This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) and RENEVAS RD06/0026/0005 (IL), and from the Local Government of Madrid S2010/BMD-2336 (MAM) and S2010/BMD-2349 (IL). IB and MIC are fellows of the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness.

<ol>
	<li>Chamorro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunology+of+acute+stroke.">The immunology of acute stroke.</a> Nature Reviews. Neurology. 8, 401-410 (2012).</li><li>Iadecola, C., Anrather, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunology+of+stroke:+from+mechanisms+to+translation.">The immunology of stroke: from mechanisms to translation.</a> Nat Med. 17, 796-808 (2011).</li><li>Ramlackhansingh, A. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+is+not+present+on+neurogenic+astrocytes+in+the+adult+subventricular+zone,+but+on+embryonic+neural+stem+cells,+ependymal+cells,+and+glioblastoma+cells.">CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells.</a> Cancer Research. 67, 5727-5736 (2007).</li><li>Tham, C. S., Lin, F. F., Rao, T. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

Die zerebrale Ischämie-Modell hier vorgestellten gibt hoch reproduzierbare Infarktvolumen bestimmt 24 bis 48 h und 7 Tage nach der MCA Ligation durch verschiedene Ansätze 8,15,17. Diese MCAO-Modell hat eine geringe Sterblichkeit (weniger als 1%) im Vergleich zu anderen, die Minimierung der Anzahl der Tiere in Studien verwendet. Ein entscheidender Schritt, um diese niedrige Rate der Sterblichkeit zu erhalten, ist die richtige aseptischen Bedingungen zu halten, um Infektionen, die das Überleben nach Schlaganfallinduktion beeinträchtigen könnten, zu vermeiden. Diese MCAO-Modell kann nicht nur als Dauer MCAO-Modell, das als ein klinisch relevanten Modell für translationale Forschung 18 verwendet werden, sondern auch als Übergangsmodell durch vorübergehende Unterbindung der CCA und MCA mit einem slipknot und hinteren Reperfusion zum gewünschten Zeitpunkt 19. Dieses Verfahren wurde erfolgreich bei Mäusen und Ratten 17,20 verwendet. All dies deutet darauf hin, dass MCAO durch Ligation ist ein hochvielseitiges Modell der zerebralen Ischämie mit mehreren Anwendungen. Ein kritical Schritt dieses Verfahrens besteht darin, dass sie invasive Chirurgie unter einem Stereomikroskop erfordert; die Kraniotomie sollte sehr sorgfältig durchgeführt werden, um nicht die Jochbein sowie die MCA beschädigen. Allerdings ist die Verwendung von Scheintiere (wird die zu der Operation, aber CCA und MCA Ligation unterzogen, nicht durchgeführt werden) stellt ein nützliches Instrument zur chirurgischen Eingriff abhängige Effekte zu unterscheiden. Das Ausmaß der Hirnschädigung nach dieser Technik kann durch verschiedene Verfahren quantitativ bestimmt werden. Unser Protokoll von Gehirn Sektionierens Nissl-Färbung und anschließende Bestimmung des Volumens von Cavalieri ermöglicht eine genaue Quantifizierung des beschädigten Bereich und die Anzahl der Mäuse in dieser Art von Untersuchungen verwendet, da die Seriengehirnschnitte können auch für verschiedene immunohistochemische Analyse verwendet werden minimiert. Für eine bessere Leistung dieser Methodik, wichtig, die in der Software verwendet stereology Parameterwahl ist (Tabelle 1), die zum Schätzen th erforderlich sein werden,e Volumen der verschiedenen Regionen