Diese Arbeit wurde von der CIRM Frühe II Translational Research Award TR2-01821, NIH / NIDCR (Zuschüsse R21 DE0177711 und RO1 DE01607), UC Discovery Grant 07-10677, AWJ und RKS unterstützt haben T32 Ausbildungsstipendien Awards (5T32DE007296-14), JNZ hat eine Ausbildung CIRM Gemeinschaft (TG2-01169).

1. Perivaskuläre Stammzellisolation Dies wird in Einzelheiten in der nebenstehenden Artikel &quot;Die Reinigung von Perivaskuläre Stammzellen aus menschlichen weißen Fettgewebe&quot; beschrieben, vertreten durch M. CORSELLI et al. 2. Scaffold Creation <ol><li> Gerüste sind an zuvor veröffentlichten Protokolls aus Poly (milchsäure-co-Glykolsäure) (PLGA, Burmingham Polymer) mit Hydroxyapatit-Beschichtung 4-6 Maß. Apatit-beschichteten PLGA Gerüste werden von 85/15 PLGA im Gießverfahren und einem teilchenförmigen Laugung hergestellt. Gerüste sind in einer sphärischen Form (2 mm Durchmesser) für Muskel Beutel Implantation, eine Scheibenform (4 mm Durchmesser) für Calvaria Implantation oder zylindrische (4 mm Durchmesser, 6 mm Länge) für femorale Segmentdefekten erstellt. </li><li> Kurz gesagt, PLGA / Chloroform-Lösungen mit Saccharose (Polymer / Saccharose-Verhältnis 5/95, w / w) gemischt werden, in einen 200-300-Mikrometer Durchmesser Teflonform, um die maßgeschneiderte Nachteile schaffen gegossentruct. Nach dem Gefriertrocknen über Nacht werden die Gerüste aus Teflon-Form entfernt und in ddH 2 O, um die Saccharose zu lösen. Gerüste werden durch Eintauchen in 70% Ethanol für 30 min desinfiziert, gefolgt von drei Spülungen ddH 2 O. </li><li> Für Apatit-Beschichtung wird ein simulierter Körperflüssigkeit (SBF) Lösung durch sequentielles Lösen von CaCl 2, MgCl 2 • 6H 2 O, NaHCO 3 und K 2 HPO 4 • 3 H 2 O in ddH 2 O. vorbereitet Lösung auf pH 6 mit indem 1 M Salzsäure zur Erhöhung der Löslichkeit verringert. Na 2 SO 4, KCl und NaCl zugegeben und der End-pH auf 6,5 (SBF 1) eingestellt. </li><li> Mg2 + und HCO 3 - frei SBF (SBF 2) wird durch Zugabe von CaCl 2 und K 2 HPO 4 • 3 H 2 O in ddH 2 O und pH-Wert auf 6 gesenkt vorbereitet. KCl und NaCl zugegeben und der End-pH auf 6,8 eingestellt. Alle Lösungen sind steril durch eine 0,22 um PES Membr gefiltertane (Nalgene). Unmittelbar vor dem Beschichten werden die getrockneten PLGA Gerüsten Glimmentladung Argon-Plasma-Ätzen (Harrick Scientific) unterzogen, um die Benetzung und Beschichtungsgleichmäßigkeit zu verbessern. </li><li> Geätzte Gerüste werden dann in SBF 1 für 12 h inkubiert und geändert werden, um Mg 2 + und HCO 3 - freien SBF 2 für weitere 12 h bei 37 ° C unter leichtem Rühren. Beschichtete Gerüste werden mit ddH 2 O gewaschen, um überschüssige Ionen zu entfernen und lyophilisiert vor der weiteren Untersuchungen. </li></ol> 3. Das Muscle Pouch Modell Implantation <ol><li> 100 ul einer PSC-Suspension in PBS (Phosphate Buffered Saline) werden vorsichtig auf die sphärische PLGA-basierte Implantat unmittelbar vor der Implantation gesunken. Die Zellen wurden durch lentiviralen Einsetzen der Firefly-Luciferase voretikettiert, um in vivo nach der Implantation Tracking zu ermöglichen. Die Zelldichte von 2,5 x 10 5 pro Implantat. </li><li> SCID (severe combined immundefizienten) Mäuse werden am Alter von 6 Wochen eingesetzt. Die Tiere sind Anesthetized durch Einatmen und Isofluran Prämedikation mit Buprenorphin (Bedford Labs). Nach dem Standard-Betadin Herstellung werden die bilateralen Einschnitte in den hinteren Gliedmaßen aus (Längs-und 2 mm in der Länge). </li><li> Taschen sind in den Bizeps femoris durch stumpfe