Wir danken Laurie Destroismaisons und Sarah Peyrard für hervorragende technische Unterstützung und Dr.Alexandre Prat für den Zugang zum Durchflusszytometer. Wir möchten auch Dr. Timothy Miller für seinen Beitrag anerkennen, in Bezug auf die Entfernung von Myelin von den Vorbereitungen. Diese Arbeit wurde von der kanadischen Institutes of Health Research (CIHR) Neuromuskuläre Forschung Partnerschaft, kanadischen Stiftung für Innovation, ALS Society of Canada, der Frick-Stiftung für ALS-Forschung, CHUM Stiftung und Fonds de la Recherche en Santé du Québec (CVV) unterstützt. Sowohl CVV und NA sind Forschung Gelehrten des Fonds de la Recherche en Santé du Québec und New CIHR Ermittler. SP wird von der Tim Noël Studentship von der ALS-Gesellschaft von Kanada unterstützt.

Tiere in dieser Studie verwendet wurden in strikter Übereinstimmung mit einem Protokoll (N08001CVsr), die vom Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l&#39;Université de Montréal (CRCHUM) Institutionelle Ausschuss für den Schutz der Tiere zugelassen, die nationalen Normen im Sinne der kanadischen skizziert folgt behandelt Rates über Animal Care (CCAC). Bereiten Sie alle erforderlich, um dieses Protokoll (Tabelle 1) durchführen Reagenzien. Alle anderen Details bezüglich Ausrüstung, Material und Lieferanten können in der Liste der Materialien gefunden werden. <img alt="Tabelle 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51887/51887table1.jpg" width="500" /> Tabelle 1. Pufferzusammensetzungen. 1. Erhebung von Rattenrückenmark <ol><li> Tief betäuben die Ratte (Sprague Dawley) mit 4% isoflorane. Stellen Sie sicher, Betäubung durch einen Mangel an Reflex auf Kneifen von the Vorderpfote. Euthanize die Ratte durch Enthauptung über Guillotine. Diese Methode der Euthanasie wird über andere, die das Rückenmark verzerren könnten bevorzugt. </li><li> Schneiden Sie die Haut am Rücken, die Wirbelsäule freizulegen. Schneiden Sie die Wirbelsäule mit Knochen Schere knapp über dem Beckenknochen. Visualisierung der Öffnung der Wirbelsäule. </li><li> Legen Sie eine 10 ml-Spritze mit einer Pipettenspitze 200 ul (durch Schmelzen leicht über Flamme angebracht), mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gefüllt ist, in der Wirbelsäule. </li><li> Ausspülen des Rückenmarks unter Anwendung einer mittleren Menge von Druck auf den Plunger. </li><li> Wenn kein Blut auf das Rückenmark vorhanden ist, mit PBS spülen, bevor Sie zum nächsten Schritt. Hinweis: Diese Methode ist auch für Gehirn und Leber validiert. Wenn auch diese Gewebe, sammeln die Hälfte des Gehirns von der Ratte getötet und ein Stück Leber gleich im Gewicht des Rückenmarks. Alle anderen Schritte bleiben gleich. </li></ol> 2. Isolierung von Spinal Cord Mitochondria (von Vande Velde et al Angepasst 4.) <ol><li> Sammeln Sie die ganze intakte Rückenmark und in 5 ml Glas-Homogenisator mit 5 Volumina (~ 3,25 ml) Homogenisationspuffer (HB). Für eine optimale Erholung der isolierten Mitochondrien, alle Schritte auf Eis oder in kalten Raum. Homogenisieren Gewebe von Hand, bis keine großen Stücke von Gewebe bleiben, etwa acht Schlägen. Platzieren Homogenat in zwei (2 ml) oder drei (1,7 ml)-Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifuge 1.300 × g für 10 min bei 4 ° C in einer Tischmikrozentrifuge. </li><li> Recover Überstand und in eine 5 ml Ultrazentrifugenröhrchen. Fügen Sie 750 ul (~ 0,5 Volumen) HB zum Pellet-haltigen Mikrozentrifugenröhrchen und sanft das Pellet. Wiederholen Sie die Schritte Zentrifugation und Resuspension zwei weitere Male. Pool alle Überstände (S1a und S1b) in der gleichen 5 ml Ultrazentrifugenröhrchen oben. Dieser Schritt dient dazu, kleine Fremdkörper zu entfernen. </li><li> Zentrifuge gebündelt S1 mit einer Ultrazentrifuge mit einem schwingenden Eimer rot ausgestattetoder und Zentrifuge bei 17.000 × g für 15 min bei 4 ° C ist. </li><li> Halten Überstand (S2) für die weitere Verarbeitung, wenn die cytosolische Fraktion von Interesse ist (beispielsweise für Western-Blot-Analyse). Das Pellet (P2), das rohe mitochondriale Fraktion, in 4 ml HB + 50 mM KCl. Zentrifuge 17.000 × g für 15 min bei 4 ° C in einem Schwingbecher-Rotor. Überstand verwerfen und das Pellet vorsichtig (P3) in 800 ul HB. HINWEIS: Die Mitochondrien sind mit HB + 50 mM KCl gewaschen, um alle nicht-spezifische mitochondrial-assoziierte Verunreinigungen zu entfernen. </li><li> In einer neuen 5 ml Ultrazentrifugenröhrchen, fügen Sie genau 800 ul des resuspendierten Pellets (P3). </li><li> Um dieses Rohr hinzuzufügen, 200 ul Iodixanol (Dichtegradienten-Medium), wodurch eine Endkonzentration von 12% Iodixanol schaffen. Mischen Sie den Inhalt des Rohres sanft, aber gründlich über Pipettieren mit einer P1000. Zugabe von Iodixanol zuerst, und dann resuspendiert Pellet (P3) kann bevorzugt sein, um ein gründliches Mischen zu erleichtern. Zentrifuge in einem ULTracentrifuge mit einem Schwingbecher-Rotor ausgestattet war, bei 17.000 × g für 15 min bei 4 ° C ist. </li><li> HINWEIS: Leber nicht Myelin enthalten und daher ist dieser Schritt nicht erforderlich, wenn nur die Leber verarbeitet wird. Allerdings, wenn Leber, die gleichzeitig mit ZNS-Mitochondrien verarbeitet wird, ist es empfehlenswert, alle Gewebe gleich zu behandeln. </li><li> Saugen Sie die Schicht von Myelin an der Spitze des Rohres und sorgfältig zu entfernen und den Überstand verwerfen. Pellet kann locker sein. Das Pellet in 4 ml HB. Zentrifuge wieder bei 17.000 × g für 10 min bei 4 ° C ist. Überstand verwerfen und das Pellet in 4 ml HB. Wiederholen Sie die Zentrifugation und Entfernen des Überstandes. </li><li> Resuspendieren endgültige Pellet (P7) in 100-200 ul HB und in ein 1,7 ml Reaktionsgefäß. Diese Probe enthält isolierte Mitochondrien. </li><li> Fahren Sie mit Proteinquantifizierung. Verdünnte Proben und der Standardkurve in 2% Natriumdodecylsulfat (SDS), um eine ausreichende Solubilisierung der Mitochondrien Duri gewährleistenng Protein-Quantifizierung. </li></ol> 3. Immunmarkierung von isolierten Mitochondrien für die Durchflusszytometrie <ol><li> Für jede zu testende Färbung Mix Pipette 25 ug der isolierten Mitochondrien in ein 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie eine ungefärbte Probe in jedem Experiment; und für jeden Antikörper, sicher sein, um eine Probe für die entsprechende Isotyp-Kontrolle umfassen. </li><li> Zentrifuge bei 17.000 × g für 2 min bei 4 ° C in einem Labor-Mikrozentrifuge. </li><li> Überstand entfernen und resuspendieren isolierten Mitochondrien in 50 ul Puffer Mitochondrien (M-Puffer) mit 10% fettsäurefrei BSA ergänzt für 15 min bei 4 ° C (Blockierungsschritt). HINWEIS: Während der Etikettierung, führen Inkubationen in einem Kühlschrank bei 4 ° C. </li><li> Fügen primären Antikörper (Kaninchen-Anti-Mfn2, 20 ug pro ml) Rohr und Inkubation für 30 min bei 4 ° C. HINWEIS: Bestimmen Sie die optimale Konzentration von jedem Antikörper empirisch durch Titration. Aufgrund der Variabilität der Konzentration und / oder purity, verschiedenen Chargen des gleichen Antikörper vom gleichen Hersteller kann zu unterschiedlichen Ergebnissen führen; Daher Titration wird für jede neue Charge von Antikörper benötigt. </li><li> Auswaschen ungebundenen primären Antikörper: Zentrifuge bei 17.000 g für 2 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand und sanft das Pellet in 200 ul M Buffer. Zentrifuge bei 17.000 × g für 2 min bei 4 ° C ist. Überstand entfernen und das Pellet in 50 ul M Buffer. </li><li> Fügen Sekundärantikörper (Esel Anti-Kaninchen-IgG-Phycoerythrin (PE), 0,5 g pro ml) Rohr und Inkubation Proben für 30 min bei 4 ° C, vor Licht geschützt. </li><li> Auswaschen ungebundenen Sekundärantikörper: Zentrifuge bei 17.000 g für 2 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand und das Pellet in 200 ul M Buffer. Zentrifuge bei 17.000 × g für 2 min bei 4 ° C ist. Überstand entfernen und das Pellet in 500 ul M Buffer. </li><li> Um sicherzustellen, dass Ereignisse sind in der Tat Mitochondrien, Flecken isolierten Mitochondrien mit einMitochondrien spezifischen Fluoreszenzfarbstoff für 15 min bei RT, vor Licht geschützt. Wenn Färbung von anderen Funktionsparameter (mitochondrialen Transmembranpotentials oder Superoxid-Produktion) gewünscht wird, gehen Sie zu Schritt 4. Wenn nicht, fahren Sie mit Schritt 5 für den Erwerb. HINWEIS: Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass das Emissionsspektrum des sekundären Antikörpers ist, dass mit der funktionellen Farbstoffe kompatibel. Wenn beispielsweise die Überprüfung der mitochondrialen Reinheit mit einem kommerziellen Farbstoff mit einer spektralen Eigenschaften ähnlich FITC und Transmembranpotential mit Tetramethylrhodamin Methylester (TMRM) würde eine brauchbare sekundäre Antikörper werden Allophycocyanin (APC: Ex 650 nm / Em 660 nm). Hinzufügen Kompensationen steuert, dh eine Probe immun oder mit einem einzigen Fluorophor, falls gefärbt. </li><li> Übertragen auf eine für Lade Durchflusszytometer Rohr. (Zur Erleichterung der geringen Stichprobengröße, eine Mikrotiterplatte Rohr innerhalb 3 platziert ml Durchflusszytometer Rohr fließen.) Halten Proben auf Eis und gehen sofort aufDurchflusszytometer für Erwerb. </li></ol> 4. Assaying Mitochondriale Transmembranpotentials und der mitochondrialen Superoxid-Produktion mittels Durchflusszytometrie <ol><li> Stellen Sie sicher, dass isolierte Mitochondrien haben eine intakte Transmembranpotential durch Färbung mit 100 nM TMRM (Ex 548 nm / Em 574 nm) 5, in Schritt 3.8, 15 min bei RT, vor Licht geschützt. Zum Vergleich der Transmembranpotential zwischen den Proben und Populationen, die Verwendung von niedrigeren / Nichtlöschkonzentrationen TMRM (1 bis 30 nM), kann es sinn 6 sein. <ol><li> Als Kontrolle für TMRM Färbung, Fleck isolierten Mitochondrien mit 100 nM TMRM in Gegenwart von 100 uM Carbonylcyanid m-Chlor Phenylhydrazin (CCCP), einem mitochondrialen Entkoppler, die Mitochondrien depolarisiert wird. Die Konzentration von CCCP erforderlich, um die Mitochondrien depolarisieren kann geringer sein, wenn niedrigere Konzentrationen von Farbstoff verwendet werden. </li></ol></li><li> Stellen Sie sicher, dass isolierte Mitochondrien produzieren mitochondrialen Superoxid von staining mit einem geeigneten mitochondrialen Superoxid-Indikator 7, auch in Schritt 3.8, 15 min bei RT, vor Licht geschützt. <ol><li> Als Kontrolle für mitochondrialen Superoxid-Produktion, Flecken isolierten Mitochondrien mit dem Farbstoff in Gegenwart von 10 uM Antimycin A, einem Inhibitor der Komplex III der mitochondrialen Atmungskette, die Superoxid-Produktion zu erhöhen wird. </li></ol></li></ol> 5. Aufnahme und Analyse von immun isolierten Mitochondrien durch Durchflusszytometrie <ol><li> Instrument geschaffen werden: Schalterspannungen von linear auf Protokollmodus auf die Analyse von isolierten Mitochondrien und stellen Spannungen zu erleichtern (FSC: 450; SSC: 250). Stellen Sie sicher, dass die Ereignisse in FSC-A (Bereich)-Modus als auch FSC-W (Breite) und FSC-H (Höhe) gesammelt, um Dubletten (dh auszuschließen, zwei Ereignisse, die durch den Detektor zur gleichen Zeit ) in der Analyse nach der Datenerhebung. Stellen Sie die Anzahl der Ereignisse, bis zu 100.000 gesammelt werden. Erwerben Entschädigung Kontrollen, Falls zutreffend. </li><li> Datenerfassung: Vor der Datenerfassung, zu vermeiden Vortexen Proben. Stattdessen mischen durch leichtes Antippen Röhre. Zunächst sammeln Ereignisse bei niedrigem Druck, während Gating. Tor an der Gesamtbevölkerung. Einzustellen Spannungen Histogramme entsprechend üblicherweise die Spitze der ungefärbten Probe in die zweite Dekade (10 2) entsprechen. Sobald Gates hergestellt und Proben verarbeitet werden, kann der Druck zu hoch geschaltet werden. </li><li> Analyse: Visualisieren Dubletten durch Auftragen von FSC-W gegenüber FSC. Slips und Dubletten zu identifizieren. Tor auf Slips. Wählen Sie das mitochondriale Bevölkerung durch Gating auf Ereignisse, die positiv mit einer mitochondrialen selektiven Farbstoff angefärbt werden. </li><li> Bestimmung von Hintergrund Kennzeichnung von Isotypenkontrolle. Verwendung der Isotyp-Kontrolle der Proben der Prozentanteil der Bevölkerung mitochondrialen Markierung positiv Mfn2 Antikörper. </li></ol>

