Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Krebsbereich zu beantworten, wie die Mikroumgebung das Tumorwachstum unterstützt oder ob ein bestimmtes Medikament die Brustkrebsprogression wirksam hemmen kann. Die Hauptvorteile der Tumorinduktionstechnik sind, dass keine Operation erforderlich ist und es eine weniger invasive Art und Weise ist, um Brustkrebs vor Ort zu etablieren. Mit dieser Technik wachsen die Tumorzellen innerhalb des Brustfettpolsters, in der entsprechenden Gewebeumgebung, und imitieren die Fortschreiten des menschlichen Brustkrebses enger als subkutane Injektion oder Xenograft in Mäusezellen.
Ke-Xin Cao, unser Techniker, und ich werden Gan-Lin Zhang bei der Demonstration dieses Verfahrens unterstützen. Am Tag vor der Operation, halten Sie die Empfängermaus manuell zurück und drehen Sie die Tierbauchseite auf das Fell, um sich um die vierten Brustwarzen rasiert zu werden. Wischen Sie das Fell mit einer dünnen Schicht Enthaarungscreme ab.
Verwenden Sie destilliertes Wasser, um die Creme nach 30 bis 60 Sekunden zu entfernen und die Maus mit weichen Papiertüchern zu trocknen. Verdünnen Sie am Tag der Operation die murine Brustkrebszellsuspension auf zwei mal zehn bis fünf Milliliter PBS-Konzentration in einem sterilen Mikrozentrifugenrohr auf Eis. Laden Sie vor jeder Injektion eine Milliliterspritze mit einer 45 mal 16 Nadel mit 50 Mikroliter Zellen pro Maus.
Und bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifung in jedem sedierten Tier. Tragen Sie Salbe auf die Augen des Tieres auf und verwenden Sie eine Pinzette, um die Haut um die vierte Brustwarze der ersten Maus zu zelten, um einen Tunnel für die Spritze zu schaffen. Halten Sie die Spritze mit der Abschrägung nach oben und subkutan in die Haut mit fünf bis zehn Millimetern von der Brustwarze, folgen Sie dem Tunnel, bis die Nadelspitze fast die Brustwarze erreicht.
Mit einer Pinzette, um die Haut um die erste Brustwarze zu zelten, wird ein Tunnel für die Spritze erstellt. Die Nadel sollte zwischen den Pinzettspitzen eingegeben werden und aufsteigen, anstatt in das Gewebe zu deprimieren. Bewegen Sie die Nadel vorsichtig in das Brustfettpad, bis sich die Abschrägung unter der Brustwarze befindet, und lassen Sie das Hautzelt los, um eine langsame Injektion der Krebszellen zu ermöglichen.
Beim Einsetzen die Nadelspitze vorsichtig in das Brustfettpad bewegen, bis sich die Abschrägung unter der Brustwarze befindet. Und Sie werden Widerstand spüren, um die Lieferung der Zellen an den richtigen Ort zu gewährleisten. Wenn alle Zellen injiziert wurden, drehen Sie die Nadel leicht zur Seite und ziehen Sie die Spritze langsam zurück.
Verwenden Sie einen Wattestäbchen, um Druck auf die Nadelwunde für 10 bis 20 Sekunden anzuwenden, um zu machen, dass es keine Flüssigkeitsickerung gibt. Die injizierte Brustwarze sollte als transparente, weiße, flache Kugel erscheinen, mit der Brustwarze in der Mitte. Um das Tumorvolumen zu bestimmen, halten Sie die Bauchseite der Maus nach oben und verwenden Sie einen Bremssattel, um die Tumorlänge und -breite zu messen.
Um die Tumorbiolumineszenz zu erfassen, 10 Minuten vor der Bildgebung injizieren 150 Milligramm pro Kilogramm D-Luciferin in den Nacken der Maus. Und erfassen Sie Biolumineszenzbilder des Primärtumors und Metastasen unter den entsprechenden Biolumineszenz-Bildgebungsparametern. Verwenden Sie zum entsprechenden experimentellen Zeitpunkt eine Schere, um den Tumor von der Haut zu ernten.
Und wenden Sie die schmerzstillenden Lösungen auf die chirurgische Stelle an, um postoperative Schmerzen zu lindern. Dann schließen Sie die Haut mit chirurgischen Nähten nach Standardprotokollen. Lassen Sie das Tier unter einer Wärmelampe mit Überwachung bis zur vollständigen Genesung erholen.
Verwenden Sie ein Skalpell, um den Primärtumor in zwei gleiche Stücke zu schneiden. Lagern Sie die Hälfte des Gewebes in 4%Paraformaldehyd für die nachfolgende Hämatoxylin- und Eosinfärbung und Immunhistochemie. Die andere Hälfte in flüssigem Stickstoff für western blotting oder RNAi Isolation einfrieren.
Am entsprechenden experimentellen Endpunkt ernten Sie die Lunge nach Standard-Sezierprotokollen und waschen Sie das Organ in PBS. Dann fixieren Sie die Lunge in 4%Paraformaldehyd, um Metastasen durch Hämatoxylin und Eosinfärbung zu verifizieren. Das primäre Tumorwachstum kann anhand des Tumorvolumens und der lebenden Tumorzellbiolumineszenz gemessen werden, wie gezeigt.
Metastasen werden in den frühen Stadien der Impfung nicht beobachtet, da entweder kein sekundärer Tumor festgestellt wurde oder die starken biolumineszierenden Signale des Primärtumors den Nachweis kleiner metastasierender Brennpunkte mit schwachen Signalen behindern. Nach der Resektion kann das Biolumineszenzsignal aus den metastasierenden Brennpunkten entfernter Organe erkannt und analysiert werden. Die Analyse der Morphologie sowohl des primären Brusttumors als auch der Lungenabschnitte durch Hämatoxylin- und Eosinfärbung zeigt eine erhöhte Angiogenese in der Tumorzelle geimpfte Tiere, wie die Anti-CD31-Mikrogefäß-Markerfärbung belegt.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich vor der Übergabe der Tumorzellen daran zu erinnern, dass sich die Nadelspitze an der richtigen Stelle befindet. Nach diesem Verfahren können Zerstäuber, wie Tier-Ultraschall, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über Blasensupplementierung des primären Tumors in vivo zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Tumorigenese und der Arzneimittelentwicklung bei der Erforschung der Schlüsselfaktoren und Wege, die an der Tumorigenese und den Mechanismen von Krebsmedikamenten in murinen Tiermodellen beteiligt sind.
Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Isofluran oder anderen Gasanästhesie extrem schwer zu dosieren sein kann und dass Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung einer Aktivkohlemaske immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden sollten.
