The authors would like to acknowledge the Netherlands Organization for Scientific Research (NWO, grant 17.106.329)

Tierversuche wurden von der Tierschutzausschusses des Leiden University Medical Center (LUMC) zugelassen. 1. Herstellung der Zellen, Instrumente und Mäuse <ol><li> Einen Tag vor der Operation, rasieren die NOD / SCID-gamma (NSG) Mäuse aus dem vierten Brustwarze bis zur Mittellinie und wiegen die Mäuse, um zu überprüfen, dass alle Mäuse haben in etwa vergleichbar Gewichte. </li><li> Autoklavieren eine Schere, zwei Pinzetten und zwei gerade Moskito Pinzette (Abbildung 1A). </li><li> Am Tag der Operation, wäscht den menschlichen Brustadenokarzinom (MDA-MB-231-Zellen), die einmal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) injiziert wird, pH 7,4 und trypsinize die Zellen. Quenche die Trypsin durch Zugabe von 10 ml Serum enthaltendem DMEM-Medium auf die Oberseite der Zellen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1200 rpm für 7 Minuten bei Raumtemperatur, um das Serum durch Resuspendieren der Zellen entweder in PBS oder in Medium ohne Serum zu entfernen. Zentrifugieren wieder um Spuren von Serum vollständig zu entfernen. Resuspendieren der Zellen in PBS oderMedien. </li><li> Zähle die Zellen mit einem Hämozytometer und berechnet die Menge von Zellen. Verwenden 500.000 Zellen / Maus in nicht mehr als 150 &amp; mgr; l. Optional zu PBS oder Medien, die Zellen werden in Matrigel. HINWEIS: Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen in Abhängigkeit von der verwendeten Zelltyp. </li><li> Zeigen Zellen in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen und halten sie auf Eis. </li><li> Füllen einer 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen mit 35 ml PBS pH 7.4 und einem weiteren 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen mit 70% Ethanol. Genießen Wattestäbchen in jedes Röhrchen. </li></ol> 2. Orthotopische Injection <ol><li> Führen Sie die Operation in einer sterilen Haube, um eine sterile Atmosphäre zu erhalten. Anesthetize die Maus durch subkutane Injektion von Xylazin / Ketamin-Mischung bei einer Dosis von 10 mg / kg, 100 mg / kg Körpergewicht auf. Befestigen Sie die Maus auf einem Heizkissen. Bestätigen den Erfolg der Anästhesie durch den Mangel an Reaktion auf Zehe Prise. HINWEIS: Wenn man nicht sehr vertraut mit chirurgischen Eingriffen, kann eine Operation länger dauern. Vereinbarendie Anästhesie Dosis entsprechend. </li><li> Anwenden Augensalbe für die Augen von Mäusen, um die Augen vor dem Austrocknen zu schützen. </li><li> Reinigen Sie die rasierte Fläche mit der Wattestäbchen in Ethanol in Schritt 1.6 vorbereitet getaucht. Wechselnde Peelings mit Betadin und Alkohol dreimal im Kreis dreht weg von der geplanten Einschnittstelle durchgeführt werden. Alternativ Ionophor verwendet als Desinfektionsmittel. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt zwischen dem vierten Brustwarze und der Mittellinie mit einer Schere und eine Tasche, indem Sie das Wattestäbchen mit PBS, pH 7,4, befeuchtet. </li><li> Verwenden Sie eine Pinzette, um das Brustfettpolster aus. Beachten Sie die Fettpolster durch ihre weiße Farbe. </li><li> Drücken Sie die Fettpolster mit der anderen Pinzette von ihrer Basis; durch diese Weise voll setzen die Fettpolster (1B), um Injektionen leicht durchführen. </li><li> Homogenisieren des Zellgemisch durch Auf- und Abpipettieren. Vorsichtig aspirieren 50 ul der Zellsuspension in einem Insulin Spritze aufgezogen und indas Brustfettpolster, indem Sie die Nadel horizontal. Bestätigen erfolgreiche Injektion, indem Sie für Schwellungen der Fettpolster. </li><li> Lassen Sie die Fettpolster sanft. </li><li> Naht der Einschnitt unter Verwendung einer Nadeltreiber. Make drei Würfe durch Drehen des Fadens um den Nadeltreiber im Uhrzeigersinn, gegen den Uhrzeigersinn und im Uhrzeigersinn. Zwei Knoten pro Naht verwendet werden. HINWEIS: Sicherstellen, dass die Äste dicht sind anders Mäusen eröffnen können die Nähte. </li><li> Nach der Operation injiziert ein Analgetikum, wie Temgesic bei 0,05-0,1 mg / kg Körpergewicht subkutan, um die Schmerzen zu lindern. </li><li> Die Tiere nicht unbeaufsichtigt lassen, bis sie das Bewusstsein gewinnen und zu erhalten sternalen recumbence. Zeigen alle Tiere in verschiedenen Käfigen, bis sie vollständig wiederhergestellt werden. </li><li> Um die Sterilität zu gewährleisten, verwenden autoklaviertem Käfigen und Wasser. Ändern Sie die Käfige alle drei Tage, um die Atmosphäre zu reinigen. </li></ol> 3. Organraub für Analysis <ol><li> An derTag der Ernte, 8 Wochen nach der Implantation der Zellen zu füllen 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen mit 3 ml Bouin-Lösung für jede Maus. Darüber hinaus verwenden Sie zwei 15-ml-Röhrchen mit 5 ml Formalin-Lösung pro Maus gefüllt. </li><li> Betäuben der Tiere durch Injektion von Xylazin / Ketamin, bei einer Dosis von 10 mg / kg, 100 mg / kg Körpergewicht subkutan. Warten Sie, bis das Tier verliert toe Prise Rückzug Reflex. </li><li> Befestigen Sie das Tier mit Nadeln auf einem Sockel. Machen Sie einen langen, vertikalen Mittelschnitt mit einer Schere. Machen Sie zwei horizontale Schnitte direkt unter dem Vorderbein und über dem hinteren Bein. Setzen Sie den Tumor durch Pinning die Haut an der Basis. Messen des Tumorvolumens mit Hilfe einer Schieblehre. </li><li> Distanzieren, den Tumor von der Haut mit einer Schere. Schnellfrost einen Teil des Tumors in flüssigem Stickstoff für die RNA-Isolierung. Legen Sie das andere Teil, in den konischen Zentrifugenröhrchen mit Formalin gefüllten Immunhistochemie folgenden Paraffineinbettung durchzuführen. </li><li> Vorsichtig nehmen Sie in die Lunge. Platzieren Sie dielinke Lunge in Bouin-Lösung. Halten Sie die Lunge in Lösung für 3 Tage. Beachten oberflächliche Metastasenherde deutlich mit bloßem Auge. Wahlweise legen Sie die rechte Lunge in Formalin auf Mikrometastasen mit Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) Färbung zu überprüfen. Hinweis: Obwohl, Lungenmetastasen häufig bei Brustkrebs beobachtet, könnte man auch wünschen Knochen, Leber, Hirn und Milz sammeln, um Metastasen zu analysieren. Die Zellen an der metastatischen Bereich dichter und morphologisch verschieden sind und daher leicht von Lungengewebe zu unterscheiden. </li><li> Einen Tag nach der Ernte, saugen Sie den Formalin-Lösung von 15 ml-Röhrchen und ersetzen mit 70% Ethanol. Betten Sie das Gewebe in Paraffin und führen Immunhistochemie Studien. </li><li> Für Blutanalyse, die Öffnung des Brustkorbes mit einer Schere. Ziehen Sie 450 ul Blut über Herzpunktion. Platzieren Blutprobe in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das 50 &amp; mgr; l 3,2% Natriumcitrat. Nach dem Blut gesammelt, drehen Sie es bei 2.000 × g für 10 kmn. Speichern die Plasmaproben bei -20 ° C bis zur weiteren Verwendung. HINWEIS: Es gibt mehrere andere Blutentnahme Techniken, die üblicherweise in der Praxis 20 verwendet, und die Technik, die verwendet werden muss, hängt von Versuchsaufbau und Wahl Wissenschaftlers. Wenn Blutprobe nicht erforderlich ist, das Tier einzuschläfern gemäß der Tier Protokoll oder gemäß den Richtlinien Institution. </li></ol>

