TKMcG wird durch ein Stipendium von der kanadischen Thoracic Society unterstützt. AUTOREN BEITRAG Alle Autoren haben an der Konzeption des Manuskripts. Darüber hinaus TKMcG das Projekt initiiert, gesammelt experimentellen Ergebnisse, trugen zu dem Schreiben des Manuskripts und seine kritische Überprüfung. AR gesammelt und experimentellen Ergebnisse analysiert, entwarf das Manuskript und trug zu ihrer kritischen Bewertung. LF gesammelt experimentellen Ergebnisse und dazu beigetragen, die kritische Durchsicht des Manuskripts. TFS und JGM dazu beigetragen, die kritische Durchsicht des Manuskripts.

Die nachfolgend beschriebenen Verfahren wurden von der McGill University Institutional Animal Care Committee in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care (CCAC) zugelassen. 1. Vorbereitende Schritte <ol><li> Lösungen: <ol><li> Methacholine: Bereiten Sie eine Stammlösung bei 50 mg / ml und machen serielle Verdünnungen (1:1) auf den zu testenden Konzentrationen 5 basieren. Lassen Sie die Lösungen auf Raumtemperatur, bevor Vernebeln 5 zu erreichen. </li><li> Anästhetika: Verschiedene Therapien haben in der Literatur in verschiedenen Stämmen von Mäusen (Tabelle 1) berichtet. Hinweis: Regimen 1 wurde unter der vorliegenden Protokoll verwendet. </li></ol></li><li> Ausstattung: Das vorliegende Protokoll gilt für eine der beiden flexiVent Generationen flexiWare 7-Software unterstützt. Study Definition &amp; Planning, Experimentieren Sessio: Die Software-Funktionen sind in drei Module gegliedertn und Bewertung und Reporting. <ol><li> Schalten Sie das System (flexiVent FX) und / oder die Software starten. </li><li> An der ersten Sitzung Experimentieren oder jederzeit, bevor sie, öffnen Sie die Study Definition &amp; Planning-Modul, um die Studie Struktur vorgeben. </li><li> Klicken Sie auf das Erstellen einer neuen Studie Button und folgen Sie dem Assistenten, um eine Studie zu erstellen, skizzieren das Protokoll und definieren die experimentellen Gruppen und Themen untersucht werden. </li><li> Einleiten Experimentieren Sitzung durch Öffnen des Experimentieren Session-Modul und nach dem Start-up-Sequenz für das Studium und Template-Auswahl. </li><li> Vergeben Sie einen Betreff für die Messung vor Ort und bestätigen ihr Gewicht. </li><li> Fahren Sie mit der Kalibrierung des Systems, indem Sie die Schritte in der Betriebssoftware beschrieben. Sie werden an einer Stelle dazu aufgefordert werden, um die Kanüle verwendet werden (Schritt 1.3.3) an den Y-Schlauch befestigen für die Kalibrierung. </li><li> Critical Schritt. REPEAt Schritt 1.2.6 wenn die Kalibrierung erhaltenen Werte außerhalb des zulässigen Bereichs liegen. (Siehe flexiVent FX oder flexiWare 7 Benutzerhandbuch für die Modul-spezifische akzeptable Bereiche der Kalibrierwerte). </li><li> Abbrechen Anweisungen, um Lüftung und Datenaufzeichnung beginnen, es sei denn bereit, das Experiment zu starten. Diese können zu einem späteren Zeitpunkt gestartet werden. </li></ol></li><li> Themen: <ol><li> Anesthetize das Thema mit geeigneten Dosen von Anästhetika (Tabelle 1). </li><li> Stellen Sie sicher, dass das Thema hat eine chirurgische Ebene der Narkose erreicht. Das Motiv sollte keine Reaktion auf eine Zehe Prise zeigen und seine Atmung sollte regelmäßig sein und nicht gearbeitet. </li><li> Führen Sie eine Tracheotomie und kanülieren die Luftröhre. <ol><li> Legen Sie das Tier auf den Rücken und stellen eine Quelle von Wärme (zB Temperatur gesteuerte Heizdecke oder eine Lampe mit einer 60 Watt-Glühbirne liegt etwa 45 cm von der Maus, um eine übermäßige Erwärmung zu vermeiden). </li><li> Saubere the Rachenraum mit Alkohol und setzen die Luftröhre, indem Sie einen Hautschnitt und sanft Trennung der Submaxillardrüse und den Muskel Schicht abgedeckt wird. </li><li> Heben Sie die Luftröhre mit einem Paar von Mikro-Pinzette und übergeben Naht darunter. </li><li> Schneiden zwischen zwei Ringen des Knorpels nächsten Kehlkopf einen kleinen Einschnitt in die Luftröhre ohne Schnitte zu machen. </li><li> Legen Sie die zuvor kalibrierten Kanüle in der Schnittführung und vorantreiben es vorsichtig in die Luftröhre die Länge von ca. 5 Ringe. Hinweis: Die vorliegenden Experimente wurden unter Verwendung einer 1,2 cm langen Metall 18 Gauge Kanüle. </li><li> Critical Schritt. Sichern Sie die Kanüle in Ort mit der Naht. Die Befestigung sollte eine luftdichte Dichtung um die Kanüle. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Mechanische Lüftung <ol><li> Bringen Sie das Tier in der Nähe des Ventilators. </li><li> Starten Beatmung durch Auswählen einer vordefiniertenoder eine angepasste Belüftung Profil in der Lüftungs-Docker. </li><li> Schließen Sie das Tier an das Beatmungsgerät über den Y-Schlauch. </li><li> Kritischer Schritt. Richten des Tieres an das Beatmungsgerät und sicherzustellen, dass die Trachealkanüle in der gleichen Ebene wie der Ventilator auf eine mögliche Okklusion oder tracheale Kanüle Verdrehung zu vermeiden. </li><li> Kritischer Schritt. Führen Sie einen tiefen Inflation Störung durch einen Doppelklick auf den Namen, um die Störung Kanüleneinführvorrichtung und Befestigung überprüfen. In Abwesenheit eines Lecks, sollte das System in der Lage sein, um einen Druck von 30 cm H 2 O über 3 Sekunden lang halten, ohne übermäßige Lautstärke Verschiebung (Abbildung 1). Das aufgenommene Volumen und Druck Spuren sollte auch ohne Anzeichen von Offset-oder Verformung glatt wie diese eine Kanüle Obstruktion oder Abhandenkommen geben könnten. </li><li> Wenn nötig, verbinden Vitalzeichen Wandler für Herzfrequenz und Körpertemperatur Überwachung. Datenaufzeichnung kann eingeleitet werden either manuell oder automatisch über ein Skript. </li></ol> 3. Lungenfunktionsmessungen Messungen oder Befehle (zB Vernebler Aktivierung, Event Marker) kann automatisiert über vordefinierte oder benutzerdefinierte Skripts für die höchst kontrollierten und wiederholbaren experimentellen Prozess (Abbildung 2). Sechs Familien von Störungen, die zu einer Reihe von Parametern können die Atemwege Thema Mechanik an der Grundlinie zu beschreiben und nach einer bestimmten Herausforderung (Tabelle 2). <ol><li> Critical Schritt. Wenn Sie bereit sind, um mit den Messungen beginnen, führen Sie eine tiefe Inflation zu geschlossenen Bereichen Lunge rekrutieren und zu standardisieren Lungenvolumen Geschichte. </li><li> Critical Schritt. Überprüfen Sie die Abwesenheit von spontanen Atemanstrengungen, indem Sie einen Test Messung (z. B. PV-P oder PVs-V). Beachten Sie die Druck-Signal Messkurven im ausgewählten Datensatz Aussicht. Mit schrittweise PV Kurven,Druckplateaus sollte auch ohne Ausschläge nach unten definiert werden. Ein Schwung nach unten in Druck geben würde eine Einatembemühung vom Tier (Abbildung 3). </li><li> Leiten Sie die ausgewählte Skript durch Doppelklick auf den Titel. Scripts in der vorliegenden Studie verwendet in der Regel für Messungen im Lieferumfang enthalten: <ul><li> Eine Folge von Baseline-Messungen in dreifacher Ausfertigung. </li><li> Aktivierung der Vernebler für die Beurteilung der Atemwege Reaktionsfähigkeit auf inhalierte Methacholin. Hinweis: Wenn Sie vom System aufgefordert werden, laden rund 100 ul Kochsalzlösung oder einer Lösung von Methacholin in den Zerstäuber. Nebulization startet und stoppt automatisch. </li><li> Eine Sequenz von eng beabstandeten Messungen (alle 10-15 sec) über einen Zeitraum von etwa 3 min nach der Aktivierung des Zerstäubers. </li><li> Eine Aufforderung zur Durchführung einer weiteren Herausforderung und wiederholen Sie eine Sequenz von Messungen. Hinweis: Trocknen der Innenseite der Vernebler-Halterung mit einem Tupfer in bwischen Herausforderungen helfen können verhindern und Kondensation von Gebäude-up in der Inspirationsleitung. </li></ul></li><li> Am Ende des Experiments, stoppen Belüftung und lösen das Thema. </li><li> Wechseln Sie in das nächste Thema in der Betriebssoftware und bestätigen ihr Gewicht. </li><li> Critical Schritt. Spülen und trocknen Vernebler, Adapter, Y-Schlauch und Kanüle zwischen Subjekten. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.2.6 bis 3.6. </li><li> Am Ende des Tages, in der Nähe der experimentellen Sitzung. Denken Sie daran, spülen und trocknen Vernebler, Adapter, Y-Schlauch und Kanüle und das System Exspirationsventils vor Verlassen des Labors, indem Sie die Anweisungen des Herstellers reinigen. </li></ol> 4. Data Analysis Die Software berechnet und zeigt Parameter mit einer Störung verbunden ist. Es bietet auch eine Determinationskoeffizient (COD), die den Sitz des mathematischen Modells mit den Daten widerspiegelt. Jeder Datensatz mit einer Isoizient COD markiert ist wie von der Software ausgeschlossen. Bewertung von experimentellen Sitzungen werden Daten Re-Analyse und Erstellung von Export-Szenarien in der Bewertung und Reporting-Modul der Software. <ol><li> Öffnen Sie die Bewertung und Reporting-Modul, und erstellen Sie eine Export-Szenario, wobei darauf zu achten nur die Datensätze mit einer ausreichenden COD. </li><li> Export als benötigten Parameter, Druck-oder Fluss-Volumen-Kurve, Rohdatensatzes Signale oder Informationen unterliegen einer Tabellenkalkulation (siehe Tabelle 3). </li><li> Durchschnittliche Baseline-Messungen für jeden Parameter und Plot alle Messungen als Funktion der Zeit (siehe Abbildung 4). Sie können dann wählen, um die Fläche unter der Kurve zu berechnen, analysieren das allgemeine Profil der Kurven oder führen Sie eine statistische Analyse. </li><li> Um Atemwegsempfindlichkeit Ergebnisse in Abhängigkeit von der Konzentration des methacholine auszudrücken, für jeden Gegenstand zu bestimmen, Parameter und experimentelle Bedingung entweder ein bestimmterPunkt (zB peak) oder einer bestimmten Zeit nach jedem methacholine Herausforderung. Berechnen Gruppe Durchschnittswerte und Bericht oder Grundstück für jede experimentelle Bedingung (Tabelle 4, Abbildung 5). </li><li> Sie können sich auch die Berechnung der Konzentration, die eine Verdoppelung eines bestimmten Parameters Ausgangswert (PC 200; 5C), Anlegen einer Normalisierung (zB% Baseline) oder eine statistische Analyse. </li></ol>

