Diese Arbeit wurde vom NIH Grant HL093196 (RCR) und den Atlanta Research and Education Foundation (AREF) unterstützt.

I. Sensibilisierung und Allergen-Challenge (siehe Abbildung 1) A. Für Intratracheale Herausforderung <ol><li> Für die anfängliche Sensibilisierung, injizieren männliche oder weibliche C57BL / 6 oder BALB / c Mäuse (6-8 Wochen alt) intraperitoneal an Tag 0 und wieder am Tag 7 mit 20 ug Ovalbumin (OVA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) emulgiert in 0,2 ml steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), enthaltend 2 mg Aluminiumhydroxid (Sigma-Aldrich) oder mit 2 mg Aluminiumhydroxid in 0,2 ml steriler PBS als Kontrolle. </li><li> Herausforderung mit Antigen gegebenenfalls (z. B. an den Tagen 14, 16, 18 und 20). Challenge-Verfahren folgt. </li><li> Anesthetize Maus mit einer intraperitonealen (ip) Injektion einer Mischung aus Ketamin (90 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg). Stellen Sie sicher, die Maus ist voll narkotisiert für mindestens 10 min. </li><li> Betätigungsfläche Winkel von 45 Grad oder mehr. Bewegen Sie die Maus auf dieser Oberfläche zu halten Bauchseite nach oben und den Kopf oben. </li><li> Haken thread unter vorderen Schneidezähnen an den Kopf nach hinten halten. Stufe die Pfoten miteinander, um sicherzustellen, der Luftröhre ist gerade und verwenden Etikettenband zu den Beinen halten. Weichen Sie Operationsstelle mit 70% EtOH und Tupfer. </li><li> Anwenden Bupivacain (0,1 bis 0,2 ml 0,25% ige Lösung) topisch an der Einschnittstelle. </li><li> Nip Haut an der Kehle mit einer Pinzette und ziehen Sie vorsichtig nach außen. Machen Sie einen kleinen vertikalen Schnitt mit Scheren. Minimieren Größe des Einschnitts. </li><li> Bereiten Sie eine 1 ml Spritze mit 50 ul PBS oder 0,1% OVA in PBS und legen Sie sie in einem sich wiederholenden Pipette (Tridak Stepper, Torrington, CT). Nehmen Sie die Pipette in der einen Hand und mit der anderen, um das Gewebe zurückhalten mit der Pinzette und setzen die Luftröhre. </li><li> Halten Sie die Spritze als parallel zur Luftröhre wie möglich, legen Nadel durch Tracheawand und injizieren Sie die Lösung. </li><li> Pflegen Maus in einer vertikalen Ausrichtung nach der Injektion zu Zeit zur Herstellung einer in der Lunge absetzen können. </li><li> Sanft und steril nahe Wundgebiet mitPinzette und Dichtung mit Naht. </li><li> Bewegen Sie die Maus Brustbein-down auf einem Heizkissen und lassen Sie es bis zur vollständigen ambulanten erholen. Nach der Erholung, kehren die Maus in die Tierstation und überwachen sie täglich auf Anzeichen von Serom, Entzündung oder Infektion, und Wunddehiszenz, bis die Wunde vollständig verheilt ist. </li></ol> B. Für die Herausforderung durch Vernebelung <ol><li> Sensibilisieren Mäusen am Tag 0 durch intraperitoneale Injektion von 20 ug OVA (Sigma-Aldrich) in 0,2 ml steriler PBS, enthaltend 2 mg Aluminiumhydroxid (Sigma-Aldrich) oder mit 2 mg Aluminiumhydroxid in 0,2 ml steriler PBS emulgiert als Kontrolle . </li><li> Am Tag 14 zu erhöhen Sensibilisierung durch ip-Injektion, wie oben beschrieben. </li><li> Am 21., 22., 23., 24. und 25. Tag nach der anfänglichen Sensibilisierung, Mäuse Herausforderung durch die Exposition für 30 min bis 1% vernebelten OVA oder PBS allein über einen Ultraschall-Vernebler (Buxco Research Systems, Wilmi geliefertngton, NC). </li><li> Ort Mäuse in der Hauptkammer des WBP, akklimatisieren sie innerhalb der Plethysmographie Kammer für mindestens 10 min. </li><li> Platz 1 ml 0,1% OVA in sterilem PBS oder sterilem PBS allein, wie in den Schritten 4-6 beschrieben, über einen Vernebler Tasse. Inhalationsgerät für 30 min. </li><li> Entfernen und entsorgen Verneblerbecher verbleibende Lösung. </li><li> Vernebelung kann bei den Mäusen gleichzeitig unter Verwendung eines Zerstäubungs Kammer durchgeführt werden. </li></ol> II. Bestimmung der Atemwegshyperreaktivität zu Methacholin A. Nicht invasive Messung der Überempfindlichkeit der Atemwege durch Ganzkörper-Plethysmographie (WBP; Buxco Research Systems, Wilmington, NC) <ol><li> Lassen Sie das pulverisierte Methacholin Flasche auf Raumtemperatur aufwärmen vor dem Öffnen (Methacholin ist sehr hygroskopisch und wird nutzlos, Klumpen zu bilden, wenn erlaubt, Wasser zu absorbieren). Bereiten Sie eine 200 mg / ml Stammlösung in sterilem PBS, dann machen serielle 2-fache Verdünnungen (zB 100, 50, 25, 12,5 und 60,25 mg / ml). Halten Lösungen kalt. </li><li> Richten Sie Geräte wie folgt: connect Haupteinlass der WBP zu Vernebler, Bias-Flow Einlass zum Luftpumpe, und WBP Steckdose zu Gasfalle mit eng anliegenden Gummischlauch. Bringen Sie Druckaufnehmer, um die Ausgänge der Haupt-und Referenz-Kammern des WBP zu überbrücken. Schließen Sie Druckwandler Vorverstärker mit den mitgelieferten Kabel, und verbinden Vorverstärker an den PC unter Verwendung spezifischer Daten-Übernahme-Karte. </li><li> Kalibrieren Sie den Vorverstärker mit Hilfe der Software gemäß den Empfehlungen des Herstellers. </li><li> Ort Mäuse in der Hauptkammer des WBP, akklimatisieren sie innerhalb der Plethysmographie Kammer für mindestens 10 min, dann Rekord Grundlinie Lesungen (Penhbase) für 3 min. </li><li> Platz 1 ml steriler PBS in der Verneblerbecher. Vernebeln für 2 min und dann überwachen respiratorischen Variablen für einen zusätzlichen 6 min während der Trocknungsphase. Entfernen und entsorgen Verneblerbecher alle verbleibenden PBS. </li><li> Platz 1 ml 6,25 mg / ml in der Methacholin Verneblerbecher und rEPEAT Vernebelung für 2 Minuten plus einer 6-Minuten-Monitoring-Zyklus. </li><li> Wiederholen Sie die Messung mit 12,5, 25, 50 und 100 mg / ml Methacholin, mit dem gleichen 2-min-Periode Vernebelung und 6-Minuten-Monitoring-Zyklus. </li><li> Entfernen Sie die Mäuse aus den Kammern auf und schickt sie in ihre Käfige. </li><li> Refill Verneblerbecher mit 1 ml sterilem PBS und führen Sie eine weitere Sequenz, um den Schlauch zu spülen. </li><li> Beenden Sie die Luftströme, zerlegen, reinigen und wischen alle Kammern, bevor Sie einen zweiten Satz von Tieren. </li></ol> B. invasive Messung der Atemwegsempfindlichkeit durch Computer-gesteuerte Ventilator (flexiVent; SCIREQ Inc., Montreal, Kanada) <ol><li> Wiegen Sie die Maus und betäuben durch intraperitoneale (ip) Injektion von 60 mg pro kg Körpergewicht Pentobarbital-Natrium. </li><li> Im Anschluss an eine adäquate Anästhesie, Position die Mäuse ventro-dorsal zur Tracheotomie. </li><li> Desinfizieren Sie die Haut des Halses mit 70% Ethanol. Anwenden Bupivacain (0,1 bis 0,2 ml 0,25% ige Lösung) topisch an der incision Website. Einschneiden und öffnen