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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+tissue+factor+signaling+suppresses+tumor+growth.">Inhibition of tissue factor signaling suppresses tumor growth.</a> Blood. 111 (1), 190-199 (2008).</li><li>Wagner, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+breast+cancer:+quo+vadis,+animal+modeling?.">Models of breast cancer: quo vadis, animal modeling?.</a> Breast Cancer Res. 6 (1), 31-38 (2004).</li><li>Weigelt, B., Peterse, J. L., van't Veer, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+metastasis:+markers+and+models.">Breast cancer metastasis: markers and models.</a> Nat. Rev. Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Orthotopische Injektion von Brustkrebszellen ist ein leistungsfähiges Modell, alle Aspekte der Krebswachstum zu studieren. Implantation der Zellen in den Brustfettpolster der Mäuse sollte sorgfältig ausgewählt, um Variation in das Tumorwachstum zu verhindern durchgeführt werden. Am wichtigsten ist, ist entscheidend Injektion der gleichen Menge von Zellen jeder Maus. Um dies zu tun, sollte man die Zellen trypsinieren konsequent, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen. Nicht lebensfähigen Zellen sollten bei der Zellz?...

Krebs ist eine sehr komplexe Krankheit, die seit über Jahrhunderte zogen worden Studien. Brustkrebs ist die häufigste Krebsart; sie tritt vorwiegend bei Frauen, kann aber vereinzelt auch bei Männern 27 auftreten. Die Erkrankung wird hauptsächlich durch den Verlust der Kontrolle der Zellteilung Verfahren gesteuert, die wiederum führt zu einer unendlichen Wachstum von Zellen im Körper verursacht. Diese Störungen können durch verschiedene Mechanismen verursacht werden: Zunächst müssen die gesunden Zellen Wachstumssignale aus den umliegenden Zellen, um sich zu vermehren, während Krebszellen ihre eigenen Wachstumsfaktoren und erhöhen die Expression von Wachstumsfaktor-Rezeptoren somit eine höhere Proliferationsrate 1 erhalten wird; zweitens sind die Krebszellen weniger anfällig für anti-proliferative Signale 8; drittens, um die Anzahl der Zellen im Körper Zelltod ist auch erforderlich, auszugleichen; aber Krebszellen Flucht aus den programmierten Zelltod, die Apoptose bezeichnet 14; vierten, Zellen an extrazelluläre Matrix haftenUm zu überleben, aber Tumorzellen ohne die Notwendigkeit von Befestigungs wachsen und zeigen Beständigkeit gegen anoikis 19; fünften, Aktivierung der Telomerase umgeht die Verkürzung der Telomere und verhindert die replikative Seneszenz 21; nicht zuletzt, das Überspringen von DNA-Qualitätskontrolle nach der Mitose resultiert eine neue genetische Inhalt 15,16. Um Onkogenen oder Tumorsuppressoren, die eine Rolle in dieser deregulierten Proliferation spielen zu identifizieren, sind Tumorwachstum Experimenten an Mäusen entscheidend. Primäre Tumorwachstum ist im allgemeinen nicht der Hauptgrund für den Tod. Migration von Krebszellen aus dem Primärstandort zu einer sekundären Seite, bezeichnet als Metastasen ist die häufigste Todesursache in den meisten Krebspatienten 22. Metastasen bringt Tumorzellinvasion, intravasation, sich durch den Kreislauf vermieden Immunangriff, Extravasation und das Wachstum an der Sekundärstation. Epithelial zu mesenchymale Transition (EMT) ist ein Schlüsselprozess inMetastasierung und beinhaltet einen Schalter in Genexpressionsprofile ergeben Zellen mit höheren Motilität und Invasivität, die Voraussetzungen für die metastasierenden Zelle 12 sind. Denn Krebsprozesses ist die Resultierende aus einer Kombination von verschiedenen Maßnahmen, einschließlich der gegenseitigen Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen, Stromazellen und pro- und anti-inflammatorischen Zellen, ein in vitro Ansatz zur Krebs verleiht häufig keinen vollständigen Einblick in die Krebsprozess. Ähnlich Krebsbehandlungen beeinflussen die Tumorvaskulatur oft nicht in vitro untersucht werden, wodurch die Verwendung von in vivo-Ansätzen ist unvermeidlich. Um Brustkrebs Progression zu studieren, wurden verschiedene experimentelle Methoden entwickelt. Das am häufigsten verwendete Modell ist die subkutane Injektion von Brustkrebszellen in Mäuse 5. In diesem Versuchsaufbau kann der Forscher eine Vielzahl von Änderungen an einer Zelllinie der Wahl in vitro eingeführt (dhHochregulierung, die Herunterregulierung von Proteinen) und injizieren die Zellen unter die Haut. Dieses Verfahren ist zwar einfach und der Einspritzvorgang ist einfach, ohne dass eine Operation an den Mäusen durchgeführt, wird die Stelle, an der der Tumor injiziert nicht die lokale Mammatumorumgebung und das Fehlen dieser Umwelt darstellen kann in der Entwicklung von Brustkrebs Ergebnis, dass unterscheidet sich von dem in der menschlichen Pathologie beobachtet. Zweitens werden gentechnisch veränderte Mäuse häufig als in vivo Werkzeug Brustkrebsprogression Studie verwendet. In diesem Modell wird Onkogen (dh PyMT, Neu) Expression von einem Brustgewebe spezifischen Promotor, der zur Bildung von spontanen Brusttumor s angetrieben. Diese Versuchsanordnung ist nützlich, um die Behandlung Aspekt der Krankheit, die durch Injektion von Medikamenten oder Antikörper während der Überprüfung der Tumorgröße in der Zeit 3 studieren. Allerdings Zucht dieser Mäuse mit anderen Mausstämme mangelhaft oder in einem Gen von Interesse