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Die fortgesetzte Untersuchung der Atemwege Dysfunktion, wie es zu Asthma und anderen Erkrankungen der Lunge betrifft bleibt entscheidend für das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen von Krankheiten und die Entwicklung von Behandlungsmöglichkeiten. Die Verwendung von Mäusen zu modellieren Atemwegserkrankung war wesentlich in die Förderung des Verständnisses in dieser Krankheitsmechanismen. Bei der Prüfung der Bewertung Atemwege Funktionsstörung bei einem Patienten so klein wie eine Maus, mit zuverlässigen und genauen Mittel, mit denen die Lungenfunktion zu messen, ist kritisch. Darüber hinaus mit Werkzeugen ist, die Einblicke auf den Standort der Atemwege Dysfunktion oder therapeutische Wirkung ist von unschätzbarem Wert. Das BAV Technik vereint all diese Attribute und bietet eine leistungsstarke, integrative und translationalen Ansatz zu physiologischen Veränderungen zu bewerten. Um mit dieser Art der Messung bei Mäusen erfolgreich zu sein, ist besonders auf einige Schritte gegeben werden, nämlich die Kalibrierung des Systems, der Widerstand des endotrachealen cannula, die Art der Vernebler (ebenso wie das operative Einstellungen) die Positionierung des Tieres und die Standardisierung von Lungenvolumen Geschichte. Darüber hinaus ist es zwingend erforderlich, um gültige Datensätze zu erhalten, dass das Thema der Atmungsorgane passive während der Messungen bleibt. Dies kann durch die Verabreichung eines muskellähmende Mittel erreicht werden kann, arbeiten auf einer tiefen Ebene der Narkose oder durch Hyperventilieren das Thema zu einer Apnoe (siehe Tabelle 1) zu induzieren. Ermittler können durch die Beherrschung des Systems und seiner Betriebssystem-Software zu starten, falls gewünscht, mit Test-Lasten, während den Erwerb der notwendigen Fähigkeiten für Messungen in Mäusen. Es wäre dann logisch, reproduzierbare Ergebnisse in naiven Tieren, bevor er nach Modellen oder Krankheit behandelten Mäuse zu erzeugen. Da ein wichtiger Anteil der Krankheit Modelle Atemwege Forschung einbeziehen Aussetzen Tiere zu Agenten wie Allergene, Toxine, Schadstoffe, Zigarettenrauch oder Gase, die Variabilität in den Ergebnissen mit den measuremen erhaltent-Technik in diesem Artikel beschrieben, weshalb sie unter dem Belichtungsvorgang beeinflußt werden. Standardisierung der wichtigsten experimentellen Prozessen (zB mit Computer-gesteuerten Belichtung und Messsysteme 6, 13, 14) könnte möglicherweise erhebliche Auswirkungen bei der Verringerung der Variabilität. Beispiele in diesem Artikel vorgestellt stellen eine Auswahl von typischen Ergebnisse von naiven und Chlor-exponierten Mäusen Experimente während die Stärken als auch die Grenzen der Technik. Wie beispielsweise in Fig. 6 zu sehen ist, ist die Technik in der Lage ist reproduzierbar Lungenfunktionsmessungen. Während ähnliche Baseline Widerstandswerte zwischen Maus-Stämme gemeldet wurden, wurden Unterschiede in Elastanz jedoch 15 beobachtet. Wesentliche Änderungen sind auch zwischen Säugling und erwachsenen Mäusen 16 erwartet werden. Wie bei anderen in vivo physiologische Einschätzung, hohe Präzision Ergebnisse, wie those durch das BAV erzeugt, mit einer Konzession über den natürlichen Zustand der Probanden kommen. Dieses Prinzip, das als Phänotypisierung Unschärferelation 1 bezeichnet wird, gilt für die vorliegenden Protokoll in dem Sinne, dass Messungen in narkotisiert werden, tracheotomierte (oder oral intubiert) und beatmeten Patienten benötigen. Eine weitere Einschränkung der Technik wird in 5D-5F, wo Daten liegen nicht bei den höchsten Konzentrationen für die Chlor-exponierten Gruppe zur Verfügung, weil die Passform des Constant-Phasen-Modell auf die Daten ist über moderaten Bronchokonstriktion Armen beobachtet werden. Allerdings könnte schwer bronchoconstricted Tiere durch die Analyse Zrs direkt 15 oder über Dritte post-Analyse-Software, um komplexere mathematische Modelle passen, z. B. unter Berücksichtigung der Heterogenität der mechanischen Funktion 17 beurteilt werden. Ausgeschlossene Datensätze können auch beobachtet werden, wenn das Tier die Atemwege nicht ausreichend p werdenassive oder wenn der Widerstand der Kanüle zu hoch ist. Als Faustregel gilt, dass der Widerstand der Kanüle nicht überschreiten des Tieres Widerstand an der Grundlinie. Arbeiten mit einer Kanüle mit größerem Innendurchmesser und / oder kürzere Länge wird dazu beitragen, die Kanüle aufweist. Schließlich kann die vorliegende Demonstration FOT Messungen in Mäusen als zeitaufwendig und daher weniger effiziente Methode oder weniger für Longitudinalstudien gegenüber weniger invasive Techniken wahrgenommen werden. Letztere sind jedoch mit viel Unsicherheit in Bezug auf der Grundlage ihrer Ergebnisse verbunden und werden von vielen als fehlerhaft angesehen 1. Wiederholte invasive Messungen sind in oral intubiert Tieren möglich, obwohl technisch anspruchsvollen 17. Aus den Beispielen zeigten Ergebnisse der Gleichwertigkeit der beiden Generationen der flexiVent System zu produzieren Messungen der Atemmechanik sowie Atemwegs hyperreactivität und Überempfindlichkeit gegenüber inhalativen Methacholin nach Chlor-Exposition bei Mäusen. Wenn zur Charakterisierung oder verstehen physiologischen Veränderungen oder Krankheiten Modelle, die detaillierte Messung Aspekt im Zusammenhang mit der Technik kann dazu beitragen, den aktuellen Stand des Wissens zu erweitern.