Präparation parallel zur Muskelfaser langen Achse geschnitten. Für jede Maus, wird das PLGA-basierte Implantat mit PSCs eingeführt und der Faszie des Muskels mit 5-0 Vicryl (Ethicon) vernäht. </li><li> Die Haut wird mit 5-0 Vicryl nächste in einer subkutanen Muster geschlossen. Für 10 Tage; Tiere sind postoperativ mit Buprenorphin für 48 Stunden und TMP / SMX (Qualitest Trimethoprim / Sulfamethoxazol) behandelt. </li></ol> 4. Die Schädeldecken Defektmodell Implantation <ol><li> Nach Isofluran-Narkose von SCID-Mäusen (12-14 Wochen alt), wird das Haar geschoren und die Haut mit Betadine pro Protokoll desinfiziert. </li><li> Ein 8-mm Hautschnitt entlang der Mitte Pfeilnaht der Maus Kalotte hat. Als nächstes wird die calvArial Periost wird sanft von Q-Tip-Anwendung entfernt. </li><li> Dann wurde unter Verwendung diamantbeschichteten Trephine Bits in einem Breitband-Dentalbohrers wird ein 4-mm-parietalen Knochendefekt erstellt. Der Defekt ist voller Stärke - aber nicht darauf geachtet wird, um die darunterliegende Dura mater zu verletzen. </li><li> Der maßgefertigte PLGA-basierte Implantat mit eingepflanzten PSCs wird dann vorsichtig in der defekten Stelle platziert. Die Zelldichte von 2,5 x 10 5 pro Implantat. Schließlich wird die Haut mit 6-0 Vicryl vernäht. Die Tiere werden nach der Operation mit Buprenorphin für 48 Stunden und TMP / SMX für 10 Tage behandelt. </li></ol> 5. Der Femur segmentalen Defekt Modell Implantation <ol><li> Athymischen Ratten (12-14 Wochen alt) sind unter Isofluran-Inhalation betäubt. Der Oberschenkel ist geschrubbt und zubereitete pro Standard-Protokoll mit Betadine (Abbildung 1). </li><li> Ein 27-30-mm Längsinzision über die anterolaterale Seite des Oberschenkels gemacht. Der Femurschaft wird dann durch die Trennung der vastus lat. ausgesetzteralis und M. biceps femoris (Abbildung 2). </li><li> Um die Konsistenz der Knochenregeneration zu maximieren, wird das Periost über der femoralen Defekt vollständig mit der resezierten femoralen Segment entfernt. </li><li> Ein Polyethylen-Platte (Länge, 23 mm, Breite 4 mm, Höhe, 4 mm) an der antero-Oberfläche des Femur. Die Platte enthält sechs vorgebohrten Löcher bis 0,9 mm Durchmesser Gewinde-Kirschner-Drähte (Zimmer) unterzubringen. Unter die Platte als Schablone werden sechs Gewinde Kirschner-Drähte durch die Platte und beide Kortikales (Abbildung 3) niedergebracht. </li><li> Als nächstes wird mit einer kleinen oszillierenden Sägeblatt (Stryker, MI) wird eine 6-mm-Mitte-diaphysären Defekt erzeugt. Segment Defekte werden dann durch die Insertion von PLGA Implantaten auf die beladen worden mit Zellen gemäß Protokoll (4) behandelt wurden. </li><li> Die darüber liegende Muskeln und Faszien sind mit 4-0 Vicryl resorbierbaren Fäden verschlossen, um das Implantat zu fixieren, und die Haut vernäht. </li&gt; </ol> 6. In-vivo-Beurteilungen <ol><li> Radiographische Bewertungen sind in einer Längsrichtung Weise sowohl Hochauflösung XR und Hochauflösung μCT (Mikro-Computertomographie)-Analyse durchgeführt. Für μCT-Analyse (Skyscan 1172F), werden die Bilder bei einer Auflösung von 19,73 um (100 kV und 100 mA Strahlungsquelle mit Hilfe eines 0,5 mm Aluminium-Filter) gescannt. Bilder werden mit Hilfe DataViewer, Recon, CTAN, und CTVol Software. </li><li> Biolumineszenz-Bildgebung wird auch in serieller Weise zu Zelle Transplantation, Lebensfähigkeit, der Vermehrung zu beurteilen und schließt Migration aus der Implantationsstelle getan. Biolumineszenz-Bildgebung erfolgt mit Hilfe eines IVIS Lumina