kann auch geben Ins mutiertights in die Rolle von verschiedenen Proteinen in Brusttumorwachstum 24. Der Nachteil dieses Modells ist, dass es anfällig für Schwankungen der Tumorgröße und Anzahl ist. Außerdem ist das Niveau der Expression des Transgens hängt von der Integrationsstelle im Genom und können von einem Mausstamm auf einen anderen 4 ändern. In diesem Modell kann die Expression des Transgens durch alle Zellen mit epithelialem Ursprung erreicht werden, während bei menschlichen Krankheiten, nur eine Subpopulation der Zellen das Onkogen oder herunterregulieren Tumorsuppressor Ebenen 26. Um Metastasen studieren kann Brustkrebszellen auch intravenös injiziert werden (ein Modell bezeichnet experimentelle Metastasierung) 25. Dieser Ansatz rekapituliert nur die metastatischen Prozess teilweise; er umgeht das Erfordernis für die Tumorzellen eindringen und intravasate und beginnt ab dem Punkt, an dem die Tumorzellen leicht in dem Blutkreislauf vor. In unserer Arbeit verwenden wir eine orthotope spritzenIonen-Modell, um die Beteiligung der Gene von Interesse bei Brustkrebs Progression 13 zu studieren. Wir überexprimieren das Protein in menschlichen Brustkrebszellen und injizieren sie in das Brustfettpolster von NOD / SCID gamma (NSG) Mäusen. Dieses Verfahren ist vorteilhaft in vielerlei Hinsicht: Sie ermöglicht sehr schnelle und vielfältige genetische Veränderungen in der injizierten Zelllinie deckt es den gesamten Prozess von Brustkrebs Progression von Primärtumorwachstum zur Metastasierung bei pathologisch relevanten Websites, und es bietet auch eine gute Versuchsmodell zur Untersuchung der Wirkung von therapeutischen Behandlungen zu frühen oder späten Stadien der Erkrankung. Zusätzlich unter Verwendung dieses Modells kann man die Rolle der Stromazellen gegen Krebszellen stammenden Proteinen in den Krankheitsverlauf unter Verwendung gentechnisch veränderten Mäusen oder Zellen zu untersuchen. Obwohl subkutane Injektionen sind einfacher durchzuführen, geben orthotope Modellen aber zu einer tumorigenen und metastatischen Krebszellpopulation. Somit wird mittels der subkutanen Injektion erhaltenen Ergebnisses kann entweder falsch-negative oder falsch-positive 6,17 Förderung der Verwendung von orthotopen Modelle, die das Tumorwachstum zu studieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1093">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:185px;">Name of material/equipment</td>
			<td style="width:172px;">Company</td>
			<td style="width:95px;">Catalog number</td>
			<td style="width:641px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Bouin&#39;s solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT10132</td>
			<td>Used for investigating the metastasis on lungs</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Formalin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td>Used to fix the tissues</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Matrigel, growth factor reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Cells can be resuspended in matrigel for injection</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Mosquito forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13008-12</td>
			<td>Used for stiching</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Angled forceps</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>72991-4c</td>
			<td>These make the exposure of mammary fat pad easier</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Scissors</td>
			<td>B Braun Medicals</td>
			<td>BC056R</td>
			<td>Used to cut open the mice</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Straight forceps</td>
			<td>B Braun Medicals</td>
			<td>BD025R</td>
			<td>This is used to open up the skin to expose mammary fat pad</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NOD scid gamma mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>005557</td>
			<td>Experimental animal used for experiment</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MDA-MB-231</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92020424</td>
			<td>Experimental cells used for injections</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Oculentum simplex</td>
			<td>Teva Pharmachemie</td>
			<td></td>
			<td>Opthalmic ointment used to prevent drying out of eyes</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Betadine</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>19-898-859</td>
			<td>Ionophore, used to disinfect the surgical area</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Xylazin/Ketamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X1251, K2753</td>
			<td>Use injected anesthesia as 10mg/kg and 100mg/kg body weight respectively</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Temgesic</td>
			<td>Schering-Plough</td>
			<td></td>
			<td>Use the painkiller as 0,05-0,1mg/kg body weight</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DMEM</td>
			<td>Life sciences</td>
			<td>11995</td>
			<td>For trypsin neutralization,use media with serum(FBS:media 1:10 volume); for injection, use media with no serum</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Buffered sodium citrate</td>
			<td>Aniara</td>
			<td>A12-8480-10</td>
			<td>Use the volume ratio as citrate:blood; 1:9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth.