Angemessene Charakterisierung der mechanischen Eigenschaften der Lunge bei Kleintieren geworden seit der aufkeimenden von Mausmodellen der Atemwege Wissenschaft unerlässlich. Wenn unter Verwendung der erzwungenen Schwingung Technik (FOT), eine Technik, auch beim Menschen verwendet werden, liefern diese Messungen eine starke, integrative und translationalen Ansatz, um sinnvolle physiologische Veränderungen zu studieren. FOT Messungen werden typischerweise durch Analysieren Druck und Volumen-Signale in Reaktion auf einen vorgegebenen, kleinen Amplitude, oszillierende Luftstrom Wellenform (auch als Störung oder Eingangssignal bezeichnet) auf das dem Atemweg Öffnung 1 aufgebracht erworbenen erhalten. In seiner einfachsten Form wäre ein FOT Störung eine einzelne sinusförmige Wellenform mit einer wohldefinierten Frequenz sein. Komplexere Störungen bestehen typischerweise aus einer Überlagerung einer Auswahl von spezifischen (gegenseitig prime) Frequenz Wellenformen, die ein breites Spektrum. Die Zersetzung des Multi-FrequenzEingangs-und Ausgangssignale in ihre Bestandteile unter Verwendung der Fourier-Transformation ermöglicht die Berechnung der Atmungsorgane Eingangsimpedanz (Zrs), dh die Übertragungsfunktion zwischen dem Eingangs-und Ausgangssignale, bei jeder Frequenz in der Störung 2 enthalten. Daher erlaubt die gleichzeitige FOT Beurteilung atemmechanischen über einen Bereich von Frequenzen in einem Handgriff 2. Fitting erweiterte mathematische Modelle (z. B. konstante Phase Ausführung 3), um die Impedanz Daten erlauben dann eine Aufteilung der Antwort in Atemwege (zentrale und periphere) und parenchymatösen Lungengewebe Parametern 1, 3. Da viele Faktoren, die die physiologische Reaktion (zB Atemfrequenz, Atemvolumen, Lungenvolumen, oberen Atemwege, Spontanatmung Bemühungen, den Zeitpunkt der Messungen) kontrolliert und standardisiert durch das Messsystem und experimentellen Verfahren, 1 die Technik KappeLage erzeugen präzise und reproduzierbare Messungen, sofern sie richtig durchgeführt wird. Das Ziel dieses Artikels ist es, einen detaillierten, chronologischen Beschreibung des Verfahrens, um solche Messungen in Mäusen ausführen benötigt wird. Das Protokoll besteht aus vier Teilen: vorbereitende Schritte (Reagenzien, Geräte und Themen), mechanische Belüftung, Lungenfunktion Messungen und Datenanalyse. Beispiele für repräsentative Ergebnisse der Atmungsorgane Mechanik unter Verwendung eines Computer-gesteuerten Kolben Ventilator (flexiVent, SCIREQ Inc, Montreal, QC, Kanada) vorgesehen sind. Diese wurden aus naiven Mäusen als auch von einer oxidativen Stress-driven Modell Atemwege Schäden durch Entzündung der Atemwege, Epithelzellschädigung und erhöhte Atemwegsempfindlichkeit auf inhalierte Aerosol methacholine 4, dadurch erhalten. Während dieses Protokoll wird häufig verwendet, um Atemwege Reaktionsfähigkeit auf inhalierte Methacholin beurteilen, reicht es zu anderen Ergebnissen und verss Krankheiten wie Asthma, chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD), Emphysem, Lungenfibrose, Lungenversagen sowie transgene Mäuse von Pathologien ähnlich der menschlichen Krankheit. Forschungsergebnisse mit diesem Tool kann zu einer besseren Charakterisierung und das Verständnis der physiologischen Veränderungen oder Krankheiten Modellen sowie die Expansion in neue Forschungsbereiche beitragen.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetyl-&beta;-methylcholine chloride </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A-2251</td>
 <td>Methacholine</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro-Adson forceps, serrated 12 cm</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11018-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Moria MC31 forceps, serrated-curved</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11370-31</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iris scissors-tough cut, straight 11.5 cm</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>14058-11</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spring scissors-2.5 mm blades, straight</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>15000-08</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Non-sterile blunt needle (18g x &frac12;")</td>
 <td>Brico Medical Supplies Inc.</td>
 <td>BN1805</td>
 <td>Endotracheal cannula</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Non-sterile 5-0 silk suture</td>
 <td>Seraflex</td>
 <td>IDI58000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate buffered solution</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>14190-144</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml conical tubes</td>
 <td>Starstedt</td>
 <td>SS-4001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml TB syringes</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>309626</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>200 &mu;l filter tips</td>
 <td>Biosphere</td>
 <td>70.760.211</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>flexiVent FX</td>
 <td>SCIREQ Inc. </td>
 <td>sales@scireq.com</td>
 <td><a href="http://www.scireq.com/" target="_blank">www.scireq.com</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aerogen Aeroneb nebulizer</td>
 <td>SCIREQ Inc.</td>
 <td>sales@scireq.com</td>
 <td><a href="http://www.scireq.com/" target="_blank">www.scireq.com</a></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique

Die erzwungene Schwingung Technik (FOT) ist eine leistungsstarke, integrative und translationale Werkzeug erlaubt die experimentelle Bestimmung der Lungenfunktion bei Mäusen in eine umfassende, detaillierte, präzise und reproduzierbar. Es bietet Messungen der Atemwege Mechanik durch die Analyse von Druck und Volumen-Signale in Reaktion auf vordefinierte kleine Amplitude schwingenden Luftstrom Wellenformen, die in der Regel auf das dem Atemweg Öffnung aufgebracht erworben. Das vorliegende Protokoll beschreibt die erforderlichen Schritte, um adäquat ausführen erzwungenen Schwingung Messungen an Mäusen mit einem Computer-gesteuerten Kolben Ventilator (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, QC, Canada). Vorbereitende Schritte, mechanische Belüftung, Lungenfunktion Messungen und Datenanalyse: Die Beschreibung ist in vier Teile gegliedert. Es enthält auch Details, wie Atemwege Reaktionsfähigkeit auf inhalierte Methacholin beurteilen bei narkotisierten Mäusen, eine gemeinsame Anwendung dieser technique die sich auch auf andere Ergebnisse und verschiedene Erkrankungen der Lunge. Messungen in naiven Mäusen sowie aus einem oxidativen Stress-Driven-Modell der Atemwege Schäden erhalten werden dargestellt, um darzustellen, wie dieses Tool zu einem besseren Charakterisierung und das Verständnis der untersuchten physiologischen Veränderungen oder Krankheit-Modelle sowie für Anwendungen in neuen Forschungsbereichen.