II Gerät (Caliper Life Sciences). Licht-Ausgänge werden quantifiziert durch lebende Image Software (Xenogen). Insgesamt Lichtleistung wird in Photonen / Sekunde / cm ² / Steradiant aufgezeichnet. </li><li> Histologische und histomorphometrische Analyse wird post mortem durchgeführt. Routinefärbungen eingesetzt werden, umfassen Masson, Anilinblau, S.entachrome und Picrosirius rot. Histomorphometrische Analyse lässt sich leicht entweder mit Anilinblau oder pentachrome Flecken durchgeführt, bei dem Osteoid dunkelblau und gelb, bzw. erscheint. Pixel pro starkem Gesichtsfeld berechnet mit dem Zauberstab-Werkzeug in Adobe Photoshop. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Da sowohl die Schädeldecken und femoralen Defekte kritischen Größe sind, sollten keine signifikante Heilung ohne Behandlung mit Wachstumsfaktoren oder exogene Stammzellen zu erwarten. In Bezug auf die chirurgische Manöver sollte der Muskel Beutel Dissektion entlang Faszien sein und damit minimale Blutung sollte begegnet werden. Auch wenn der Muskel Beutel Modell bilateraler Ebene durchgeführt wird, sollte die Maus mit Leichtigkeit am Tag nach der Operation ein zu Fuß. Für die Kalvariamodell Defekt wird Blutungen auftreten, kann aber mit einem Wattestäbchen getränkt werden. Äußerste Sorgfalt sollte nicht auf die zugrunde liegende Dura mater verletzt werden - wie dies störenmit normaler Heilung. Für die FSD-Modell wird darauf geachtet, nicht um die großen Blutgefäße zu verletzen, so wie nicht übermäßige Blutungen oder den N. femoralis zu veranlassen, um neurologische Schäden zu verhindern. Kirschner-Drähte mit leichtem Druck gebohrt, um nicht den kortikalen Knochen in dem Verfahren beschädigt werden. <img alt="Abbildung 1." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig1.jpg" /> Abbildung 1. Präoperative Vorbereitung für Femur segmentalen Defekt (FSD) in athymischen Ratten. Männliche Ratten (12-14 Wochen alt) sind unter Isofluran-Inhalation betäubt. Der Oberschenkel ist geschrubbt und desinfiziert pro Standard-Protokoll mit Betadine. <img alt="Abbildung 2." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig2.jpg" /> Abbildung 2. Operative Freilegung für Femur segmentalen Defekt (FSD) Schöpfung. Ein 27-30 mm Längsinzision über die anterolaterale Seite des Oberschenkels gemacht. Die lateralen Seite des Femurs wird dann durch Trennen des Musculus vastus lateralis ausgesetztund M. biceps femoris. <img alt="Abbildung 3." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig3.jpg" /> Abbildung 3. Fixierung für Femoral segmentalen Defekt (FSD) Schöpfung. Ein Polyethylen-Platte (Länge, 23 mm, Breite 4 mm, Höhe, 4 mm) an der antero-Oberfläche des Femur. Die Platte enthält sechs vorgebohrten Löcher bis 0,9 mm Durchmesser Gewinde-Kirschner-Drähte unterzubringen. Unter die Platte als Schablone werden sechs Gewinde Kirschner-Drähte durch die Platte und beide Kortikales gebohrt. Als nächstes wird eine 6 mm Mitte-diaphysären Defekt erzeugt. Sobald dies durchgeführt wird, wird eine maßgeschneiderte Gerüst direkt eingefügt, die genau den Defekt vor Ort (nicht dargestellt). <img alt="Abbildung 4." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig4.jpg" /> Abbildung 4. Beispiel für Kalvariamodell Defect Postoperative. Ein 4 mm, kreisförmigen Calvaria Defekt in der rechten Scheitelbein in athymischen Mäusen erzeugt. Abgebildeten hier ist ein Defekt implantiert mitPSCs nach 8 Wochen postoperativ. Notieren Sie sich die Anwesenheit des neuen Knochens innerhalb der defekten Stelle.