<html> Das Wachstum von Brustkrebs in Mäusen mit einer Vielzahl von Modellen untersucht werden. Genetische Manipulation von Brustkrebszellen können Einblicke in die Funktion von Proteinen in onkogenen Progression oder consequat liefern neue Tumorsuppressoren entdecken. Zusätzlich Injektion von Krebszellen in Mäusen, die mit verschiedenen Genotypen liefern ein besseres Verständnis der Bedeutung der Stroma. Viele Modelle nützlich, um bestimmte Aspekte der Progression der Erkrankung untersucht, aber nicht die gesamte Krebsprozess wiederholen. Im Gegensatz dazu Brustkrebszellen Transplantation in die Brustfettpolster von Mäusen besser rekapituliert den Ort der Erkrankung und die Präsenz der richtigen Stromatumoren Fach und daher besser imitiert menschliche Krebserkrankung. In diesem Artikel, wie Sie Brustkrebszellen orthotop in Mäuse implantiert werden und erklären, wie man Gewebe, um die Analyse zu sammeln beschreiben wir: 14px; line-height:. 28px; &quot;&gt; Tumormilieu und Metastasierung in entfernte Organe Unter Verwendung dieses Modells vielen Aspekten (Wachstum, Angiogenese und Metastasierung) von Krebs kann einfach durch eine günstige Umgebung für die Tumorzellen wachsen untersucht werden.