Atmungssystem Mechanik Messungen. Tabelle 4 zeigt typische Ergebnisse der naiven A / J-Mäuse an der Grundlinie und folgende Methacholin Bronchokonstriktion erhalten (12,5 mg / ml) mit einem der beiden flexiVent Generationen flexiWare 7-Software unterstützt. Mechanik der Atemwege, unter geschlossenen Bedingungen Brust dh wurden durch alternierende Störungen der Einzel-und Breitband-Frequenz erzwungene Schwingung Familien in einer Art und Weise eng beieinander (Schnappschuss-150, Quick-Prime-3, respectively) beurteilt. Seit Lüftung während der Messung, das Quick Prime-3, die einen ähnlichen Frequenzbereich abdeckt wie die Prime-8 angehalten wird, hat aber eine kürzere Dauer (3 vs 8 sec), wurde ausgewählt, um die Apnoe zu verkürzen, minimieren die Wirkung von die Störung auf Blutgase und bieten eine bessere Auflösung der Antwort. Parameter mit jeder Störung assoziiert wurden berechnet automatically durch die Betriebssoftware. Ergebnisse zeigen, dass die zwei Generationen der flexiVent System entspricht Messungen der Atemmechanik produziert. Site of Lunge Antwort. Unterscheiden Sie die Website von Lungen-Reaktion ermöglicht die Ermittler weiter zu lokalisieren betroffenen Regionen sowie um mögliche Punkte von 6 pharmakologische Intervention zu identifizieren. Zum Beispiel zeigen naiv A / J-Mäusen eine Erhöhung des Ausgangswertes Widerstand, wenn die endexspiratorischer Druck gegen die Messungen vorgenommen werden 3-9 cm H 2 O (6A, Schnappschuss-150) erhöht wird. In dem vorliegenden Beispiel wird, sofern die Verwendung von Breitband-FOT Messungen (Quick Prime-3) Informationen, die Basis für die Änderung des Widerstands verdeutlichen: Die Veränderung der endexpiratorischen Druck zu einer Abnahme in den Atemwegen Widerstand (R N), die mit der bronchodilatatorische Auswirkungen einer höheren Lungenvolumen und die größere Inflation drückenure (6D) und eine Zunahme der Dämpfung Gewebe (G, Fig. 6E), ein Parameter eng Widerstand des Gewebes, das Gewebe Viskoelastizität und möglicherweise den Widerstand der kleinen Atemwege 7 reflektiert verwandt. Letzteres ist bekannt, dass mit zunehmendem Lungenvolumen zu erhöhen. Atemwegshyperreaktivität. Nach Chlorgas Belichtung, Atemwege Reaktionsfähigkeit auf inhalierte Methacholin steigt auf Luftaussetzzeiten in Balb / c-Mäusen als Folge der Atemwege Schaden 4 (Abbildung 2). Chlor ist bekannt, oxidativen Stress zu induzieren, was zu einer Zerstörung der strukturellen Zellen in den Atemwegen, insbesondere Epithelzellen und Induzieren Rekrutierung von Entzündungszellen. Wie in 5 dargestellt, können Änderungen in den Parametern, die Atmungsorgane Mechanik in Reaktion auf die zunehmende methacholine Herausforderungen gesehen werden. Im Vergleich zu Luft ausgesetzten Mäuse, Mäuse chlori ausgesetztNe-Gas angezeigt größer Maximalreaktionen auf allen FOT Parameter (5A, 5B, 5D bis 5F) sowie eine statistisch signifikante Linksverschiebung der Konzentrations-Wirkungs-Kurve, die durch eine Verringerung der Konzentration von Methacholin erforderlich, um eine Verdopplung des Widerstandes verursachen beispielhaft und Elastanz (PC 200; 5C). Diese Ergebnisse zeigen jeweils Atemwegshyperreaktivität und Überempfindlichkeit gegenüber inhalativen Methacholin nach Exposition gegenüber Chlorgas. Andere Messungen. Neben BAV kann die flexiVent System auch verwendet werden, um andere Arten von Lungenfunktion 8-10 oder Herz-Kreislauf-11-Messungen sammeln. Fig. 7 zeigt eine repräsentative stufenweise Druck-gesteuerte Druck-Volumen-Kurve in naiven A / J-Mäusen unter Baseline-Bedingungen . Der obere Abschnitt der Deflation Schenkel der Kurve der Salazar-Knowles Gleichung 12 zu passen </<html> sup&gt; und Parameter werden automatisch von der Software berechnet. <img src="/files/ftp_upload/50172/50172table1.jpg" alt="Tabelle 1" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172table1highres.jpg" fo:content-width="6in" /> Tabelle 1. Beispiele für Anästhesie Regimen in Mäusen verwendet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172table1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um größere Tabelle anzuzeigen</a> . <img src="/files/ftp_upload/50172/50172table2.jpg" alt="Tabelle 2" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172table2highres.jpg" fo:content-width="5in" /> Tabelle 2. Perturbations für Lungenfunktion Messungen in Mäusen verwendet. * Erweiterung erforderlich ist, um das System. Gegenstand muss auch in einem geschlossenen Plethysmographen Kammer während der Messung sein.Lank &quot;&gt; Klicken Sie hier, um größere Tabelle anzuzeigen. <img src="/files/ftp_upload/50172/50172table3.jpg" alt="Tabelle 3" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172table3highres.jpg" fo:content-width="6in" /> Tabelle 3. Beispiel der exportierten Parameter aus den Einzel-und Breitband-Frequenz erzwungene Schwingung Störung Familien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172table3large.jpg" target="_blank">Klicke hier, um eine größere Tabelle anzuzeigen</a> . <img src="/files/ftp_upload/50172/50172table4.jpg" alt="Tabelle 4" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172table4highres.jpg" fo:content-width="6in" /> Tabelle 4. Systemvergleich. Vergleich Lungenmechanik Parameter gesammelt mit den beiden Generationen der flexiVent System flexiWare 7-Software betrieben. Die Ergebnisse wurden in naiven A / J-Mäusen (n = 5 erzeugt /<html> Gruppe) an der Grundlinie und folgende Methacholin Bronchokonstriktion (Mch 12,5 mg / ml). * Gruppen wurden mit Hilfe eines Zwei-Wege-ANOVA für wiederholte Messungen und das Protokoll 10 der individuellen Antworten auf Homogenität der Varianzen (GraphPad Prism, Version 5.03, GraphPad Software, San Diego, USA). <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig1.jpg" alt="Abbildung 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig1highres.jpg"/> Abbildung 1. Screenshot einer tiefen Lunge Inflation. Das obere Feld zeigt das Volumen durch den Kolben des Beatmungsgerätes (rote Kurve) und dem Volumen geliefert mit dem Thema (graue Kurve) verschoben wird. Das untere Feld zeigt den Zylinderdruck ansteigend auf einen eingestellten Druck von 30 cm H 2 O über einen Zeitraum von 3 Sekunden gehalten, zur gleichen Zeit konstant. 172/50172fig2.jpg &quot;alt =&quot; 2 &quot;/&gt; Abbildung 2. Beispiel einer typischen Skript verwendet die Atmungsorgane Mechanik an der Grundlinie zu beurteilen. <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Spontane Atemanstrengungen während der Ausführung einer schrittweisen Druck-Volumen-Kurve. <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig4.jpg" alt="Fig. 4" fo:content-width="2.6in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig4highres.jpg"/> Abbildung 4. Zeit-Verlauf Antwort folgende Erhöhung der inhalierten Methacholin Herausforderungen. Ergebnisse sind als Mittelwert (± Standardabweichung) von einer Gruppe von 5 naiv spontan hyperresponsive A / J-Mäusen ausgedrückt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . &lt;p class = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig5.jpg" alt="Abbildung 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig5highres.jpg"/> Abbildung 5. Änderungen in Atmungsorgane Mechanik nach Erhöhung Methacholin Herausforderungen in Chlor-und Luft-exponierten Balb / c Mäusen. Höchstwert war für jeden Parameter in jedem Fach und experimentelle Bedingung identifiziert. Gruppe Durchschnittswerte wurden dann berechnet (Mittelwert ± Standardabweichung, n = 4-6). Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch Analyse der Varianz mit der log 10 von individuellen Reaktionen auf Homogenität der Varianzen beurteilt. Die Konzentration methacholine Herstellung einer Verdoppelung des Ausgangswertes (PC 200) wurde durch den Einbau eines Polynoms zweiter Ordnung, um individuelle Dosis-Wirkungs-Kurven und Interpolation der angepassten Kurve erhalten. Datenpunkte werden in D fehlt, E und F in der Chlor-exponierten Mäusenbei den beiden höchsten Konzentrationen Methacholin durch nicht ausreichend hohen Bestimmtheitsmaßen was eine schlechte Passform des mathematischen Modells auf die Daten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172fig5large.jpg" target="_blank">Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig6.jpg" alt="Abbildung 6" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig6highres.jpg"/> Abbildung 6. Partitionieren der Atemwege Antwort in Atemwege und Lungengewebe Mechanik. Experimental Spur von einem naiven A / J-Mäusen veranschaulicht einzigen (2,5 Hz) und Breitband (1-20.5Hz) Frequenz erzwungene Schwingung Messungen der Atemmechanik in dreifacher Ausfertigung an zwei verschiedenen endexspiratorischer Drücke (3 &amp; 9 cm H 2 O). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172fig6large.jpg" target="_blank">Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> </a&gt;. <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig7.jpg" alt="Abbildung 7" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig7highres.jpg"/> Abbildung 7. Druck-Volumen-Kurve in naiven A / J-Mäusen unter Ausgangsbedingungen. Druck-Volumen-Kurven wurden mit einer schrittweisen Druck-driven Störung (PV-P), um sicherzustellen, dass jeder Mauslungen dem gleichen Druck aufgepumpt wurden, unabhängig von ihrem Zustand. Salazar-Knowles Gleichung Parameter von einzelnen Druck-Volumen-Kurven extrahiert wurden gemittelt und in einer Tabelle Format. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 6) angegeben.