<ol>
	<li>Itoh, K., Nakamura, K., Iijima, M., Sesaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics+in+neurodegeneration.">Mitochondrial dynamics in neurodegeneration.</a> Trends Cell Biol. 23, 64-71 (2013).</li><li>Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkin+is+recruited+selectively+to+impaired+mitochondria+and+promotes+their+autophagy.">Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy.</a> J Cell Biol. 183, 795-803 (2008).</li><li>Zorov, D. B., Kobrinsky, E., Juhaszova, M., Sollott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+intracellular+organelle+function+using+fluorescent+probes:+from+animalcules+to+quantum+dots.">Examining intracellular organelle function using fluorescent probes: from animalcules to quantum dots.</a> Circ Res. 95, 239-252 (2004).</li><li>Vande Velde, C., Miller, T., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria.">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4022-4027 (2008).</li><li>Loew, L. M., Tuft, R. A., Carrington, W., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+five+dimensions:+time-dependent+membrane+potentials+in+individual+mitochondria.">Imaging in five dimensions: time-dependent membrane potentials in individual mitochondria.</a> Biophys J. 65, 2396-2407 (1993).</li><li>Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+probes+and+the+proton+gradient:+a+practical+usage+guide.">Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide.</a> Biotechniques. 50, 98-115 (2011).</li><li>Xu, X., Arriaga, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+determination+of+superoxide+release+at+both+sides+of+the+mitochondrial+inner+membrane+by+capillary+electrophoretic+analysis+of+the+oxidation+products+of+triphenylphosphonium+hydroethidine.">Qualitative determination of superoxide release at both sides of the mitochondrial inner membrane by capillary electrophoretic analysis of the oxidation products of triphenylphosphonium hydroethidine.</a> Free Radic Biol Med. 46, 905-913 (2009).</li><li>Otera, H., Ishihara, N., Mihara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+function+and+regulation+of+mitochondrial+fission.">New insights into the function and regulation of mitochondrial fission.</a> Biochim Biophys Acta. 1833, 1256-1268 (2013).</li><li>de Brito, O. M., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitofusin+2+tethers+endoplasmic+reticulum+to+mitochondria.">Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria.</a> Nature. 456, 605-610 (2008).</li><li>Wikstrom, J. D., Twig, G., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+can+mitochondrial+heterogeneity+tell+us+about+mitochondrial+dynamics+and+autophagy.">What can mitochondrial heterogeneity tell us about mitochondrial dynamics and autophagy.</a> Int J Biochem Cell Biol. 41, 1914-1927 (2009).</li><li>Pickles, S., Destroismaisons, L., Peyrard, S. L., Cadot, S., Rouleau, G. A., Brown, R. H., Julien, J. P., Arbour, N., Vande Velde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+damage+revealed+by+immunoselection+for+ALS-linked+misfolded+SOD1.">Mitochondrial damage revealed by immunoselection for ALS-linked misfolded SOD1.</a> Hum Mol Genet. 22, 3947-3959 (2013).</li><li>Frank, S., Gaume, B., Bergmann-Leitner, E. S., Leitner, W. W., Robert, E. G., Catez, F., Smith, C. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dynamin-related+protein+1,+a+mediator+of+mitochondrial+fission,+in+apoptosis.">The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis.</a> Dev Cell. 1, 515-525 (2001).</li><li>West, A. P., Brodsky, I. E., Rahner, C., Woo, D. K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Walsh, M. C., Choi, Y., Shadel, G. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS.">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li><li>Abad, M. F., Di Benedetto, G., Magalh&#227;es, P. J., Filippin, L., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+pH+monitored+by+a+new+engineered+green+fluorescent+protein+mutant.">Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant.</a> J Biol Chem. 279, 11521-11529 (2004).</li><li>Murphy, A. N., Bredesen, D., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria.">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9893-9898 (1996).</li><li>Tantama, M., Martinez-Fran&#231;ois, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+energy+status+in+live+cells+with+a+fluorescent+biosensor+of+the+intracellular+ATP-to-ADP+ratio.">Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio.</a> Nat Commun. 4, 2550 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Es wird immer offensichtlicher, dass die Mitochondrien spielen eine Schlüsselrolle sowohl in der normalen Physiologie und Krankheit. Während Immunoblotting kann feststellen, welche Proteine ​​in Mitochondrien oder an der Oberfläche der Mitochondrien in einem bestimmten Zustand zu finden sind, diese Methode berichtet über dem Durchschnitt der Gesamtbevölkerung. Diese Methode kann nicht liefern Informationen zu relativen Häufigkeiten der mitochondrialen Subpopulationen oder Teilmengen. Während es zuvor angenomm...