Erfolgreiche Anwendung des &quot;orthotopen Brustkrebsmodell&quot; auf ordnungsgemäße Injektion von Zellen in das Brustfettpolster basieren. Experimentelle Fehler wie ungenaue Inokulation von Zellen oder undicht sein, um Variationen in der Größe des Tumors oder sogar die Abwesenheit eines Tumors, der zur Bildung einer Struktur führt sucht ähnlich einer Brustfettpolster mit einem Steuerungspuffer (2A) injiziert führen. Die Wachstumsrate des Tumors ist abhängig von der Art des injizierten Zelllini...

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Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Krebs ist eine komplexe Erkrankung, die durch den den Tumor umgebenden Gewebes sowie lokale pro- und anti-inflammatorischen Mediatoren beeinflusst wird. Daher kann orthotrope Pritzer, anstatt subkutanen Modellen nützlich sein, um Krebsprogression in einer Weise, dass eine bessere ahmt menschlichen Pathologie studieren.

Orthotopische Injektion von Brustkrebszellen in das Brustfettpolster von Mäusen, das Tumorwachstum zu studieren.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

78.3K Aufrufe.  Leiden University Medical Center.  Krebs ist eine komplexe Erkrankung, die durch den den Tumor umgebenden Gewebes sowie lokale pro- und anti-inflammatorischen Mediatoren beeinflusst wird. Daher kann orthotrope Pritzer, anstatt subkutanen Modellen nützlich sein, um Krebsprogression in einer Weise, dass eine bessere ahmt menschlichen Pathologie studieren. 

