mini-Datenlage, wählen Sie &#39;cycle-Messungen &quot;, gefolgt von&quot; Zeit &quot;und klicken Sie auf &#39;OK&#39;. Dies wird die &quot;Gesamtatemzykluszeit&quot; (T tot, sec) Messung zu präsentieren. </li><li> Die nächsten Schritte werden verwendet, um einen Makrobefehl zu erstellen, um Spitzen und Ausatmung Zeitwerte zu generieren. Sicherstellen, dass der Cursor direkt über dem Maximum des Peaks / Trog und fügen Sie einen Kommentar am 9. sequentielle Höhen und Tiefen. Beginnen Sie mit der Spitze des Schwingungs wie in Figur 5 gezeigt. </li><li> Anschließend wählen Sie Fenster: Daten-Pad und Spalte 1. In dem Fenster, das auf &quot;Auswahl-Informationen&quot; in der linken Spalte, &quot;Dauer&quot; in der rechten Spalte und klicken Sie auf &#39;OK&#39; erscheint. </li><li> Wählen Sie Makro an der Spitze des Programms gefunden und starten Sie dann die Aufnahme. Wählen Sie nun Befehle: &#39;Suchen&#39;, &#39;Go&#39;, &#39;Start der Datei&#39; und klicken Sie auf &#39;Suchen&#39;. </li><li> Wählen Sie Befehle: &#39;Suchen&#39; und &#39;Suchen Kommentare&#39;. Geben Sie den gleichen Satz für den Kommentar-Box in der &#39;enthält&#39; vorgesehene Feld eingegeben haben. Wählen Sie die &quot;Zurück zum Punkt wählen&quot; Tab und &#39;Suchen&#39;. </li><li> Wählen Sie Befehle: &quot;Daten-Pad hinzufügen &#39;. Als nächstes wählen Sie Makro: Makro-Befehle und beginnen zu wiederholen. Die Wiederholungszahl angezeigten Fenster sollten auf 9 eingestellt werden. </li><li> Wählen Sie den Befehl: &quot;Weitersuchen&quot;. Wählen Sie den Befehl: &quot;Daten-Pad hinzufügen &#39;. Wählen Sie Makro-Befehle und Ende wiederholen schließlich. <ol><li> Wählen Sie nun das Makro und beenden Sie die Aufnahme. Speichern und benennen Sie das Makro nach dem Tiernummer. HINWEIS: Einrichten des Makros für jedes Tier kann das Makro für Längsschnittstudien verwendet werden und spart Zeit. </li></ol></li><li> Das Makro kann jetzt ausgeführt werden, um die Inspiration (T i) und Verfall (T e) Zeit zwischen den einzelnen Kommentar zu erhalten. Die Daten werden unter Kanal 1 der Datapad erscheinen. Ablauf und Inspiration erfolgt fortlaufend und die Daten werden in dieser Reihenfolge angezeigt. <ol><li> Die Daten müssen manuell in Einatmung und Ausatmung Werte aufgeteilt werden. Der Mittelwert der vier Datenwerte für jeden Parameter, den Mittelwert T i und T e zu erhalten. </li></ol></li><li> Wenn die Primärwerte wurden mit dem Atemvolumen (V T, ML) abgeleitet wird, berechnet werden. Um das Atemvolumen die Gleichung der Drorbaugh und Fenn 8 verwendet zu erhalten: V T (ml) = (P T / P K) x (V K) x ((T CORE (P B - P C)) / (T CORE (P B - C P) - T C (P B - P CORE))) Wo V T: Tidalvolumen P k: Druckablenkung durch jede Injektion von 1 ml (siehe Schritt 2.5) T Kern: Kerntemperatur von jedem Tier P C: Wasserdampfdruck bei Raumtemperatur X Relative Luftfeuchtigkeit in chamber T C: Temperatur in der Tierkammer P Kern: Druck bei Körpertemperatur (Wasserdampfdruck bei Körpertemperatur x 1,0) P t: Druck Ablenkung durch jedes Atemvolumen V k: Volume Injektion für die Kalibrierung P B: Luftdruck </li><li> Sobald die Atemvolumen wurde so berechnet, die folgenden Parameter bestimmt werden: <ul><li> Minutenvolumen (ml / min) = V T XF </li><li> Minutenvolumen (ml / min / kg) = (V T XF) / Körpergewicht (kg) </li><li> V T (ml / kg) = V T (ml) / Körpergewicht (kg) </li><li> Inspirations Kapazität (%) = T i / T tot </li><li> Inspirationsflussrate (ml / s) = V T / T i </li><li> Verhältnis von Inspirationszeit zu Ablaufzeit = T i / T e </li><li> Gesamtzykluszeit (sec) = Inspirationszeit (sec) + Ablaufzeit (sec) </li></ul></li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> World Health Organization, World Health Statistics. , (2008).</li><li>Jones, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M2+macrophage+polarization+is+associated+with+alveolar+formation+during+postnatal+lung+development.">M2 macrophage polarization is associated with alveolar formation during postnatal lung development.</a> Respir. Res. 14 (41), 14-41 (2013).</li><li>Campbell, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+factor-induced+airway+hyperreactivity+in+allergic+and+normal+mice.">Stem cell factor-induced airway hyperreactivity in allergic and normal mice.</a> Am. J. Pathol. 154 (4), 1259-1265 (1999).</li><li>Card, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclooxygenase-2+deficiency+exacerbates+bleomycin-induced+lung+dysfunction+but+not+fibrosis.">Cyclooxygenase-2 deficiency exacerbates bleomycin-induced lung dysfunction but not fibrosis.</a> Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 37 (3), 300-308 (2007).</li><li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+unrestrained+plethysmography+and+forced+oscillation+for+identifying+genetic+variability+of+airway+responsiveness+in+inbred+mice.">Comparison of unrestrained plethysmography and forced oscillation for identifying genetic variability of airway responsiveness in inbred mice.</a> Physiol. Genomics. 43 (1), 1-11 (2011).</li><li>Flandre, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+somatic+growth,+strain,+and+sex+on+double-chamber+plethysmographic+respiratory+function+values+in+healthy+mice.">Effect of somatic growth, strain, and sex on double-chamber plethysmographic respiratory function values in healthy mice.</a> J. Appl. Physiol. 94 (3), 1129-1136 (2003).</li><li>Petak, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperoxia-induced+changes+in+mouse+lung+mechanics:+forced+oscillations+vs.+barometric+plethysmography.">Hyperoxia-induced changes in mouse lung mechanics: forced oscillations vs. barometric plethysmography.</a> J. Appl. Physiol. 90 (6), 2221-2230 (2001).</li><li>Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+barometric+method+for+measuring+ventilation+in+newborn+infants.">A barometric method for measuring ventilation in newborn infants.