Sie die Haut des Halses. Trennen Sie die Nackenmuskulatur und setzen die Luftröhre. </li><li> Machen Sie eine 1 - bis 2-mm-Schnitt in der Luftröhre mit einer feinen Schere (nicht sicher sein, um die Luftröhre zu durchtrennen) und stecken Sie den Trachealtubus vorsichtig. Binden Sie eine Naht um die Luftröhre, um eine Undichtigkeit zu verhindern. </li><li> Legen Sie die Maus in die Bodyplethysmographen Kammer und schließen Sie das eingefügt Trachealtubus mit dem Beatmungsgerät. </li><li> Starten mechanischen Beatmung. Festlegen geeigneter Atemfrequenz und Gezeiten / Hubvolumen (150 Hübe / min und 200 ul bzw. für eine 20-g-Maus). Achten Sie darauf, dass der Brustkorb wird synchron bewegt sich mit dem Beatmungsgerät. Wenn die Maus &quot;kämpfen&quot; wird mit dem Ventilator (Selbst-Atmung), injizieren mehr Betäubung und warten Sie für die Synchronisation. </li><li> Nach Baseline-Messungen, halten Mäuse unter Baseline-Belüftung für eine weitere 3 min, und von dort aus 2 nd der Impedanzmessungen gesetzt. Diese 2 nd der Baseline-Messungen eingestellt ist, dass Calc verwendetulate Der durchschnittliche Ausgangswert Werte. </li><li> Deliver PBS oder Methacholin (MCH) Herausforderungen (6,25, 12,5, 25, 50 und 100 mg / ml) durch die Kanalisierung inspiratorischen Flow aus dem Ventilator durch einen Ultraschall-Vernebler. </li><li> Im Anschluss an jede Herausforderung mit MCH (6,25, 12,5, 25, 50 und 100 mg / ml), Rückkehr in den Kolben, um die Bereitstellung einer VT von 10 ml / kg bei 120 Atemzüge / min und nehmen Impedanzmessungen. </li></ol> III. Die Messung der zellulären Infiltration in den Luftraum A. Führen Sie bronchoalveolären Lavage (BAL) <ol><li> Nach der Messung der AHR, einschläfern Mäuse mit CO 2, und positionieren Sie jede Maus auf dem Rücken auf dem OP-Pad. </li><li> Weichen Sie den Bereich mit 70% EtOH. </li><li> Beginnend am unteren Abdomen, schnitt den Bauchraum und zu entfernen Haut / obere Muskel, hangaufwärts in Richtung der Rippen. </li><li> Sobald die Rippen sichtbar sind, mit einer Schere vorsichtig die Membran durchstechen. Lungen sollte verdecken von der Membran weg. Seien Sie besonders ca.umsichtig nicht auf nick die Lunge oder Herz. </li><li> Schneiden Sie den Brustkorb, um die Lunge vollständig freizulegen / Herz (Schneiden zu vermeiden, keine größeren Blutgefäße, um Blut aus Füllen der Stelle zu halten). </li><li> Mit einer 1 ml Spritze mit einer 27 Gauge-Nadel (BD Spritzen, Franklin Lakes, NJ), durchstechen die Herzkammern und langsam und vorsichtig nach hinten ziehen Sie die Spritze, um das Blut zu sammeln. Darauf achten, dass das Herz kollabiert. </li><li> Sammeln Sie das Serum aus diesem Blut unter Verwendung von Standard-Protokoll. Lagerung bei -70 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Schneiden Sie Haut und Gewebe aus der Kehle, bis die Luftröhre wird enthüllt. Räumen Sie ausreichend Gewebe zu leicht arbeiten innerhalb des Feldes (wieder, vermeiden Schneiden keine größeren Blutgefäße). </li><li> Mit einer gebogenen Schere, unter der Luftröhre geschnitten, um einen Pfad zu löschen. </li><li> Führen Sie die Spitze einer gebogenen Pinzette unter der Luftröhre und fassen Sie das Ende von einem Stück Faden. Zeichnen Sie den Faden unter der Luftröhre. </li><li> Binden Sie einen lockeren halben Knoten