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Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique

Das vorliegende Protokoll bietet eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Beschreibung der Verfahren erforderlich, um Messungen der Atmungsorgane Mechanik sowie die Beurteilung der Atemwege Reaktionsfähigkeit auf inhalierte Methacholin bei Mäusen mit der erzwungenen Schwingung Technik (flexiVent auszuführen; SCIREQ Inc, Montreal, QC , Kanada).

Auswertung der Atemwege Mechanik in Mäuse mit den Forced Oscillation Technique

The  forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational  tool permitting the experimental assessment of lung function in mice ...

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Research

JoVE Journal

Biology

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Serie: Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

Auswertung der räumlichen Verteilung der γH2AX folgenden ionisierender Strahlung

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Forschung

Biologie

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not only ensure faithful genome duplication in the face of endogenous and exogenous DNA damage but also prevent genomic instability, a recognized causative factor in tumor development.
Here, we describe a simple and cost-effective fluorescence microscopy-based method to visualize DNA replication in the avian B-cell line DT40. This cell line provides a powerful tool to investigate protein function in vivo by reverse genetics in vertebrate cells1. DNA fiber fluorography in DT40 cells lacking a specific gene allows one to elucidate the function of this gene product in DNA replication and genome stability. Traditional methods to analyze replication fork dynamics in vertebrate cells rely on measuring the overall rate of DNA synthesis in a population of pulse-labeled cells. This is a quantitative approach and does not allow for qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis. In contrast, the rate of movement of active forks can be followed directly when using the DNA fiber technique2-4. In this approach, nascent DNA is labeled in vivo by incorporation of halogenated nucleotides (Fig 1A). Subsequently, individual fibers are stretched onto a microscope slide, and the labeled DNA replication tracts are stained with specific antibodies and visualized by fluorescence microscopy (Fig 1B). Initiation of replication as well as fork directionality is determined by the consecutive use of two differently modified analogues. Furthermore, the dual-labeling approach allows for quantitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase, i.e. replication structures such as ongoing and stalled forks, replication origin density as well as fork terminations. Finally, the experimental procedure can be accomplished within a day, and requires only general laboratory equipment and a fluorescence microscope.