</a> Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).</li><li>Milton, P. L., Dickinson, H., Jenkin, G., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+respiratory+physiology+of+C57BL/6+mice+following+bleomycin+administration+using+barometric+plethysmography.">Assessment of respiratory physiology of C57BL/6 mice following bleomycin administration using barometric plethysmography.</a> Respiration. 83 (3), 253-266 (2012).</li><li>Gargiulo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+anesthesia,+analgesia,+and+care,+part+I:+anesthetic+considerations+in+preclinical+research.">Mice anesthesia, analgesia, and care, part I: anesthetic considerations in preclinical research.</a> ILAR J. 53 (1), 55-69 (2012).</li><li>Hildebrandt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+other+considerations+for+in+vivo+imaging+of+small+animals.">Anesthesia and other considerations for in vivo imaging of small animals.</a> ILAR J. 49 (1), 17-26 (2008).</li><li>Meijer, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+restraint+and+injection+methods+on+heart+rate+and+body+temperature+in+mice.">Effect of restraint and injection methods on heart rate and body temperature in mice.</a> Lab Anim. 40, 382-391 (2006).</li><li>Hamelmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+measurement+of+airway+responsiveness+in+allergic+mice+using+barometric+plethysmography.">Noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice using barometric plethysmography.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156 (3), 766-775 (1997).</li><li>Lim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cells+reduce+lung+injury+in+immunocompromised+mice+but+not+in+immunocompetent+mice.">Human mesenchymal stem cells reduce lung injury in immunocompromised mice but not in immunocompetent mice.</a> Respiration. 85 (4), 332-341 (2013).</li><li>Murphy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amnion+epithelial+cells+prevent+Bleomycin-induced+lung+injury+and+preserve+lung+function.">Human amnion epithelial cells prevent Bleomycin-induced lung injury and preserve lung function.</a> Cell Transplant. 20, 909-923 (2011).</li><li>Murphy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amnion+epithelial+cells+do+not+abrogate+pulmonary+fibrosis+in+mice+with+impaired+macrophage+function.">Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function.</a> Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).</li><li>Wichers, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+exposing+rodents+to+resuspended+particles+using+whole-body+plethysmography.">A method for exposing rodents to resuspended particles using whole-body plethysmography.</a> Part. Fibre Toxicol. 13 (12), (2006).</li><li>Chong, B. T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+bronchoconstriction+using+whole-body+plethysmograph:+comparison+of+freely+moving+versus+restrained+guinea+pigs.">Measurement of bronchoconstriction using whole-body plethysmograph: comparison of freely moving versus restrained guinea pigs.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 39 (3), 163-168 (1998).</li><li>Lizuka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+respiratory+function+using+whole-body+plethysmography+in+unanesthetized+and+unrestrained+nonhuman+primates.">Measurement of respiratory function using whole-body plethysmography in unanesthetized and unrestrained nonhuman primates.</a> J. Toxicol. Sci. 35 (6), 863-870 (2010).</li><li>McGregor, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+prenatal+exposure+to+carbon+monoxide+on+breathing+and+growth+of+the+newborn+guinea+pig.">The effect of prenatal exposure to carbon monoxide on breathing and growth of the newborn guinea pig.</a> Pediatr. Res. 43, 126-131 (1998).</li><li>Lundblad, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reevaluation+of+the+validity+of+unrestrained+plethysmography+in+mice.">A reevaluation of the validity of unrestrained plethysmography in mice.</a> J. Appl. Physiol. 93, 1198-1207 (2002).</li><li>Bartlett, D., Tenney, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+breathing+in+experimental+anemia.">Control of breathing in experimental anemia.</a> Respir. Physiol. 10 (3), 384-395 (1970).</li><li>Malan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventilation+measured+by+body+plethysmography+in+hibernating+mammals+and+in+poiiulotherms.">Ventilation measured by body plethysmography in hibernating mammals and in poiiulotherms.</a> Respir. Physiol. 17 (1), 32-44 (1973).</li><li>Seifert, E. L., Mortola, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circadian+pattern+of+breathing+in+conscious+adult+rats.">The circadian pattern of breathing in conscious adult rats.</a> Respir. Physiol. 129 (3), 297-305 (2002).</li><li>DuBois, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+measuring+airway+resistance+in+man+using+a+body+plethysmograph:+Values+in+normal+subject+and+in+patients+with+respiratory+disease.">A new method for measuring airway resistance in man using a body plethysmograph: Values in normal subject and in patients with respiratory disease.</a> J. Clin. Invest. 35 (3), 327-335 (1956).</li><li>Enhorning, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+plethysmography,+does+it+measure+tidal+volume+of+small+animals.">Whole-body plethysmography, does it measure tidal volume of small animals.</a> Can. J. Physiol. Pharmacol. 76 (10-11), 945-951 (1998).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+unrestrained+single-chamber+plethysmography+provide+a+valid+assessment+of+airway+responsiveness+in+allergic+BALB/c+mice.">Does unrestrained single-chamber plethysmography provide a valid assessment of airway responsiveness in allergic BALB/c mice.</a> Respir. Res. 10 (61), (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing interests. The authors have no conflicts to disclose.