Serie: Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis. Since the clinical presentation of this disease is so variable and non-specific, the associated risks of these biopsies are too great for the diagnostic yield. Other sites that have a lower biopsy risk, such as skin or gingival, are also relatively invasive and expensive. In addition, these biopsies may not always have sufficient amyloid deposits to establish a diagnosis. Fat pad aspiration has demonstrated good clinical correlation with low cost and minimal morbidity. However, there are no standardized protocols for performing this procedure or processing the aspirated specimen, which leads to variable and nonreproducible results. The most frequently utilized modality for detecting amyloid in tissue is an apple-green birefringence on Congo red stained sections using a polarizing microscope. This technique requires cell block preparation of aspirated material. Unfortunately, patients presenting in early stage of amyloidosis have minimal amounts of amyloid which greatly reduces the sensitivity of Congo red stained cell block sections of fat pad aspirates. Therefore, ultrastructural evaluation of fat pad aspirates by electron microscopy should be utilized, given its increased sensitivity for amyloid detection. This article demonstrates a simple and reproducible procedure for performing anterior fat pad aspiration for the detection of amyloid utilizing both Congo red staining of cell block sections and electron microscopy for ultrastructural identification.

Fat pad aspiration is a preferred, minimally invasive, and low cost approach as compared to other methods to detect amyloid for diagnosis of systemic amyloidosis. This video article demonstrates a procedural outline for performing fat pad aspiration with appropriate processing of the specimen for the optimal diagnostic outcome.

Durchführung und Abwicklung der FNA Anterior Fat Pad für Amyloid

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis.  Since the clinical presentation of this ...

Forschung

Medizin

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Ein In Vitro System zur Tumor Vegetationsruhe und die Umstellung auf Metastasen Study

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder tumor model. The mouse model is established by urethral catheterization under inhaled general anesthetic. Chemical burn is then introduced to the bladder mucosa using intravesical silver nitrate solution to disrupt the bladder glycosaminoglycan layer and allows cells to attach. Following several washes with sterile water, human bladder cancer KU-7-luc2-GFP cells are instilled through the catheter into the bladder to dwell for 2 hours. Subsequent growth of bladder tumors is confirmed and monitored by in vivo bladder ultrasound and bioluminescent imaging. The tumors are then treated intravesically with saRNA formulated in lipid nanoparticles (LNPs). Tumor growth is monitored with ultrasound and bioluminescence. All steps of this procedure are demonstrated in the accompanying video.

Establishing an orthotopic bladder tumor model to evaluate antitumor effects of intravesically delivered saRNA and monitoring tumor growth by ultrasound and bioluminescent imaging.

Einem orthotopen Blasentumor Modell und der Auswertung der intravesikalen Behandlung SÄRNA

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

Menschliche neuroendokrinen Tumor-Zelllinien als dreidimensionales Modell für das Studium der menschlichen neuroendokrinen Tumor-Therapie

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Orthotopic Aortic Transplantation in Mice for the Study of Vascular Disease

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. This is largely true, but there are a number of important principles that can reduce the difficulty of these procedures and enhance reproducibility. Orthotopic aortic transplantation is an excellent procedure in which to learn these principles because it involves only two end-to-end anastomoses, but requires good suturing technique and handling of the vessels for consistent success. This procedure begins with the procurement of a length of abdominal aorta from a donor animal, followed by division of the native aorta in the recipient. The procured aorta is then placed between the divided ends of the recipient aorta and sutured into place using end-to-end anastomoses. To accomplish this objective successfully requires a high degree of concentration, good tools, a steady hand, and an appreciation of how easily the vasculature of a mouse can be damaged, resulting in thrombosis. Learning these important principles is what occupies most of the beginner's time when learning microsurgery in small rodents. Throughout this protocol, we refer to these important points. This model can be used to study vascular disease in a variety of different experimental systems1-8. In the context shown here, it is most often used for the study of post-transplant vascular disease, a common long-term complication of solid organ transplantation in which intimal hyperplasia occurs within the allograft. The primary advantage of the model is that it facilitates quantitative morphometric analyses and the transplanted vessel lies contiguous to the endogenous vessel, which can serve as an additional control9. The technique shown here is most often used for mice weighing 18-25 grams. We have accumulated most of our experience using the C57BL/6J, BALB/cJ, and C3H/HeJ strains.