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KT, BP und CS sind Erfinder von perivaskulären Stammzell-Patente von der UCLA eingereicht. Drs. KT und CS sind die Begründer der Scarless Laboratories Inc., die perivaskulären Stammzellen-Patente lizenziert diese von der UC Regents. Dr. Chia Soo ist auch ein Offizier der Scarless Laboratories, Inc.

Die Isolierung von PSCs ist gut an anderer Stelle beschrieben 1-3, einschließlich eines separat eingereicht JoVE Veröffentlichung speziell an PSC Isolation Protokolle und Methoden. Der spezifische Zweck dieses Artikels ist zu beschreiben und zu zeigen, 3-Protokolle für die PSC in vivo-Anwendung für die Knochenbildung / Regeneration. Die SCID-Maus-Muskel-Tasche ist eine häufig beschriebene Modell für menschliche ektopische Knochenbildung 7. Wichtige Unterschiede gibt es zwischen ektopen und orthotopen (Defekt) Modelle für die Knochen, darunter parakrine Interaktion mit dem Host Knochen bildenden Zellen 8 sowie einer Fülle von osteogenen Faktoren Signalisierung in der Skelett-Defekt Mikroumgebung. Zwei Mängel werden hier vorgestellt und eine Kalvariamodell defect8 femoralen segmentalen Defekts 4. Beide sind gut dokumentiert, kritisch zu sein Größe (dh nicht auf ihren eigenen heilen). Interessante Unterschiede gibt es zwischen Kalvariamodell und femoralen Defekte. Zuerst wird derZell: Zell-Interaktion zwischen Heterotransplantattumor PSCs und körpereigenen Zellen ist sehr unterschiedlich. Im Sinne einer Calvaria Defekt, interagieren PSCs mit dem darunter liegenden Dura mater (die äußerste Schicht der Hirnhaut), ebenso wie diejenigen Osteoblasten und Periostzellen aufweist, die die defekten Stelle. Wichtig ist, dass die Wechselwirkung zwischen der implantierten Zellen und umgebenden Osteoblasten 8 oder implantierten Zellen und die zugrunde liegenden Dura (Levi et al., Im Druck) für die normale Stamm-Zell-vermittelte Osteogenese, um fortzufahren. Im Hinblick auf die femorale segmentalen Defekt (FSD), werden Xenotransplantat PSCs zu einem ganz anderen Zelle und Cytokin Umgebung ausgesetzt. Zum Beispiel wird die FSD Seite der zugehörigen Knochenmark und mesenchymale Stammzellen, sowie die Endost, Periost und langer Röhrenknochen Osteoblasten besteht. Theoretisch weist jede Zelle einen eigenen Reaktion auf eine Verletzung, und jede Zelle haben kann: Zell-Interaktionen mit PSC-Xenotransplantaten. Weitere deutliche Unterschiede bestehen zwischen Kalvariamodellund femoralen Defekte. Die Schädeldecken Knochen bilden zunächst durch intramembranöse Ossifikation, während die langen Knochen durch einen Knorpel-Zwischenprodukt (enchondralen Ossifikation) zu bilden. Darüber hinaus ist die reparative Verfahren nach der Verletzung auch ahmt diese Entwicklungsstörungen Herkunft. Post-FSD, wird Knorpel Kallusbildung beobachtet, während keine Zwischen-Knorpel in einem Scheitelbein Defekt gebildet wird. Schließlich kann die embryonale Herkunft des Schädels aus, dass der langen Knochen unterscheiden. Die Mehrheit der Schädel (einschließlich perivaskuläre Zellen - Perizyten - in der ganzen Kopfbereich) von der Neuralleiste (mesectoderm) abgeleitet, während die appendicularis Skelett der paraxialen Mesoderm Ableitung 9. All diese Unterschiede können in signifikanten Unterschiede in Bezug auf die PSC-vermittelte Knochenreparatur führen. Der Einsatz von PSCs hat einige Vorteile gegenüber traditionellen Fettgewebe gewonnene Stromazellen (ASC). PSCs erfordern keine Kultur und eine gereinigte Zellpopulation which beinhaltet keine anderen Stromazellen, die nicht in nicht teilnehmen - und kann sogar negativ regulieren - osteogene Differenzierung, wie Endothelzellen 10. Im Gegensatz zum Beispiel für klonale Analysen ASC, dass nur eine Subpopulation der Lage einer osteogenen Differenzierung in vitro 11 sind. Letztendlich wird das Skelettgewebe Entwicklungsanstrengungen wahrscheinlich enthalten eine osteocompetent Stammzellen (zB PSC) mit exogenen Wachstumsfaktoren und eine osteokonduktive Matrix (wie HA-PLGA verwendet in den vorliegenden Verfahren), um die besten zu heilen Skelettdefekten.