durch die Formel: V = 1 / SSF * a * f t * &amp; Sgr; P i (SSF ist die Scheibe Auswahlsatz, t ist die mittlere Dicke der Abschnitte, ist eine f die Fläche der Gitterabstand und &amp; Sgr; P die Anzahl der Punkte Schlagen der Struktur). Das distale MCAO durch Ligation kann nützlich sein, die infiltrierten Leukozyten und Immunzellpopulationen, die 8,13 im Entzündungsprozess nach Hirnverletzung 1-4 teilnehmen charakterisieren. Hier schlagen wir zwei verschiedene Methoden für die Hirnimmunzellcharakterisierung, eine präzise stereo Ansatz und eine durchflusszytometrische Analyse für eine bessere Charakterisierung mehrere Leukozyten-Subpopulationen. Unter Ausnutzung der seriellen Gehirn Schnitte kann die Quantifizierung der Anzahl von Neutrophilen durch den optischen Fraktionator Verfahren 16, das die Gesamtzahl der Zellen, die von der Anzahl der Zellen abgetastet wit schätzt erreicht werdenha Systematische Zufallsstichprobe (SRS) Satz unvoreingenommene virtuellen Räumen Zählung, die die gesamte Region von Interesse, in unserem Fall den Infarktbereich, mit gleichmäßigen Abstand zwischen unvoreingenommene virtuellen Räumen Zählung in Richtungen X, Y und Z. Diese Methode liefert eine genaue Werkzeug abzuschätzen Gesamt neutrophilen Zahl im ischämischen Gehirn an verschiedenen Zeitpunkten nach der Ligation. Obwohl nicht in dieser Studie gezeigt wurde, dieses Protokoll auch für die Abschätzung der verschiedenen Neutrophilen Subpopulationen nach Ischämie 21 und für eine genaue Quantifizierung von jeder anderen Zellpopulation im ischämischen Gehirn wie andere infiltrierten Leukocyten gefunden werden (Monozyten / Makrophagen) und auch für die Schätzung überlebenden Nervenzellen oder auch für die Neurogenese Quantifizierung nach Schlaganfall. Der wichtigste Schritt für eine genaue Schätzung in dem gewünschten Bereich ist die Auswahl der entsprechenden Parameter, wie die, die in der Tabelle 3 für die Neutrophilen-Quantifizierung in den ischämischen Bereich gezeigt.Diese Parameter werden für die stereo Software verwendet, um die gesamte positive Zellzahl (N) unter Verwendung der Gleichung N = ΣQ- x 1 / SSF x 1 / asf x 1 / tsf (ΣQ- ist die Gesamtzahl von Zellen mit gezählt berechnen die Fraktionator ist ssf der Abschnitt Auswahlsatz, ASF ist die Auswahlsatz Bereich und TSF ist der Auswahlsatz Dicke) 5. Obwohl diese Methodik ist langsamer als andere Quantifizierungstechniken (beispielsweise Analyse von neutrophilen Markern mg Gewebe, Densitometrie von repräsentativen Bildern oder die Anzahl von Neutrophilen pro Feld), den Vorteil, eine neutrale und eine feste Technik, die eine genaue stellt sein muss es Quantifizierung der Zellzahlen. Das Gehirn Leukozyten Isolierung Ansatz erlaubt eine gleichzeitige Identifizierung und Quantifizierung von mehreren Immunzelltypen ohne die Notwendigkeit zur Vorspannung des Systems durch in vivo-Färbung oder genetische Manipulationen. Nachfolgende Zellsortierung vom gekennzeichnet myeloische populations oder deren immunmagnetische Trennung kann für mehrere Downstream-Anwendungen, wie beispielsweise weitere Studien zur Gen- oder Protein-Expression verwendet werden. Die genaue Charakterisierung von Neutrophilen, Monozyten und Mikroglia mit diesem Verfahren erzielt wird, führt eine hohe Spezifität gegenüber den bestehenden Verfahren, wie der