Die hier beschriebene Technik ist eine nicht-invasive Methode zur Beurteilung der respiratorischen Parameter der ungehemmten und nicht narkotisierten Mäusen. Die Stärken dieses Protokoll sind seine Einfachheit und Präzision, um die Lungenfunktion in Längsrichtung mit minimalen Artefakten zu messen. Es gibt jedoch einige Einschränkungen und kritische Schritte zu dem Verfahren angemerkt werden. Erstens und am wichtigsten, muss die Maus ruhig in der Kammer für mindestens fünf Sekunden lang. Mehrspannungs das Atemmus...

Lungenfunktionsstörung ist eine der Hauptursachen von Morbidität und Mortalität auf der Welt. Die Bedingung ist durch eine unzureichende Sauerstoffaustausch, auch mit Husten, Brustschmerzen und Atemnot gekennzeichnet. Erkrankung der Atemwege entfallen ca. 10% der Mortalität weltweit 1. Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation werden Mortalitätsraten mit steigender Tendenz aufgrund anhaltender Rauchen, Umweltverschmutzung und Berufsreizstoffe. UWBP ist eine sinnvolle Ergänzung für das Studium der Physiologie der Lunge, die stark Komplimente traditionellen biochemischen und histologischen Analysen 2. Andere Verfahren zur Lungenbewertung verwendet werden, nicht die gleichen Vorteile bieten wie UWBP. Invasive Plethysmographie ist eine häufig verwendete Technik, die das Tier anästhesiert 3,4 und somit sind resultierende Atmungsmessungen nicht reflektierenden eines natürlichen Zustand erfordert. Ferner wird die Anforderung für die mechanische Beatmung und chemischen Herausforderungen entgegen zukünftige Messungen 3,4.Ein anderes Verfahren zum Sammeln von Atemdaten durch erzwungene Schwingung, die empfindlicher auf Änderungen der Atmungsparameter feineren Vergleich zu UWBP 5 ist. Erzwungene Schwingung ist jedoch eine invasive Technik und erfordert Tier Beendigung der Datenerfassung 5-7. UWBP geht darum, ein Tier in einer spezialisierten Kammer. Während der Inspiration wird die Luft erwärmt und Gezeiten in der Lunge zunehmenden Wasserdampfdruck befeuchtet und thermische Ausdehnung der Gas 8 verursacht. Dieser Effekt führt zu einer Nettoänderung der Luftvolumen Schaffung einer Druckerhöhung innerhalb des Plethysmographen Kammer 8. Das Gegenteil tritt während der Exspiration die Schaffung einer Atemwellenform von dem Tier. Wellenformanalyse wird dann verwendet, um aus den Atem Spur zu messen: Atemfrequenz (Atemzüge / min), Gesamtatemzykluszeit (sec), Inspiration / Ablaufzeit (Ti / Te, sec) und Veränderungen in der Druck aufgrund jedem Atemvolumen (P T). <strong&gt; Abbildung 1 veranschaulicht jedes Messungen Herkunft aus einer Atem Spur. Diese Messungen sind einfach zu berechnen und mehrere Atmungsparameter können aus diesen Messungen abgeleitet werden. Diese Parameter sind: Atemvolumen (das Volumen der Luft, die zwischen normalen und Ausatmung), Minutenvolumen (Volumen von Gas aus der Lunge pro Minute eingeatmet), Inspirationsarbeitszyklus (der Prozentsatz der Inspirationszeit auf die Gesamtatemzyklusdauer) und inspiratorische Flussrate (die Menge an Luft in einer gegebenen Zeit angeregt). UWBP eine präzise, ​​nicht-invasive, quantitative Analyse von Atemphysiologie in Tiermodellen und kann zur Messung des Fortschreitens der Erkrankung der Atemwege und die Lungenfunktion 6,9 verwendet werden. Im Gegensatz zu anderen Techniken Plethysmographie, vermeidet UWBP die Anwendung von Betäubungsmitteln, Beschränkungen und invasive Manipulationen, die Artefakte und experimentelle Variabilität 6,9 herzustellen. Anästhesie Atmung zu unterdrücken,verändern Herzfrequenz und kann eine Herausforderung bis 10 regulieren. Stützen induzieren eine Erhöhung der Atmung durch zusätzliche Stress durch Corticosteron und Adrenalin frei 11,13. Das Hauptmerkmal der UWBP wiederholt physiologischen Beurteilung was sie für eine Längsschnittstudien. UWBP wird dringend für die Längs Beurteilung der Lungenphysiologie empfohlen und bietet eine wertvolle Fähigkeit für zukünftige Atemarzneimittelbewertung. Bleomycin, Ovalbumin, und