über der Luftröhre, geringer in der Kehle. </li><li> CarefUlly schnitt eine Kerbe, in ausreichender Größe für die Kanüle, über dem Faden. </li><li> Setzen Sie vorsichtig die Kanüle in das Loch hinunter und die Luftröhre über den Punkt der Faden. Leicht nach vorne drücken, bis die Kanüle entsteht gerade am Eingang zu den Lungen (zu weit: Punktion Lungen; zu kurz: Zusammenbruch Luftröhre beim Versuch sich zu erholen BAL). </li><li> Ziehen Faden und Knoten, um komplette Luftröhre herum Kanüle zu versiegeln. </li><li> Lock-Spritze (1 ml PBS) an der Kanüle und vorsichtig auf die Flüssigkeit in der Lunge. Lungenlappen sollte individuell langsam aufzublasen. Nicht über-Füllung. Für einen ausgewachsenen Maus 0,9-1,0 ml ist das absolute Maximum. 0,8 ml sicherer sein kann. Lock Spritze lose an der Kanüle, sonst ist die Wahrscheinlichkeit eines Schadens bei dem Versuch, zu lösen. </li><li> Ziehen Flüssigkeit aus den Lungen. Wird ein Widerstand angetroffen (Gewebe in Kanüle gesaugt), drücken Kanüle langsam weiter in die Lunge und wieder entfernen. Ebenfalls um die Kanüle an Ort und Stelle. Wenn alle ELSe ausfällt, ziehen Sie die Kanüle einen Teil des Weges, der Luftröhre ist viel wahrscheinlicher, in diesem Fall zusammenbrechen. </li><li> Trennen Sie Spritze von der Kanüle, Kaution BAL-Flüssigkeit in Behälter, und wiederholen Sie 2 mal mit frischem PBS-Lösung. </li><li> Halten Sie die BAL-Lösung auf Eis, bis abzentrifugiert. </li><li> Verwenden Sie die BAL-Flüssigkeit und Serum, die OVA-spezifischen IgE mit kommerziell erhältlichen ELISA-Kits Maus-IgE (MD Bioproducts, St. Paul, MN) zu messen. </li></ol> B. Zählen von Zellen und Bestimmen Differenziale <ol><li> Zentrifugieren Sie die BAL-Flüssigkeit 5 min bei ~ 600 × g, 4 ° C </li><li> Das Zellpellet sanft in PBS und halten Sie auf dem Eis. </li><li> Legen Sie eine Standard-Neubauer Hämazytometer mit der verdünnten Zellsuspension und zählen die Zellen. </li><li> Entfernen Sie Aliquots von 2 × 10 4 Zellen in 10 bis 40 ul Volumen für Zytospins. Verdünnen Sie Zellen, wenn nötig. </li><li> Für Zytospins, mischen Sie 2 x 10 4 Zellen, 130 ul PBS und 10 ul FBS. Fügen gesamte Zelle Mischung zu double Zytospin Trichter und Zentrifuge 10 min bei 700 rpm, mit doppelseitigem cytoslides für Doppelproben. </li><li> Die Objektträger bei Raumtemperatur für 1 h vor dem Färben trocknen. </li><li> Stain Den Objektträger mit Hilfe Diff-Quick-Färbung (Siemens, Newark, DE). </li></ol> IV. Repräsentative Ergebnisse Übermäßige Verengung der Atemwege nach provokativen Reizen ist ein hervorstechendes Merkmal der klinischen Asthma. Wir beschreiben zwei Methoden zur Messung solcher Atemwegshyperreaktivität zu Methacholin in OVA-sensibilisierten und provozierten Mäusen: Ganzkörper-Plethysmographie (Abbildung 2) und erzwungenen Schwingung mit der flexiVent System (Abbildung 3). Beide Methoden zeigen, dass OVA Sensibilisierung und Herausforderung Atemwegshyperreaktivität in Mäusen erzeugt. Eosinophilen-reiche Entzündung der Atemwege ist ein weiteres hervorstechendes Merkmal der sowohl klinisch als Asthma und allergische Atemwegserkrankungen bei Mäusen. Wie in 4 gezeigt </strong&gt;, OVA Sensibilisierung und Herausforderung erhöht die Gesamtzahl der Zellen, die aus den Atemwegen von BAL wiederhergestellt werden können. Die