immunhistochemische Untersuchungen, ein Vorteil, der die Bildung von Einzelfunktionen zu den verschiedenen myeloischen Zellen, Gehirn angeborenen Immunantwort auslösen können. Zusätzlich kann es ferner erweitert werden, um andere Gehirn Populationen mit dem entsprechenden Label kenn wie Blut geboren Makrophagen (CD11b + CD45 hallo CD68 +), und es kann für die Untersuchung von anderen ZNS Erkrankungen oder Verletzungen, die angewendet werden. Daher ist diese Technik stellt ein wichtiges Instrument, um die Heterogenität der Entzündungsreaktion im Gehirn zu erforschen. Eine wesentliche Einschränkung dieses Verfahrens beruht auf der Herstellung der Leukozyten-Suspensionen aus frischen Hirngewebe, was das ändern kann,Aktivierungszustand der Zellen oder deren Antigen-Veränderung. Obwohl diese Technik ermöglicht eine genauere qualitative Charakterisierung verglichen immunhistochemischen Studien liefert sie eine weniger genaue Quantifizierung basierend auf der Zellisolierung. Dennoch ist die Effizienz der Zellisolierungsprotokoll ähnlich zu anderen veröffentlichten Methoden 9 und kann effizient genutzt werden, um Unterschiede in der Anzahl von Gehirnimmunzellen zwischen Kontrolle und MCAO-Gruppen oder sogar zwischen MCAO Gruppen unterschiedlichen Behandlungen unterzogen 8 detektieren. Kritische Schritte dieses Protokolls sind die Gewebedissektion die Gewebezerstörung Verfahren und die Myelinentfernung. Bezüglich der Gewebesammel kann ein Normierungsschritt (durch Wiegen des gesammelten Gewebes), um die Variabilität zu vermeiden aufgrund unterschiedlicher Dissektion Leistungsberechnung einbezogen werden. Darüber hinaus kann eine Normalisierung zwischen verschiedenen MCAO Gruppen auch durch Infarktvolumen auf (zuvor von Magnetic R bestimmtesonance). Eine weitere Möglichkeit, dieses Problem zu lösen, ist, den gesamten ipsilateralen Hemisphäre beider ischämischen und Kontrollgruppen zu verwenden, oder sogar die kontralateralen Hemisphäre des ischämischen Maus als Kontrolle, um die Anzahl der verwendeten Tiere zu minimieren. Dieser Ansatz vermeidet Unterschiede zwischen jedem Dissektion, hat es einen Nachteil; ein Verdünnungsfaktor wird durch die Erhöhung der Gesamtzahl der Zellen, nicht aber die Anzahl der myeloiden Zellen, die ausschließlich in den Kern und peri-Infarktbereiche des ipsilateralen Kortex zugegeben. In Bezug auf Gewebe-Zerstörung, veranschaulicht dieses Protokoll die Schritte für die mechanische Zerstörung von Gehirnzellen, die Vermeidung enzymatische Behandlungen und Vorbeugung von Oberflächenantigen Veränderung 9,22, ein wesentlicher Faktor für die weitere qualitative und quantitative Analyse der inflammatorischen Zell-Subpopulationen. Neben der Herstellung der Zellsuspension von Interesse ist Myelin Entfernung aus Gehirnproben ein empfehlens Schritt, um Interferenzen mit downst vermeidenRies Anwendungen wie immunomagnetischen Zelltrennung oder Durchflusszytometrie 23,24. Dies kann unter Verwendung verschiedener Verfahren, wie Saccharose oder Percoll-Gradienten, oder Anti-Myelin-Perlen erreicht werden. Hier und auf Basis von früheren Studien, die verschiedene Verfahren zur Hirnzellsuspension Isolierung, mechanische Störung in Kombination Vergleichen mit Percoll Nutzung Myelin Entfernen verwendet wird, um die Zellausbeute zu verbessern und die Lebensfähigkeit 25.