Hypoxie wurden verwendet, um Atem Herausforderungen in mehreren Studien induzieren und UWBP erfolgreich genaue physiologische Lungenbewertung 7,9,13-16 gemessen. Das beschriebene Protokoll ist für erwachsene Standardlabormäusen konzipiert. Allerdings hat UWBP auf andere Tiere wie Ratten, Meerschweinchen und Primaten 17-20 angepasst. UWBP ist nicht nur auf die Beurteilung Lungenfehlfunktion beschränkt, sondern auch für die Beurteilung der Lungenreifung 3 verwendet.Die Vielseitigkeit, Einfachheit und Reproduzierbarkeit der UWBP haben eine ausgezeichnete Technik zur Bewertung der Lungenfunktion bei Tieren festgestellt. Verschiedene Software (siehe Materialien und Geräte-Tabelle) wird benötigt um dieses Verfahren zu folgen. Ein erfahrener Wissenschaftler in der Lage wäre, dieses Protokoll mit einer Maus innerhalb 1 Stunde durchzuführen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1031">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:263px;">LabChart 7 software (for Macintosh)</td>
			<td style="width:139px;">ADINSTRUMENTS</td>
			<td style="width:155px;">MLU60/7</td>
			<td style="width:475px;">used in protocol step 4</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">PowerLab 8/30 (model ML870)</td>
			<td>ADINSTRUMENTS</td>
			<td>PL3508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Octal Bridge Amp (model ML228)</td>
			<td>ADINSTRUMENTS</td>
			<td>FE228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Black BNC to BNC cable (1m)</td>
			<td>ADINSTRUMENTS</td>
			<td style="width:155px;">MLAC01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Macintosh OS&#160;</td>
			<td>Apple Inc.&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:475px;">Mac OS X 10.4 or later</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Surgipack Digital Rectal Thermometer&#160;</td>
			<td>Vega Technologies</td>
			<td>MT-918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Grass volumeteric pressure transducer PT5A</td>
			<td>Grass Instruments Co.</td>
			<td style="width:155px;">Model number PT5A; serial No. L302P4.</td>
			<td style="width:475px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1ml Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:263px;">5ml serological syringe pipettes</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>606160</td>
			<td style="width:475px;">Connected via plastic tubing</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Balance/Scales</td>
			<td>VWR International, Pty Ltd</td>
			<td>SHIMAUW220D</td>
			<td style="width:475px;">Any weighing balance with of 0.1 gram resolution</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">HM40 Humidity &#38; temperature meter&#160;</td>
			<td>Vaisala&#160;</td>
			<td>HM40A1AB</td>
			<td style="width:475px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;">Barometer</td>
			<td>Barometer World</td>
			<td>1586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;">Laboratory tubing</td>
			<td>Dow Corning&#160;</td>
			<td>508-101</td>
			<td style="width:475px;">Used to connect water column to the syringe and pressure transducer</td>
		</tr>
		<tr height="136">
			<td height="136" style="height:136px;width:263px;">Cylindrical Perspex Chamber</td>
			<td>Dynalab Corp.</td>
			<td></td>
			<td style="width:475px;">Custom built cylindrical chamber with internal dimensions as follows: 50mm(w) x 1500mm(l). There are two lids for each side, with dimensions 80mm(l) x 80mm(w). Each lid has a 60mm wide circular hole cut on the face of the lid 50mm deep. This allows the chamber to fit into the lid. A rubber ring is fitted around each hole of the lid where the chamber will fit. For attachment of syringe and pressure transducer, the openings are 5mm in diameter. For attachment of humidity probe, the openings are 25mm in diameter.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">80% Ethanol (4L)</td>
			<td>VWR International, Pty Ltd</td>
			<td>BDH1162-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography

Atemfunktionsstörung ist eine der führenden Ursachen von Morbidität und Mortalität in der Welt und die Sterberate weiter steigen. Quantitative Beurteilung der Lungenfunktion in Nagetiermodellen ist ein wichtiges Instrument in der Entwicklung künftiger Therapien. Häufig für die Beurteilung der Atemfunktion einschließlich invasiver Plethysmographie und erzwungenen Schwingung verwendeten Techniken. Während diese Techniken wertvolle Informationen, die Datenerfassung birgt Artefakte und experimentelle Variabilität aufgrund der Notwendigkeit für die Anästhesie und / oder invasiven Instrumenten des Tieres. Im Gegensatz dazu ungebremst Ganzkörper-Plethysmographie (UWBP) bietet eine präzise, ​​nicht-invasive, quantitative Weg, auf dem die Atmungsparameter zu analysieren. Diese Technik vermeidet die Verwendung von Anästhesie und Beschränkungen, die den traditionellen Plethysmographie Techniken gemeinsam ist. Dieses Video wird die UWBP Verfahren einschließlich der Geräte einzurichten, die Kalibrierung und die Lungenfunktion Aufnahme zu demonstrieren. Eswird erklärt, wie die gesammelten Daten zu analysieren, zu identifizieren sowie experimentelle Ausreißer und Artefakte, die von Tierbewegungen zur Folge hat. Die mit dieser Technik erhalten Atmungsparameter umfassen Atemvolumen, Minutenvolumen, Inspirations Einschaltdauer, Einatemströmungsgeschwindigkeit und das Verhältnis von Inspiration Zeit, um Ablaufzeit. UWBP nicht auf spezielle Fähigkeiten verlassen und ist kostengünstig durchzuführen. Ein Schlüsselmerkmal der UWBP und attraktiv für potentielle Nutzer, ist die Fähigkeit, wiederholte Messungen der Lungenfunktion am gleichen Tier durchzuführen.