We describe a technique in which a section of the abdominal aorta from a mouse is transplanted orthotopically to just below the renal arteries in an allogeneic or syngeneic recipient. This technique can be useful in studies in which transplantation of large arteries of uniform size is deemed advantageous.

Orthotopen Aortic Transplantation in Mäuse für das Studium der Vascular Disease

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

A Novel Hochauflösende<em&gt; In vivo</em&gt; Bildtechnik, um die Dynamik der intrakranielle Strukturen zu Tumorwachstum und Therapeutics Studieren

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

Dreidimensional Kulturen: Ein Werkzeug, um Architektur zu studieren Normale acinar gegen maligne Transformation von Brustzellen

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Tracking the Mammary Architectural Features and Detecting Breast Cancer with Magnetic Resonance Diffusion Tensor Imaging

Breast cancer is the most common cause of cancer among women worldwide. Early detection of breast cancer has a critical role in improving the quality of life and survival of breast cancer patients. In this paper a new approach for the detection of breast cancer is described, based on tracking the mammary architectural elements using diffusion tensor imaging (DTI). 
The paper focuses on the scanning protocols and image processing algorithms and software that were designed to fit the diffusion properties of the mammary fibroglandular tissue and its changes during malignant transformation. The final output yields pixel by pixel vector maps that track the architecture of the entire mammary ductal glandular trees and parametric maps of the diffusion tensor coefficients and anisotropy indices. 
The efficiency of the method to detect breast cancer was tested by scanning women volunteers including 68 patients with breast cancer confirmed by histopathology findings. Regions with cancer cells exhibited a marked reduction in the diffusion coefficients and in the maximal anisotropy index as compared to the normal breast tissue, providing an intrinsic contrast for delineating the boundaries of malignant growth. Overall, the sensitivity of the DTI parameters to detect breast cancer was found to be high, particularly in dense breasts, and comparable to the current standard breast MRI method that requires injection of a contrast agent. Thus, this method offers a completely non-invasive, safe and sensitive tool for breast cancer detection.

We describe how to obtain parametric and vector maps of the diffusion tensor of the breast using magnetic resonance imaging. The protocol and final output following imaging processing are tailored for tracking breast architectural features and detecting breast malignancy.

Tracking der Brust architektonische Details und Erkennen von Brustkrebs mit Magnet-Resonanz-Diffusion Tensor Imaging

Breast cancer is the most common cause of cancer among women worldwide. Early detection of breast cancer has a critical role in improving the quality of ...

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft tissue filler as it is readily available, easily obtained, inexpensive, and inherently biocompatible.1 However, despite its burgeoning popularity, fat grafting is hampered by unpredictable results and variable graft survival, with published retention rates ranging anywhere from 10-80%. 1-3
To facilitate investigations on fat grafting, we have therefore developed an animal model that allows for real-time analysis of injected fat volume retention. Briefly, a small cut is made in the scalp of a CD-1 nude mouse and 200-400 &#181;l&#160;of processed lipoaspirate is placed over the skull. The scalp is chosen as the recipient site because of its absence of native subcutaneous fat, and because of the excellent background contrast provided by the calvarium, which aids in the analysis process. Micro-computed tomography (micro-CT) is used to scan the graft at baseline and every two weeks thereafter. The CT images are reconstructed, and an imaging software is used to quantify graft volumes.
Traditionally, techniques to assess fat graft volume have necessitated euthanizing the study animal to provide just a single assessment of graft weight and volume by physical measurement ex vivo. Biochemical and histological comparisons have likewise required the study animal to be euthanized. This described imaging technique offers the advantage of visualizing and objectively quantifying volume at multiple time points after initial grafting without having to sacrifice the study animal. The technique is limited by the size of the graft able to be injected as larger grafts risk skin and fat necrosis. This method has utility for all studies evaluating fat graft viability and volume retention. It is particularly well-suited to providing a visual representation of fat grafts and following changes in volume over time.

Fat grafting is an essential technique for reconstructing soft tissue deficits. However, it remains an unpredictable procedure characterized by variable graft survival. Our goal was to devise a mouse model that utilizes a novel imaging method to compare volume retention between differing techniques of fat graft preparation and delivery.

Beurteilung der Lebensfähigkeit der Menschen Fat Injektion in Nacktmäusen mit Micro-Computertomographie

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Modell um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust Studieren

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...