Morphologischen, phänotypischen und Genexpression Veränderungen der Mikroglia sowie Extravasation und Aktivierung von hämatogenen Makrophagen und Neutrophile werden geglaubt, um eine zentrale Rolle bei der pathophysiologische Kaskade folgenden Hirnverletzung 1-4 zu spielen. Dieses Protokoll stellt zwei Ansätze, um die Anzahl der verschiedenen myeloiden Zellmengen des ischämischen Hirn schätzen und ihre phänotypische Charakterisierung auszuführen. Darüber hinaus bietet es auch eine Beschreibung von einem experimentellen Modell der zerebralen Ischämie in Mäusen, die der transienten oder permanenten Ligatur der beiden distalen Middle Cerebral Artery (MCA) und der Arteria carotis communis (CCA) besteht, wie es die Infarkt evaluieren durch die genaue Cavalieri Verfahren unter Verwendung eines stereo Software. Der erste Ansatz zu der ischämischen Hirn charakterisieren myeloischen Zellen-Untergruppen ist ein stereo Methode, die auf der optischen Fraktionator Ansatz 5. Dies ist diegängigen stereo Sonde in den Biowissenschaften und bietet ein hohes Maß an Präzision bei niedrigen Koeffizienten der Fehler 5-7. Dies ist die beste Wahl für die Zell Quantifizierung, wenn das Gewebe in einzelne Abschnitte geschnitten wird, wie es aufgrund der Fragmentierung des Gewebes in Abschnitte vermeidet die Vorspannung an Zellschätzung. Diese Methode ist ein sehr guter Weg, um Zahlen, Dynamik und phänotypischen Veränderungen der Neutrophilen infiltriert Subpopulationen der ischämischen Gewebe 8 zu charakterisieren. Die zweite Charakterisierung Ansatz basiert auf einem modifizierten Protokoll von Campanella und Mitarbeiter 9, die einen einfachen Weg, um Gehirnsuspensionen Leukozyten zu isolieren und mittels Durchflusszytometrie charakterisiert vorsieht. Im Gegensatz zu herkömmlichen immunhistochemischen Techniken, Durchflusszytometrie charakterisierenden Differenzierung Mikroglia (CD45 lo CD11b +) und infiltrierten myeloiden Zellen (CD45 hallo CD11b +) auf der Grundlage ihrer diffErent Expression von CD45 9-13. Zusätzlich proinflammatorischen Monozyten (CD45 hallo CD11b + Ly-6G - Ly-6C hallo), Neutrophile (CD45 hallo CD11b + Ly-6G +) und andere Leukozyten Teilmengen von dem ischämischen Gewebe unterschieden werden. Dieser Ansatz bietet eine zuverlässige und schnelle Assay Neuroinflammation in experimentellen Modellen der Hirnischämie bewerten. Allerdings kann der Gewebeverarbeitung den Aktivierungszustand und Nummern der verschiedenen Zellpopulationen im ischämischen Gewebe die eine semi-quantitative Charakterisierung gefunden zu beeinflussen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1018">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:215px;">Company</td>
			<td style="width:215px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:215px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Photonic Led F1</td>
			<td style="width:215px;">WPI</td>
			<td style="width:215px;">571329-8</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Temp Controller&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Panlab&#160;</td>
			<td style="width:215px;">HB 101/2</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Volvere GX</td>
			<td style="width:215px;">NSK</td>
			<td style="width:215px;">Ne22L</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Microscope</td>
			<td style="width:215px;">WPI</td>
			<td style="width:215px;">PZMIII-BS</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Stainless Steel Burrs</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">19007-14</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Forceps Dumont #5/45&#160;</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">11251-35</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Forceps Dumont #5SF</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">11252-30</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Suture 6/0</td>
			<td style="width:215px;">LorcaMarin</td>
			<td style="width:215px;">55108</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Suture 9/0</td>
			<td style="width:215px;">LorcaMarin</td>
			<td style="width:215px;">61966</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Nikon Eclipse&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Nikon</td>
			<td style="width:215px;">TE300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:215px;">Esteve</td>
			<td style="width:215px;">571329-8</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Sodium Pentobarbital</td>
			<td style="width:215px;">Vetoquinol</td>
			<td style="width:215px;">570681</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Freezing microtome</td>