Wenn dieses Verfahren korrekt ausgeführt wurde, wird eine einheitliche Schwing Spur auf der Datenanalyse-Software erstellt. Das Verfahren bietet eine Atem Spur innerhalb von wenigen Minuten nach dem Setup mit einfachen Rechen Berechnungen aufgeführt Atemparameter zu bestimmen. Abbildung 5 ein geeigneter Atem Spur von einem Steuer (gesunden) Maus. Entsprechende oszillierende Daten erzeugt wird, wenn das Tier nicht aktiv bewegen. UWBP ist eine äußerst nützliche und zuverl...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Respiratory Function in Mice Using Unrestrained Whole-body Plethysmography at JoVE.com

Measuring Respiratory Function in Mice Using Unrestrained Whole-body Plethysmography

Die Beurteilung der Atemphysiologie hat traditionell auf Techniken, die Zurückhaltung oder Sedierung des Tieres erfordern verlassen. Hemmungslose Ganzkörper-Plethysmographie, jedoch bietet eine präzise, ​​nicht-invasive, quantitative Analyse der Atemphysiologie in Tiermodellen. Darüber hinaus ermöglicht das Verfahren wiederholt Atem Bewertung der Mäuse so dass für Langzeitstudien.

Messatemfunktion im Maus Mit Hemmungslose Ganzkörper-Plethysmographie

Respiratory dysfunction is one of the leading causes of morbidity and mortality in the world and the rates of mortality continue to rise. Quantitative ...

measuring-respiratory-function-mice-using-unrestrained-whole-body

Research

JoVE Journal

Biology

30.0K Aufrufe.  Monash Institute of Medical Research.  Die Beurteilung der Atemphysiologie hat traditionell auf Techniken, die Zurückhaltung oder Sedierung des Tieres erfordern verlassen. Hemmungslose Ganzkörper-Plethysmographie, jedoch bietet eine präzise, ​​nicht-invasive, quantitative Analyse der Atemphysiologie in Tiermodellen. Darüber hinaus ermöglicht das Verfahren wiederholt Atem Bewertung der Mäuse so dass für Langzeitstudien. 

Serie: Measuring Respiratory Function in Mice Using Unrestrained Whole-body Plethysmography

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

Mess-Exocytose in Neuronen mit FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Forschung

Biologie

Measuring Blood Pressure in Mice using Volume Pressure Recording, a Tail-cuff Method

The CODA 8-Channel High Throughput Non-Invasive Blood Pressure system measures the blood pressure in up to 8 mice or rats simultaneously. The CODA tail-cuff system uses Volume Pressure Recording (VPR) to measure the blood pressure by determining the tail blood volume. A specially designed differential pressure transducer and an occlusion tail-cuff measure the total blood volume in the tail without the need to obtain the individual pulse signal. Special attention is afforded to the length of the occlusion cuff in order to derive the most accurate blood pressure readings. VPR can easily obtain readings on dark-skinned rodents, such as C57BL6 mice and is MRI compatible. The CODA system provides you with measurements of six (6) different blood pressure parameters; systolic and diastolic blood pressure, heart rate, mean blood pressure, tail blood flow, and tail blood volume. Measurements can be made on either awake or anesthetized mice or rats. The CODA system includes a controller, laptop computer, software, cuffs, animal holders, infrared warming pads, and an infrared thermometer. There are seven different holder sizes for mice as small as 8 grams to rats as large as 900 grams.

The CODA 8-Channel High Throughput Non-Invasive Blood Pressure system measures the blood pressure in up to 8 mice or rats simultaneously. This tail-cuff system uses Volume Pressure Recording (VPR) to measure the blood pressure by determining the tail blood volume.

Blutdruckmessung in Mäuse mit Volume Druck Recording, ein Tail-Manschette Methode

The CODA 8-Channel High Throughput Non-Invasive Blood Pressure system measures the blood pressure in up to 8 mice or rats simultaneously. The CODA ...

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of aging suggests a role for mtDNA mutations, which can alter bioenergetics homeostasis and cellular function, in the aging process 3. A wealth of evidence has been compiled in support of this theory 1,4, an example being the mtDNA mutator mouse 5; however, the precise role of mtDNA damage in aging is not entirely understood 6,7.
Observing the activity of respiratory enzymes is a straightforward approach for investigating mitochondrial dysfunction. Complex IV, or cytochrome c oxidase (COX), is essential for mitochondrial function. The catalytic subunits of COX are encoded by mtDNA and are essential for assembly of the complex (Figure 1). Thus, proper synthesis and function are largely based on mtDNA integrity 2. Although other respiratory complexes could be investigated, Complexes IV and II are the most amenable to histochemical examination 8,9. Complex II, or succinate dehydrogenase (SDH), is entirely encoded by nuclear DNA (Figure 1), and its activity is typically not affected by impaired mtDNA, although an increase might indicate mitochondrial biogenesis 10-12. The impaired mtDNA observed in mitochondrial diseases, aging, and age-related diseases often leads to the presence of cells with low or absent COX activity 2,12-14. Although COX and SDH activities can be investigated individually, the sequential double-labeling method 15,16 has proved to be advantageous in locating cells with mitochondrial dysfunction 12,17-21.
Many of the optimal constitutions of the assay have been determined, such as substrate concentration, electron acceptors/donors, intermediate electron carriers, influence of pH, and reaction time 9,22,23. 3,3'-diaminobenzidine (DAB) is an effective and reliable electron donor 22. In cells with functioning COX, the brown indamine polymer product will localize in mitochondrial cristae and saturate cells 22. Those cells with dysfunctional COX will therefore not be saturated by the DAB product, allowing for the visualization of SDH activity by reduction of nitroblue tetrazolium (NBT), an electron acceptor, to a blue formazan end product 9,24. Cytochrome c and sodium succinate substrates are added to normalize endogenous levels between control and diseased/mutant tissues 9. Catalase is added as a precaution to avoid possible contaminating reactions from peroxidase activity 9,22. Phenazine methosulfate (PMS), an intermediate electron carrier, is used in conjunction with sodium azide, a respiratory chain inhibitor, to increase the formation of the final reaction products 9,25. Despite this information, some critical details affecting the result of this seemly straightforward assay, in addition to specificity controls and advances in the technique, have not yet been presented.