Zahl der Eosinophilen und, in geringerem Umfang, sind insbesondere Neutrophilen erhöht. Es gibt Anzeichen dafür, dass allergische Atemwegserkrankung Ergebnisse aus Überproduktion von IgE-Antikörpern gegen sensibilisierende Antigene. Sensibilisierung und Herausforderung mit OVA unter Verwendung der Protokolle beschreiben wir IgE-Spiegel erhöht im Serum und BAL-Flüssigkeit der behandelten Mäuse (5). <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig1.jpg" /> Abbildung 1. Experimentelle Schema für OVA-induzierten allergischem Asthma. Die Mäuse wurden zweimal sensibilisiert ip mit 20 ug OVA in 2 mg Aluminiumhydroxid in 0,2 ml steriler PBS oder 2 mg Aluminiumhydroxid in 0,2 ml steriler PBS allein emulgiert, an der gefolgt angegebenen Zeitpunkten durch ihn herauszufordern mit 0,1% OVA oder sterile PBS-Lösung oder durch den täglichen Ex<html> Posure für 30 Minuten bis 1% zerstäubt OVA in PBS oder PBS alleine geliefert mittels eines Ultraschall-Vernebler (Buxco). Vierundzwanzig Stunden nach der letzten OVA Belichtung wurde Atemwegsempfindlichkeit bestimmt. Anschließend wurden BAL-Flüssigkeit, Blut-Proben, Lungenzellen, und Geweben zur weiteren Analyse gesammelt. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig2.jpg" /> Abbildung 2. Bewertung der Allergen-induzierte Atemwegshyperreaktivität durch eine nicht-invasives Verfahren. Mäuse (n = 4/group) sensibilisiert wurden und herausgefordert mit OVA. Vierundzwanzig Stunden nach der letzten Herausforderung, wurde Atemwegshyperreaktivität zu inhalativen Methacholin bestimmt mittels Ganzkörper-Plethysmographie wie im Protokoll beschrieben. Penh wurde bestimmt und als Penh Verhältnis (durchschnittliche Penh über den 8-min Zeitintervall mit Methacholin durch die durchschnittliche Penh über den 8-Minuten-Intervall mit PBS unterteilt). *, P &lt;0,05 vs PBS. iles/ftp_upload/3771/3771fig3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3. Beurteilung der Allergen-induzierte Atemwegshyperreaktivität durch ein invasives Verfahren (erzwungene Schwingung). Mäuse (n = 4/group) waren sensibilisierten und provozierten mit OVA. Vierundzwanzig Stunden nach der letzten Belastung wurde Atemwegshyperreaktivität steigenden Konzentrationen von inhaliertem Methacholin durch die erzwungene Schwingung (flexiVent) Verfahren wie im Protokoll beschrieben ist. A, B) Atemwegswiderstand, C) Lung Elastanz. *, P &lt;0,05 vs PBS. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig4.jpg" /> Abbildung 4. BAL-Flüssigkeit-Zellzahl. Mäuse (n = 4/group) waren sensibilisierten und provozierten mit OVA. Vierundzwanzig Stunden nach der letzten Herausforderung, (nach oben) BAL Zellen wurden gesammelt und insgesamt Zellen wurden gezählt, wie in der beschriebenen Protokoll. (Unten) Cytospin Folien waren prepariert und gefärbt mit Diff-Quick. TOT = Arbeitskosten insgesamt Zellen; Eos = Eosinophile; Neu = Neutrophile; Mac = Makrophagen, Lym = Lymphozyten. *, P &lt;0,05 vs PBS. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig5.jpg" /> Abbildung 5. OVA-spezifische IgE. Mäuse (n = 4/group) waren sensibilisierten und provozierten mit OVA. Vierundzwanzig Stunden nach der letzten Belastung wurde IgE in der BAL und in Serum aus dem Blut durch Herzpunktion gesammelt, wie im Protokoll beschrieben, gemessen. *, P &lt;0,05 vs PBS.