Mitochondrien sind Organellen, die hochdynamische mehrere Runden von Spaltung und Kernfusion unterzogen werden, sind auf Seiten der hohen Energiebedarf transportiert und reagieren schnell auf Reize physiologischen 1. Da es zunehmend in verschiedenen Geweben erkannt, dass die Mitochondrien, auch unterschiedlichen zellulären Kompartimenten, haben unterschiedliche Funktionsprofile, neue Methoden benötigt werden, um diese verschiedenen mitochondrialen Untergruppen zu identifizieren. Mikroskopie liefert ein Mittel, wodurch einzelne Mitochondrien sichtbar gemacht werden und die Anwesenheit eines Proteins an oder in Mitochondrien kann durch Immunfluoreszenz-2 bestimmt werden. Quantitative Analyse nach diesem Verfahren ist jedoch arbeitsintensiv und eignet sich besser für Experimente mit immortalisierten Zelllinien oder primäre. Das Studium der einzelnen Mitochondrien aus Gewebe abgeleitet ist deutlich schwieriger und die meisten Methoden nicht für eine einfache Identifizierung der mitochondrialen Untergruppen gleichzeitig mit der Evalu ermöglichenation der mitochondrialen Funktion 3. Um diese Hürde, ein neues Verfahren zu Mitochondrien aus Nagetier Gewebe isoliert und anschließend mittels Durchflusszytometrie analysiert immunolabel Adresse entwickelt. Dies ermöglicht den schnellen Nachweis und die Quantifizierung von Proteinen an der äußeren Mitochondrienmembran, die einer Analyse durch Mikroskopie verglichen lokalisiert ist viel weniger arbeitsintensiv und erlaubt die Analyse von Tausenden von Mitochondrien in einer einzigen Probe. Dieser Test kann angewendet werden, um das Schicksal und die relative Menge der mitochondrialen Außenmembran-Proteine, die Gedanken zu sein konstitutiv an der Mitochondrien zu überwachen, die Rekrutierung von Proteinen an der Oberfläche der Mitochondrien oder die Detektion von Proteinen in die Mitochondrien in pathologischen Bedingungen mislocalized. Außerdem ist die Einarbeitung von herkömmlichen fluoreszierenden Indikatorfarbstoffen erlaubt die gleichzeitige Auswertung von bestimmten Aspekten der mitochondrialen Funktion in verschiedene mitochondrialeSubpopulationen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1276">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:349px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:543px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">Rats</td>
			<td style="width:349px;">Charles River</td>
			<td style="width:119px;">Strain code 400</td>
			<td style="width:543px;">Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Dounce homogenizer</td>
			<td style="width:349px;">Kontes Glass Co.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">885450-0022</td>
			<td>Duall 22</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:349px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sorvall Legend Micro 17 R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Ulara-Clear Ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:349px;">Beckman Coultier</td>
			<td style="width:119px;">344057</td>
			<td>Transparent, thin walled&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Sorvall Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:349px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sorvall WX UltraSeries</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">AH-650 rotor and buckets&#160;&#160;</td>
			<td style="width:349px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:267px;">Opti-prep</td>
			<td style="width:349px;">Axis-Shield</td>
			<td style="width:119px;">1114542</td>
			<td>Iodixanol, density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Fatty acid free Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:349px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8806</td>
			<td>Must be fatty acid free for mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Sodium succinate dibasic hexahydrate&#160;&#160;</td>
			<td style="width:349px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:267px;">Rabbit anti-Mitofusin2 antibody</td>
			<td style="width:349px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M6319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:267px;">Rabbit IgG</td>
			<td style="width:349px;">Jackson Immuno Research&#160;</td>
			<td style="width:119px;">011-000-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Anti-Rabbit IgG PE</td>
			<td style="width:349px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">12-4739-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Micro titer tube</td>
			<td style="width:349px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">223-9391</td>
			<td>For sample acquisition by flow cytometry&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">MitoTrackerGreen (MTG)</td>
			<td style="width:349px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">M7514</td>
			<td>100 nM: Ex490 nm/Em516 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">TMRM</td>
			<td style="width:349px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">T668</td>
			<td>100 nM: Ex548 nm/Em574 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">CCCP</td>
			<td style="width:349px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">MitoSOX Red</td>
			<td style="width:349px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">M36008</td>
			<td>5 &#181;M: Ex540 nm/Em600 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:349px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">LSR II flow cytometer</td>
			<td style="width:349px;">BD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">BS FACSDiva Software</td>
			<td style="width:349px;">BD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">FlowJo</td>
			<td style="width:349px;">TreeStar Inc.&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software used for analysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">BCA protein assay kit&#160;&#160;</td>
			<td style="width:349px;">Pierce/Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23225</td>
			<td style="width:543px;">Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunodetection of outer membrane proteins by flow cytometry of isolated mitochondria