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

The cytochrome c oxidase/sodium dehydrogenase (COX/SDH) double-labeling method allows for direct visualization of mitochondrial respiratory enzyme deficiencies in fresh-frozen tissue sections. This is a straightforward histochemical technique and is useful in investigating mitochondrial diseases, aging, and aging-related disorders.

Visualisierung der mitochondrialen Atmungskette Funktion mit Cytochrom C Oxidase / Succinat-Dehydrogenase (COX / SDH) Double-Kennzeichnung Histochemie

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique

The forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational tool permitting the experimental assessment of lung function in mice in a comprehensive, detailed, precise and reproducible manner. It provides measurements of respiratory system mechanics through the analysis of pressure and volume signals acquired in reaction to predefined, small amplitude, oscillatory airflow waveforms, which are typically applied at the subject's airway opening. The present protocol details the steps required to adequately execute forced oscillation measurements in mice using a computer-controlled piston ventilator (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada). The description is divided into four parts: preparatory steps, mechanical ventilation, lung function measurements, and data analysis. It also includes details of how to assess airway responsiveness to inhaled methacholine in anesthetized mice, a common application of this technique which also extends to other outcomes and various lung pathologies. Measurements obtained in na&iuml;ve mice as well as from an oxidative-stress driven model of airway damage are presented to illustrate how this tool can contribute to a better characterization and understanding of studied physiological changes or disease models as well as to applications in new research areas.

The present protocol provides a detailed step-by-step description of the procedures required to execute measurements of respiratory system mechanics as well as the assessment of airway responsiveness to inhaled methacholine in mice using the forced oscillation technique (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada).

Auswertung der Atemwege Mechanik in Mäuse mit den Forced Oscillation Technique

The  forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational  tool permitting the experimental assessment of lung function in mice ...

Whole-Body Nanoparticle Aerosol Inhalation Exposures

Inhalation is the most likely exposure route for individuals working with aerosolizable engineered nano-materials (ENM). To properly perform nanoparticle inhalation toxicology studies, the aerosols in a chamber housing the experimental animals must have: 1) a steady concentration maintained at a desired level for the entire exposure period; 2) a homogenous composition free of contaminants; and 3) a stable size distribution with a geometric mean diameter &lt; 200 nm and a geometric standard deviation &sigma;g &lt; 2.5 5. The generation of aerosols containing nanoparticles is quite challenging because nanoparticles easily agglomerate. This is largely due to very strong inter-particle forces and the formation of large fractal structures in tens or hundreds of microns in size 6, which are difficult to be broken up. Several common aerosol generators, including nebulizers, fluidized beds, Venturi aspirators and the Wright dust feed, were tested; however, none were able to produce nanoparticle aerosols which satisfy all criteria 5.
A whole-body nanoparticle aerosol inhalation exposure system was fabricated, validated and utilized for nano-TiO2 inhalation toxicology studies. Critical components: 1) novel nano-TiO2 aerosol generator; 2) 0.5 m3 whole-body inhalation exposure chamber; and 3) monitor and control system. Nano-TiO2 aerosols generated from bulk dry nano-TiO2 powders (primary diameter of 21 nm, bulk density of 3.8 g/cm3) were delivered into the exposure chamber at a flow rate of 90 LPM (10.8 air changes/hr). Particle size distribution and mass concentration profiles were measured continuously with a scanning mobility particle sizer (SMPS), and an electric low pressure impactor (ELPI). The aerosol mass concentration (C) was verified gravimetrically (mg/m3). The mass (M) of the collected particles was determined as M = (Mpost-Mpre), where Mpre and Mpost are masses of the filter before and after sampling (mg). The mass concentration was calculated as C = M/(Q*t), where Q is sampling flowrate (m3/min), and t is the sampling time (minute). The chamber pressure, temperature, relative humidity (RH), O2 and CO2 concentrations were monitored and controlled continuously. Nano-TiO2 aerosols collected on Nuclepore filters were analyzed with a scanning electron microscope (SEM) and energy dispersive X-ray (EDX) analysis.
In summary, we report that the nano-particle aerosols generated and delivered to our exposure chamber have: 1) steady mass concentration; 2) homogenous composition free of contaminants; 3) stable particle size distributions with a count-median aerodynamic diameter of 157 nm during aerosol generation. This system reliably and repeatedly creates test atmospheres that simulate occupational, environmental or domestic ENM aerosol exposures.