DT40, a model vertebrate genetic system, provides a powerful tool to analyze protein function. Here we describe a simple method that allows qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase in DT40 cells at the single molecule level.

Visualisierung der DNA-Replikation in den Wirbeltier-Modellsystem DT40 mit der DNA Fiber-Technik

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

Visualisierung von Caenorhabditis elegans Cuticle Strukturen mit der lipophilen Vital Dye, DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

Do-It-Yourself Einrichtung zur Rückgewinnung von kryokonservierten Proben versehentlich fallengelassen in Kryo-Lagerbehälter

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Ein High-Throughput-Verfahren zur Messung der glomerulären Filtrationsrate in Conscious Mäuse

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measuring Respiratory Function in Mice Using Unrestrained Whole-body Plethysmography

Respiratory dysfunction is one of the leading causes of morbidity and mortality in the world and the rates of mortality continue to rise. Quantitative assessment of lung function in rodent models is an important tool in the development of future therapies. Commonly used techniques for assessing respiratory function including invasive plethysmography and forced oscillation. While these techniques provide valuable information, data collection can be fraught with artefacts and experimental variability due to the need for anesthesia and/or invasive instrumentation of the animal. In contrast, unrestrained whole-body plethysmography (UWBP) offers a precise, non-invasive, quantitative way by which to analyze respiratory parameters. This technique avoids the use of anesthesia and restraints, which is common to traditional plethysmography techniques. This video will demonstrate the UWBP procedure including the equipment set up, calibration and lung function recording. It will explain how to analyze the collected data, as well as identify experimental outliers and artefacts that results from animal movement. The respiratory parameters obtained using this technique include tidal volume, minute volume, inspiratory duty cycle, inspiratory flow rate and the ratio of inspiration time to expiration time. UWBP does not rely on specialized skills and is inexpensive to perform. A key feature of UWBP, and most appealing to potential users, is the ability to perform repeated measures of lung function on the same animal.

The assessment of respiratory physiology has traditionally relied upon techniques, which require restraint or sedation of the animal. Unrestrained whole-body plethysmography, however, provides precise, non-invasive, quantitative analysis of respiratory physiology in animal models. In addition, the technique allows repeated respiratory assessment of mice allowing for longitudinal studies.

Messatemfunktion im Maus Mit Hemmungslose Ganzkörper-Plethysmographie

Respiratory dysfunction is one of the leading causes of morbidity and mortality in the world and the rates of mortality continue to rise. Quantitative ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Eine neue Technik zur quantitativen Analyse von Haarausfall in Mäuse mit Graustufen-Analyse

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

Die Maus isoliert perfundierten Nieren-Technik

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Induction of Right Ventricular Failure by Pulmonary Artery Constriction and Evaluation of Right Ventricular Function in Mice

The mechanism of right ventricular failure (RVF) requires clarification due to the uniqueness, high morbidity, high mortality, and refractory nature of RVF. Previous rat models imitating RVF progression have been described. Compared with rats, mice are more accessible, economical, and widely used in animal experiments. We developed a pulmonary artery constriction (PAC) approach which is comprised of banding the pulmonary trunk in mice to induce right ventricular (RV) hypertrophy. A special surgical latch needle was designed that allows for easier separation of the aorta and the pulmonary trunk. In our experiments, the use of this fabricated latch needle reduced the risk of arteriorrhexis and improved the surgical success rate to 90%. We used different padding needle diameters to precisely create quantitative constriction, which can induce different degrees of RV hypertrophy. We quantified the degree of constriction by evaluating the blood flow velocity of the PA, which was measured by noninvasive transthoracic echocardiography. RV function was precisely evaluated by right heart catheterization at 8 weeks after surgery. The surgical instruments made inhouse were composed of common materials using a simple process that is easy to master. Therefore, the PAC approach described here is easy to imitate using instruments made in the lab and can be widely used in other labs. This study presents a modified PAC approach that has a higher success rate than other models and an 8-week postsurgery survival rate of 97.8%. This PAC approach provides a useful technique for studying the mechanism of RVF and will enable an increased understanding of RVF.

Here, we provide a useful approach for studying the mechanism of right ventricular failure. A more convenient and efficient approach to pulmonary artery constriction is established using surgical instruments made inhouse. In addition, methods to evaluate the quality of this approach by echocardiography and catheterization are provided.

Induktion des rechtsventrikulären Versagens durch Lungenarterienverengung und Bewertung der rechten ventrikulären Funktion bei Mäusen

The mechanism of right ventricular failure (RVF) requires clarification due to the uniqueness, high morbidity, high mortality, and refractory nature of ...