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Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch den Atlanta VAMC IACUC Ausschuss gemäß Protokoll # V010-10 gesetzt durchgeführt.

Tiermodelle der allergischen Atemwegserkrankungen stellen wichtige Werkzeuge für die klinische Studien relevant Asthma. Eine Reihe von verschiedenen Modellen, leicht variierenden Arten und Antigenen, entwickelt worden. Die Maus, eine attraktive und häufig genutzte Labor Arten, bietet auch eine Reihe von Vorteilen für die Modelle der allergischen Erkrankung der Atemwege. 9,10 Obwohl solche Modelle nicht nachahmen Asthma in jeder Hinsicht, 11 mit Aspekten der chronischen Erkrankung besonders schwe...

<table border="1"><tbody><tr><td> Material Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Ovalbumin </td><td> Sigma-Aldrich St. Louis, MO </td><td> A5503 </td><td></td></tr><tr><td> Aluminiumhydroxid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 239186 </td><td></td></tr><tr><td> Acetyl-β-Methylcholin Chlorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A2251 </td><td></td></tr><tr><td> Pentobarbital-Natrium-Salz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3761 </td><td></td></tr><tr><td> Die Ganzkörper-Plethysmographie (WBP) System </td><td> Buxco Research Systems Wilmington, NC </td><td></td><td> <a href="http://www.buxco.com" target="_blank">http://www.buxco.com</a> </td></tr><tr><td> FlexiVent </td><td>SCIREQ, Inc. Montreal, Kanada </td><td></td><td> <a href="http://www.scireq.com" target="_blank">http://www.scireq.com</a> </td></tr><tr><td> Lichtmikroskop </td><td> Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, Illinois </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cytospin 4 </td><td> Thermo Scientific Asheville, NC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diff-Quick Fleck </td><td> Siemens Newark, DE </td><td> B4132-1A </td><td></td></tr><tr><td> Mehrfachdispenser </td><td> Tridak Torrington, CT </td><td> STP4001-0025 </td><td></td></tr></tbody></table>