			<td style="width:215px;">Leica Microsystems GmbH</td>
			<td style="width:215px;">SM2000R</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Superfrost slides</td>
			<td style="width:215px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:215px;">2014-07</td>
			<td>Lab material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Cresyl violet acetate</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">C5042</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Microscope&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Nikon</td>
			<td style="width:215px;">Nikon Eclipse TE300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">XYZ motorized computer stage and controller</td>
			<td style="width:215px;">Ludl electronics Products</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Stereo Investigator System</td>
			<td style="width:215px;">Microbrightfield</td>
			<td style="width:215px;">Version 7.003 software</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle</td>
			<td style="width:215px;">Thomas Scientific</td>
			<td>0913X70</td>
			<td>Lab Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polypropylene 50mL Oak Ridge Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:215px;">Nalgene</td>
			<td>3119-0050&#160;</td>
			<td>Lab material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Percoll</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">p1644-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:215px;">Lonza</td>
			<td style="width:215px;">BE12-702F</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Beckman Ultracentrifugue</td>
			<td style="width:215px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti</td>
			<td style="width:215px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">BD 352340</td>
			<td>Lab Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">A3733-500G</td>
			<td>Reagment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">FcR Blocking Reagent, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-092-575</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">CD11b-FITC, human and mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-098-085</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">CD45-PE, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-102-596</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Anti-Ly-6G-APC, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-102-936</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C</td>
			<td style="width:215px;">Biolegend</td>
			<td style="width:215px;">128012</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD FACS Flow</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">342003</td>
			<td>Reagment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD FACSCalibur; 4-color</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">342975</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD Cell Quest Pro Software</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">FlowJo software</td>
			<td style="width:215px;">Treestar inc.</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereological and flow cytometry characterization of leukocyte subpopulations in models of transient or permanent cerebral ischemia

Mikroglia-Aktivierung sowie Austritt von hämatogenen Makrophagen und Neutrophile, wird angenommen, dass eine zentrale Rolle bei Hirnverletzung nach einem Schlaganfall zu spielen. Diese myeloiden Zellpopulationen können verschiedene Phänotypen und Funktionen angezeigt und unterschieden werden müssen und dadurch ihre Regelung und den Beitrag zu Gewebeschäden zu untersuchen. Dieses Protokoll bietet zwei verschiedene Methoden zur Gehirnimmunzellcharakterisierung: eine präzise stereo Ansatz und eine durchflusszytometrische Analyse. Die stereo Ansatz basiert auf der optischen Fraktionator Methode, die die Gesamtzahl der Zellen in einem Bereich von Interesse (infarzierten Gehirn) berechnet durch eine systematische Stichproben geschätzt basiert. Die zweite Charakterisierung Ansatz bietet eine einfache Möglichkeit, Gehirnsuspensionen Leukozyten zu isolieren und durch Strömungs charakterisieren Zytometrie, so dass für die Charakterisierung von Mikroglia infiltriert Monozyten und Neutrophilen des ischämischen Gewebes. Darüber hinaus ist es auch details eine zerebrale Ischämie-Modell bei Mäusen, die ausschließlich betrifft Hirnrinde, die Erzeugung in hohem Maße reproduzierbar Infarkten mit einer niedrigen Rate der Sterblichkeit, und das Verfahren zur histologischen Gehirnverarbeitung Infarktvolumen durch die Cavalieri Methode zu charakterisieren.