use of human perivascular stem cells for bone regeneration

Menschliche perivaskulären Stammzellen (PSCs) können in ausreichender Zahl aus verschiedenen Geweben zum Zwecke der Skelett-Tissue-Engineering 3.1 isoliert werden. PSCs sind FACS-sortierten Population von &quot;Perizyten&quot; (CD146 + CD34-CD45-) und &quot;Adventitia-Zellen&quot; (CD146-CD34 + CD45-), jeder von denen wir bereits berichtet haben, um die Eigenschaften von mesenchymalen Stammzellen. PSCs, wie MSCs können osteogene Differenzierung sowie sezernieren pro-osteogene Cytokine 1,2 unterzogen. Im vorliegenden Protokoll demonstrieren wir den osteogenicity von PSCs in mehreren Tiermodellen einschließlich eines Muskels Beutel Implantation in SCID (severe combined immundefizienten) Mäuse, eine SCID-Maus Kalvariamodell Defekt und einen femoralen segmentalen Defekt (FSD) in athymischen Ratten. Der Oberschenkelmuskel Beutel Modell wird verwendet, um ektopische Knochenbildung zu beurteilen. Kalvariamodell Defekte sind auf dem Scheitelbein zentriert und sind standardmäßig 4 mm im Durchmesser (kritisch Größe) 8. FSDs sind bikortikale stabilisiert und sind mitein Polyethylen-Bar und K-Drähte 4. Der FSD beschrieben ist auch eine kritische Größe Defekt, der nicht wesentlich auf seine eigenen vier heilen. Im Gegensatz dazu, wenn Stammzellen oder Wachstumsfaktoren der defekten Stelle hinzugefügt wurden, können signifikante Knochenregeneration geschätzt. Das übergeordnete Ziel der PSC Xenografting ist es, das osteogene Potenzial dieser Zellart in beide ektopen und orthotopen Knochenregeneration Modelle zu demonstrieren.

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Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Menschliche perivaskulären Stammzellen (PSCs) sind eine neue Klasse für Stammzell-Skelett-Geweberegeneration ähnlich wie mesenchymale Stammzellen (MSCs). PSCs durch FACS (fluorescence activated cell sorting) kann aus dem Fettgewebe während der üblichen Fettabsaugung Verfahren beschafft isoliert werden, dann mit einem osteoinduktiven Gerüst kombiniert, um die Knochenbildung zu erreichen<em&gt; In-vivo-</em&gt;.