Methoden zur Erkennung und Überwachung der mitochondrialen Außenmembran Protein-Komponenten in tierischen Geweben sind entscheidend für mitochondriale Physiologie und Pathophysiologie zu studieren. Dieses Protokoll beschreibt eine Technik, bei der Mitochondrien aus Gewebe isoliert werden Nagetier immun und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Mitochondrien werden von Nagetieren Rückenmark isoliert und zu einem schnellen Anreicherungsschritt unterzogen, Myelin, eine Hauptverunreinigung der mitochondrialen Fraktionen aus Nervengewebe vorbereitet zu entfernen. Isolierten Mitochondrien werden dann mit einem Antikörper, der Auswahl und einen fluoreszenz konjugierten sekundären Antikörper markiert. Analyse durch Durchflusszytometrie verifiziert die relative Reinheit der mitochondrialen Präparationen durch Anfärben mit einem Farbstoff spezifische mitochondriale, gefolgt von der Detektion und Quantifizierung von immunmarkierten Proteins. Diese Technik ist schnell, quantitativ und mit hohem Durchsatz, so dass für die Analyse von Hunderten von Tausenden von Mitochondrien pro Probe. Sie ist anwendbar auf Roman S. zu bewertenroteins auf mitochondrialer Oberfläche unter normalen physiologischen Bedingungen als auch die Proteine, die während der Pathologie mislocalized dieser Organellen werden kann. Wichtig ist, dass dieses Verfahren auf Fluoreszenzindikatorfarbstoffen gekoppelt werden, um für bestimmte Aktivitäten des mitochondrialen Subpopulationen melden und machbar für Mitochondrien aus dem zentralen Nervensystem (Gehirn und Rückenmark) sowie Leber.