murine model of allergen induced asthma

Asthma ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität und betrifft rund 300 Millionen Menschen auf der ganzen Welt. 1 Mehr als 8% der US-Bevölkerung an Asthma erkrankt ist, mit der Prävalenz nimmt zu. 2 Wie bei anderen Erkrankungen, Tiermodellen der allergischen Atemwegserkrankung erheblich erleichtern Verständnis der zugrunde liegenden Pathophysiologie, zu identifizieren potentielle therapeutische Targets und lassen präklinische Testung von neuen Therapien möglich. Modelle der allergischen Atemwegserkrankung haben in mehreren Tierarten entwickelt worden, aber Mausmodellen sind besonders attraktiv aufgrund der geringen Kosten, die sofortige Verfügbarkeit, und gut charakterisierte Immunsystem dieser Tiere. 3 Verfügbarkeit einer Vielzahl von transgenen Linien weiter steigert die Attraktivität dieser Modelle. 4 Hier beschreiben wir zwei Mausmodellen der allergischen Atemwegserkrankungen, beide beschäftigen Ovalbumin als Antigen. Nach anfänglichen Sensibilisierung durch intraperitoneale Injektion, ein Modell Lief.ERS, die das Antigen Herausforderung durch Vernebelung, die andere durch intratracheale Lieferung. Diese beiden Modelle bieten komplementäre Vorteile, mit jeder imitiert die wichtigsten Funktionen des menschlichen Asthma. 5 Die wichtigsten Features von akuten Asthma zählen eine übertriebene Reaktion der Atemwege auf Reize wie Methacholin (Atemwegshyperreaktivität; AHR) und Eosinophilen-reiche Entzündung der Atemwege. Diese sind auch prominente Auswirkungen der Allergen-Provokation in unserem Mausmodell, 5,6, und wir beschreiben Techniken zur Messung und ihnen somit die Bewertung der Auswirkungen der experimentellen Manipulation. Insbesondere beschreiben wir sowohl invasive 7 und 8 nicht-invasive Techniken zur Messung Atemwegshyperreaktivität sowie Verfahren für die Beurteilung Infiltration von Entzündungszellen in die Atemwege und der Lunge. Airway Entzündungszellen werden von BAL gesammelt, während Lunge Histopathologie wird verwendet, um Marker für Entzündungen im ganzen Organ zu beurteilen. DieseTechniken bieten leistungsstarke Tools für die Untersuchung von Asthma bei einer Weise, die nicht beim Menschen möglich wäre.

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Murine Model of Allergen Induced Asthma

Experimentelle Mausmodellen von allergischem Asthma bieten neue Möglichkeiten zur Untersuchung von Krankheitsentstehung und die Entwicklung neuer Therapeutika. Diese Modelle sind gut, um Mess-Faktoren, die die allergische Immunantwort, Entzündung der Atemwege, Lungen-und Pathophysiologie geeignet.

Mausmodell von Allergen-induzierte Asthma

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

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40.0K Aufrufe.  Emory University and Atlanta VA Medical Center. Experimentelle Mausmodellen von allergischem Asthma bieten neue Möglichkeiten zur Untersuchung von Krankheitsentstehung und die Entwicklung neuer Therapeutika. Diese Modelle sind gut, um Mess-Faktoren, die die allergische Immunantwort, Entzündung der Atemwege, Lungen-und Pathophysiologie geeignet.

Serie: Murine Model of Allergen Induced Asthma

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

Mausmodell der CD40-Aktivierung von B-Zellen

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa induzierte Lungenschädigung-Modell

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

Ein Mausmodell der Gruppe B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

Durchflusszytometrische Analyse von partikelgebundenen Bet v 1 Allergens in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1&#946;, IL-6, IL-23, and TGF&#946;. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, ROR&#947;t, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

Kleine RNA Transfektion in primären humanen Th17-Zellen durch Next Generation Elektroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

Nicht-invasive Probenahme von Schleimhaut-Flüssigkeit für die Quantifizierung von In Vivo oberen Atemwegen immun-Mediator-Level

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, MZBs must migrate up the shear force of blood flow. We present here a method for analyzing this flow-induced MZB migration in vitro. First, MZBs are isolated from the mouse spleen. Second, MZBs are settled on integrin ligands in flow chamber slides, exposed to shear flow, and imaged under a microscope while migrating. Third, images of the migrating MZBs are processed using the MTrack2 automatic cell tracking plugin for ImageJ, and the resulting cell tracks are quantified using the Ibidi chemotaxis tool. The migration data reveal how fast the cells move, how often they change direction, whether the shear flow vector affects their migration direction, and which integrin ligands are involved. Although we use MZBs, the method can easily be adapted for analyzing migration of any leukocyte that responds to the force of shear flow.

Marginal zone B cells (MZBs) respond to the force of shear flow by re-orienting their migration path up the flow. This protocol shows how to record and analyze the migration using a fluidics unit, pump, microscope imaging system, and free software.