Verwenden Sie für Menschenrechte Perivaskuläre Stammzellen für die Knochenregeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

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20.3K Aufrufe.  School of Dentistry, UCLA. Menschliche perivaskulären Stammzellen (PSCs) sind eine neue Klasse für Stammzell-Skelett-Geweberegeneration ähnlich wie mesenchymale Stammzellen (MSCs). PSCs durch FACS (fluorescence activated cell sorting) kann aus dem Fettgewebe während der üblichen Fettabsaugung Verfahren beschafft isoliert werden, dann mit einem osteoinduktiven Gerüst kombiniert, um die Knochenbildung zu erreichen In-vivo-.

Serie: Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

Alginat-Mikrokapseln als 3D-Plattform für die Vermehrung und Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) auf verschiedenen Linien

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Forschung

Biotechnik

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

Entwicklung, Erweiterung und<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoring von humanen NK Zellen aus humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten mesoangioblast-ähnlichen myogenen Vorläufern in Mausmodellen der Muskelregeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates after injection into injured tissues as well as the observed massive cell death rates lead to very restricted therapeutic effects. To overcome these limitations, we sought to establish a non-viral based protocol for suitable cell engineering prior to their administration. The modification of human CD133+ expressing SCs using microRNA (miR) loaded magnetic polyplexes was addressed with respect to uptake efficiency and safety as well as the targeting potential of the cells. Relying on our protocol, we can achieve high miR uptake rates of 80&#8211;90% while the CD133+ stem cell properties remain unaffected. Moreover, these modified cells offer the option of magnetic targeting. We describe here a safe and highly efficient procedure for the modification of CD133+ SCs. We expect this approach to provide a standard technology for optimization of therapeutic stem cell effects and for monitoring of the administered cell product via magnetic resonance imaging (MRI).

This protocol illustrates a safe and efficient procedure to modify CD133+ hematopoietic stem cells. The presented non-viral, magnetic polyplex-based approach may provide a basis for the optimization of therapeutic stem cell effects as well as for monitoring the administered cell product via magnetic resonance imaging.

Protokoll für MicroRNA Transfer an adulten Knochenmark gewonnenen Hämatopoetischen Stammzellen Zelle Engineering kombiniert mit magnetischen Ausrichtung ermöglichen

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such lesions, there are potential complications with their use. Thus, material scientists are developing synthetic, biocompatible biomaterials to overcome these problems. In this study, we present a multidisciplinary platform for evaluating biomaterials for bone repair. We combined expertise from bone biology and immunology to develop a platform including in vitro osteoclast (OC) and osteoblast (OB) assays and in vivo mouse models of bone repair, immunogenicity, and allergenicity. We demonstrate how to perform the experiments, summarize the results, and report on biomaterial biocompatibility. In particular, we tested OB viability, differentiation, and mineralization and OC viability and differentiation in the context of &#946;-tricalcium phosphate (&#946;-TCP) disks. We also tested a &#946;-TCP/Collagen (&#946;-TCP/C) foam which is a commercially available material used clinically for bone repair in a critical-sized calvarial bone defect mouse model to determine the effects on the early phase of bone healing. In parallel experiments, we evaluated immune and allergic responses in mice. Our approach generates a biological compatibility profile of a bone biomaterial with a range of parameters necessary for predicting the biocompatibility of biomaterials used for bone healing and repair in patients.

The number of novel biomaterials engineered for repairing large bone lesions is continuously expanding with the aim to enhance bone healing and overcome the complications associated with bone transplantation. Here, we present a multidisciplinary strategy for pre-clinical biocompatibility testing of biomaterials for bone repair.