Mitochondrien aus Rattenrückenmark abgeleitet ist, mit einem Antikörper zu Mitofusin2 (Mfn2), ein Protein in der Fusion der äußeren Membran der Mitochondrien 8 gebracht gezielt immun werden. Nach der Isolierung und Markierung mit einem Mfn2 spezifischen Antikörpers und eines fluoreszenz konjugierten sekundären Antikörper, Mitochondrien durch Durchflusszytometrie (Figur 1) verarbeitet. Nach der Datenerfassung werden die Proben mittels Durchflusszytometrie-Analyse-Software, indem Sie zue...

Watch this Scientific Journal Video about Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria at JoVE.com

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Beschrieben wird hier ein Verfahren zur Detektion und Quantifizierung der mitochondrialen Außenmembran-Proteine ​​durch Immunmarkierung von Mitochondrien aus Nagetiergewebe und Analyse durch Durchflusszytometrie Strom isoliert. Diese Methode kann erweitert werden, um funktionale Aspekte der mitochondrialen Subpopulationen zu bewerten.

Immundetektion von Außenmembranproteinen mittels Durchflusszytometrie von isolierten Mitochondrien

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

immunodetection-outer-membrane-proteins-flow-cytometry-isolated

Research

JoVE Journal

Biology

15.4K Aufrufe.  Université de Montréal, CRCHUM.  Beschrieben wird hier ein Verfahren zur Detektion und Quantifizierung der mitochondrialen Außenmembran-Proteine ​​durch Immunmarkierung von Mitochondrien aus Nagetiergewebe und Analyse durch Durchflusszytometrie Strom isoliert. Diese Methode kann erweitert werden, um funktionale Aspekte der mitochondrialen Subpopulationen zu bewerten. 

Serie: Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP-FCM: Immunpräzipitation mittels Durchflusszytometrie Detected

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Forschung

Biologie

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Quantitative Messung der GLUT4 Translokation an die Plasmamembran mittels Durchflusszytometrie

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Durchflusszytometrie Reinigung der Maus meiotischen Zellen

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Einsatz eines Roboters für High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Ernte-und Cryo-Kühlung Kristalle von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen zur Strukturaufklärung von Makromolekulare Kristallographie Grown

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Multi-Parameter-Messung der Durchlässigkeit Transition Pore Opening in isolierten Maus-Mitochondrien

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimiert Färbung und Proliferation Modeling-Methoden für die Zellteilung Überwachung mit Cell-Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Cytosolischen Calcium Messungen in Nierenepithelzellen mittels Durchflusszytometrie

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found responsible for very diverse diseases, ranging from neurological pathologies to cancer. Interestingly, mitochondria have recently been shown to display the capacity to be transferred between cell types, notably from human mesenchymal stem cells (MSC) to cancer cells in coculture conditions, with metabolic and functional consequences for the mitochondria recipient cells, further enhancing the current interest for the biological properties of these organelles.
Evaluating the effects of the transferred MSC mitochondria in the target cells is of primary importance to understand the biological outcome of such cell-cell interactions. The MitoCeption protocol described here allows the transfer of the mitochondria isolated beforehand from the donor cells to the target cells, using MSC mitochondria and glioblastoma stem cells (GSC) as a model system. This protocol has previously been used to transfer mitochondria, isolated from MSCs, to adherent MDA-MB-231 cancer cells. This mitochondria transfer protocol is adapted here for GSCs that present the specific particularity of growing as neurospheres in vitro. The transfer of the isolated mitochondria can be followed by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and confocal imaging using mitochondria vital dyes. The use of mitochondria donor and target cells with distinct haplotypes (SNPs) also allows detection of the transferred mitochondria based on the concentration of their circular mitochondrial DNA (mtDNA) in the target cells. Once the protocol has been validated with these criteria, the cells harboring the transferred mitochondria can be further analyzed to determine the effects of the exogenous mitochondria on biological properties such as cell metabolism, plasticity, proliferation and response to therapy.

Here, a protocol (MitoCeption) is presented to transfer mitochondria, isolated from human mesenchymal stem cells (MSC), to glioblastoma stem cells (GSC), with the goal of studying their biological effects on GSC metabolism and functions. A similar protocol can be adapted to transfer mitochondria between other cell types.

MitoCeption: Übertragen von isolierten humanen MSC Mitochondrien an Glioblastom Stammzellen

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Analyse von Zellsuspensionen isoliert von festen Geweben von Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...