A whole-body nanoparticle aerosol inhalation exposure facility was constructed for nano-sized titanium dioxide (TiO2) inhalation toxicology studies. This system provides nano-TiO2 aerosol test atmospheres that have: 1) a steady mass concentration; 2) a homogenous composition free of contaminants; and 3) a stable particle size distribution during aerosol generation.

Ganzkörper-Nanopartikel Aerosol Inhalation Exposures

Inhalation is the most likely exposure route for individuals working with aerosolizable engineered nano-materials (ENM). To properly perform nanoparticle ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Mess Glutathion-induzierte Fütterung Antwort in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Funktionelle Rekonstitution und Kanalaktivitätsmessungen von gereinigtem Wildtyp und mutierten CFTR-Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Messung der Steifigkeit von<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Maus Aorten Mit Rasterkraftmikroskopie

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Huntington&#8217;s disease. Recently, repeat expansion-containing RNA was shown to be the substrate for a novel type of protein translation called repeat-associated non-AUG-dependent (RAN) translation. Unlike canonical translation, RAN translation does not require a start codon and only occurs when repeats exceed a threshold length. Because there is no start codon to determine the reading frame, RAN translation occurs in all reading frames from both sense and antisense RNA templates that contain a repeat expansion sequence. Therefore, RAN translation expands the number of possible disease-associated toxic peptides from one to six. Thus far, RAN translation has been documented in eight different repeat expansion-based neurodegenerative and neuromuscular diseases. In each case, deciphering which RAN products are toxic, as well as their mechanisms of toxicity, is a critical step towards understanding how these peptides contribute to disease pathophysiology. In this paper, we present strategies to measure the toxicity of RAN peptides in the model system C. elegans. First, we describe procedures for measuring RAN peptide toxicity on the growth and motility of developing C. elegans. Second, we detail an assay for measuring postdevelopmental, age-dependent effects of RAN peptides on motility. Finally, we describe a neurotoxicity assay for evaluating the effects of RAN peptides on neuron morphology. These assays provide a broad assessment of RAN peptide toxicity and may be useful for performing large-scale genetic or small molecule screens to identify disease mechanisms or therapies.

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Repeat-associated non-ATG-dependent translational products are emerging pathogenic features of several repeat expansion-based diseases. The goal of the protocol described is to evaluate toxicity caused by these peptides using behavioral and cellular assays in the model system C. elegans.

Messung der RAN-Peptidtoxizität in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

In vivo Measurement of Knee Extensor Muscle Function in Mice

Skeletal muscle plasticity in response to countless conditions and stimuli mediates concurrent functional adaptation, both negative and positive. In the clinic and the research laboratory, maximal muscular strength is widely measured longitudinally in humans, with knee extensor musculature the most reported functional outcome. Pathology of the knee extensor muscle complex is well documented in aging, orthopedic injury, disease, and disuse; knee extensor strength is closely related to functional capacity and injury risk, underscoring the importance of reliable measurement of knee extensor strength. Repeatable, in vivo assessment of knee extensor strength in pre-clinical rodent studies offers valuable functional endpoints for studies exploring osteoarthritis or knee injury. We report an in vivo and non-invasive protocol to repeatedly measure isometric peak tetanic torque of the knee extensors in mice across time. We demonstrate consistency using this novel method to measure knee extensor strength with repeated assessment in multiple mice producing similar results.

Quantification of knee extensor maximal strength is imperative to understand functional adaptations to aging, disease, injury, and rehabilitation. We present a novel method to repeatedly measure in vivo knee extension isometric peak tetanic torque.

In vivo Messung der Kniestreckmuskelfunktion bei Mäusen

Skeletal muscle plasticity in response to countless conditions and stimuli mediates concurrent functional adaptation, both negative and positive. In the ...