Biologische Verträglichkeit Profil auf Biomaterialien für Knochenregeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and size by low-density lipoproteins (LDLs) because cancer cells have an increased need for cholesterol to proliferate, and this has been exploited as a mechanism for delivering anticancer drugs to cancer cells. Moreover, depending on drug chemistry, encapsulating the drug can be advantageous to avoid degradation of the drug during circulation in vivo. Therefore, in this&#160;study, this design is used to fabricate lipid-coated nanoparticles of the anticancer drug falcarindiol, providing a potential new delivery system of falcarindiol in order to stabilize its chemical structure against degradation and improve its uptake by tumors. Falcarindiol nanoparticles, with a phospholipid and cholesterol monolayer encapsulating the purified drug core of the particle, were designed. The lipid monolayer coating consists of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol (Chol), and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) along with the fluorescent label DiI (molar ratios of 43:50:5:2). The nanoparticles are fabricated using the rapid injection method, which is a fast and simple technique to precipitate nanoparticles by good-solvent for anti-solvent exchange. It consists of a rapid injection of an ethanol solution containing the nanoparticle components into an aqueous phase. The size of the fluorescent nanoparticles is measured using dynamic light scattering (DLS) at 74.1 &#177; 6.7 nm. The uptake of the nanoparticles is tested in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and imaged using fluorescence and confocal microscopy. The uptake of the nanoparticles is observed in hMSCs, suggesting the potential for such a stable drug delivery system for falcarindiol.

This article describes the encapsulation of falcarindiol in lipid-coated 74 nm nanoparticles. The cellular uptake of the nanoparticles&#160;by human stem cells into lipid droplets is monitored by fluorescent and confocal imaging. Nanoparticles are fabricated by the rapid injection method of solvent shifting, and their size is measured with the dynamic light scattering technique.

Aufnahme von neuen Lipid-beschichteten Nanopartikeln mit Falcarindiol von humanen mesenchymalen Stammzellen

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

Musterung der Geometrie menschlicher embryonaler Stammzellkolonien auf konformen Substraten zur Kontrolle der Gewebe-Level-Mechanik

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, unlike more differentiated progenitors, and enter the cell cycle rapidly after chemotherapy or irradiation to treat bone marrow injury or in vitro culture. By mimicking the bone marrow microenvironment in the presence of abundant fatty acids, cholesterol, low concentration of cytokines, and hypoxia, human HSCs maintain quiescence in vitro. Here, a detailed protocol for maintaining functional HSCs in the quiescent state in vitro is described. This method will enable studies of the behavior of human HSCs under physiological conditions.

This protocol enables the maintenance of quiescent human hematopoietic stem cells in vitro by mimicking the bone marrow microenvironment using abundant fatty acids, cholesterol, lower concentrations of cytokines, and hypoxia.

Eine Kulturmethode zur Erhaltung von quiescent Human Hematopoietic Stammzellen

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is an important structure of gingival tissue, especially in the repair and regeneration of periodontal tissue. Studying the functions of gingival epithelial cells has crucial scientific value, such as repairing oral defects and detecting the compatibility of biomaterials. As human gingival epithelial cells are highly differentiated keratinized cells, their lifespan is short, and they are difficult to passage. So far, there are only two ways to isolate and culture gingival epithelial cells, a direct explant method and an enzymatic method. However, the time required to obtain epithelial cells using the direct explant method is longer, and the cell survival rate of the enzymatic method is lower. Clinically, the acquisition of gingival tissue is limited, so a stable, efficient, and simple in vitro isolation and culture system is needed. We improved the traditional enzymatic method by adding Y-27632, a Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor, which can selectively promote the growth of epithelial cells. Our modified enzymatic method simplifies the steps of the traditional enzymatic method and increases the efficiency of culturing epithelial cells, which has significant advantages over the direct explant method and the enzymatic method.

Here we present a modified method for the isolation and culture of human gingival epithelial cells by adding the Rock inhibitor, Y-27632, to the traditional method. This method is easier, less time-consuming, enhances stem cell properties, and produces larger numbers of high-potential epithelial cells both for the laboratory and for clinical applications.

Isolierung und Kultur primärer humaner Zahnfleischepithelzellen mit Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is ...