Analyse der Scherung strömungsinduzierte Migration der Murine Marginal Zone B-Zellen In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

A Murine Model of Dengue Virus-induced Acute Viral Encephalitis-like Disease

Dengue virus (DENV), an arthropod-borne virus transmitted by mosquitoes, may cause the severe disease known as dengue hemorrhagic fever, which is characterized by lethal complications due to plasma leakage, ascites, pleural effusion, respiratory distress, severe bleeding, and organ impairment. A few cases of DENV infection present neurological manifestations; however, studies have not explored DENV-induced neuropathogenesis further. In this study, we present a protocol to use an immunocompetent outbred ICR (Institute of Cancer Research) mouse for investigating the induction of central nervous system (CNS) infection with DENV, followed by the progression of acute viral encephalitis-like disease.

Here, we present a protocol for creating an immunocompetent ICR (Institute of Cancer Research) murine model of central nervous system infection to display the development of neuropathy. Monitoring acute viral encephalitic disorders by identical disease scores could be performed for showing dengue virus-induced neuropathy in vivo.

Ein murines Modell der Dengue-Virus-induzierten akuten viralen Enzephalitis-ähnlichen Krankheit

Dengue virus (DENV), an arthropod-borne virus transmitted by mosquitoes, may cause the severe disease known as dengue hemorrhagic fever, which is ...

Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically modified strains, the vast number of analyses that can be performed on harvested soft and hard tissues. However, many of these systems are subject to procedural criticisms. As an alternative, the ligature-induced model of periodontal disease, driven by the localized development and retention of a dysbiotic oral microbiome, can be employed, which is rapidly induced and relatively reliable. Unfortunately, the variants of ligature-induced murine periodontitis protocol are isolated to focal regions of the periodontium and subject to premature avulsion of the installed ligature. This minimizes the amount of tissue available for subsequent analyses and increases the number of animals required for study. This protocol describes the precise manipulations required to place extended molar ligatures with improved retention and usage of a novel rinse technique to recover oral neutrophils in mice with an alternative approach that mitigates the aforementioned technical challenges.

This article presents a protocol for establishing a ligature-induced model of murine periodontitis involving multiple maxillary molars, resulting in larger areas of the involved gingival tissue and bone for subsequent analysis as well as reduced animal usage. A technique to assess oral neutrophils in a manner analogous to human subjects is also described.

Robuste Ligatur-induzierte Modell der Murine Parodontitis für die Bewertung von oralen Neutrophilen

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically ...

Systematic Scoring Analysis for Intestinal Inflammation in a Murine Dextran Sodium Sulfate-Induced Colitis Model

Murine colitis models are tools that are extensively employed in studies focused on understanding the pathobiology of inflammatory intestinal disorders. However, robust standards for objective and reproducible quantification of disease severity remain to be defined. Most colitis analysis methods rely on limited histological scoring of small segments of intestine, leading to partial or biased analyses. Here, we combine high-resolution image acquisition and longitudinal analysis of the entire colon to quantify intestinal injury and ulceration in the dextran sodium sulfate (DSS) induced model of murine colitis. This protocol allows for the generation of objective and reproducible results without extensive user training. Here, we provide comprehensive details on sample preparation and image analysis using examples of data from DSS induced colitis. This method can be easily adapted to other models of murine colitis that have significant inflammation associated with mucosal injury. We demonstrate that the fraction of inflamed/injured and eroded/ulcerated mucosa relative to the complete length of the colon closely parallels clinical findings such as weight loss amid DSS-induced disease progression. This histological protocol provides a reliable time and cost-effective aid to standardize analyses of disease activity in an unbiased way in DSS colitis experiments.

Systematic scoring of intestinal inflammation using a free computer-assisted system is a powerful tool to quantitatively compare histopathological changes in colitis models characterized by the presence of ulcers and inflammatory changes. Histological colitis score evaluation strengthens clinical observations and facilitates data interpretation.

Systematische Scoring-Analyse für Darmentzündungen in einem Murine Dextran Natriumsulfat-induzierte Colitis Modell

Murine colitis models are tools that are extensively employed in studies focused on understanding the pathobiology of inflammatory intestinal disorders. ...