Die hier gezeigte zerebrale Ischämie-Modell erzeugt Infarkte ausschließlich in der Hirnrinde zu sehen, ohne die striatalen Gewebe, da die lenticulostriatal Zweige der MCA, die das Striatum zu bewässern sind nicht verschlossen (Abbildung 1). Nissl-Färbung, kann der beschädigte Bereich als hypo kortikalen Bereich (Figur 2) identifiziert werden. Dieses Modell wird von in hohem Maße reproduzierbar Infarktvolumen bei 24 h nach MCAO (% IH 15,89 ± 0,28) von Cavalieri Verfahren in Nissl-gefärbten Schnitten geschätzt (Abbildung 2) aus. Schätzung der Infarktvolumen nach Cavalieri Verfahrens ist eine genaue Vorgehensweise mit geringem Fehler, der in dem Koeffizienten der Fehler (CE) von Gundersen in kontraläsionalen und ipsilesional Hemisphären sowie im Infarktareal (Tabelle 2) reflektiert wird. Geschädigte Gewebe Volumen in mm 3, sondern auch als% IH unter Verwendung der Formel in dem Abschnitt 3.2.13 ausgedrückt werden. Darüber hinaus ist die Abschätzungdes Gesamtvolumens der ipsilesional und kontraläsionelle Regionen ermöglicht die Berechnung der Ödemindex um das Infarktvolumen zu korrigieren und eine Überschätzung des geschädigten Gewebes (Tabelle 2) zu vermeiden. Angesichts der Serienschnitt Verarbeitung des Gehirngewebe, kann dies ausgenutzt werden, um eine genaue Schätzung der Gesamtzahl der Zellpopulationen durchzuführen, wie infiltrierten Neutrophilen in den ischämischen Bereich, unter Verwendung des optischen Fractionator Ansatz (Abbildung 3 und Tabelle 4) mit den in Tabelle 3 gezeigten Parameter. Dieses Protokoll schätzt eine Gesamtzahl der Neutrophilen (Ly6G-positive Zellen) in der Infarktfläche von 23.328 ± 3.623 bei 24 h und 82.856 ± 8.143 bei 48 h bei Mäusen nach pMCAO (Figur 3D). In Übereinstimmung mit früheren Studien wird Neutrophilinfiltration direkt mit der Infarktgröße (3E) korreliert. Die Einschätzung der ter Anzahl der Neutrophilen von der Optical Fractionator Verfahrens ist eine genaue Vorgehensweise mit geringem Fehler, der durch das CE von Gundersen (Tabelle 4) reflektiert wird. Die Leukozyten-Isolierung und Durchflusszytometrie Charakterisierung Protokoll erlaubt die Isolierung von 47.922 ± 23.174 myeloischen Zellen aus der Rinde der ipsilesional Hemisphäre ischämischer Mäusen. Diese 10-30% der gesamten Ereignisse in der Zellsuspension vorhanden. Der Großteil der erfassten Ereignisse mit diesem Protokoll gegenwärtig eine niedrige FSC-Parameter, um Zelltrümmer zu (Abbildung 4) assoziiert. CD11b-Färbung zeigt, dass CD11b + Zellen eine höhere FSC Wert (Figur 4), was darauf hindeutet, dass Zelltrümmern wird mit diesem Marker markiert und, wie zuvor angegeben, daß sie von einer weiteren Analyse durch Setzen des FSC Schwelle bei 200 9 ausgeschlossen. Der variable Anteil der Zelltrümmer mit diesem Verfahren erhalten lässt vermuten, dass Unterschiede auf Beispielprozessing (Timing, Gewebeschutz, Probentemperatur, effiziente Myelinentfernung, etc.) können zur Rechenschaft ziehen. Darüber hinaus wird die Verwendung von Zellsiebe auch notwendig, um das Vorhandensein von zellulären Klemmen in den Proben zu vermeiden; Dieser Schritt muss vor Zellfärbung durchgeführt werden. Mit der Gating-Strategie in der Abbildung 5, die an CD11b und CD45-Expression auf der Grundlage angezeigt wird, können wir zwischen gebietsansässigen und infiltriert myeloischen Zellen im ischämischen Gewebe zu unterscheiden. Diese CD11b + Bevölkerungszunahme im ischämischen Hemisphäre, wenn sie mit der naiven und mit der Scheingruppe, in der diese Zellen sind meist auf einer niedrigen Expression des CD45 assoziiert anzeigt, dass Mikroglia nach Ischämie proliferierenden (Figur 4, Figur 5 und Tabelle 5) verglichen wird . Dieser Unterschied ist wahrscheinlich auf die Zellinfiltration von dem Umfang, wie durch das Erscheinen einer CD11b + CD45 hallo Zellsubpopulation im ischämischen Gehirn nachgewiesen (Abbildung 4, Abbildung 5 und Tabelle 5), die geringe Anzahl in naiv und in Schein Gehirn ist. Der Beitrag der Infiltrate zum CD11b + Zellpopulation in Hirnischämie ist ein sehr dynamischer Prozess 4. Im MCAO-Modell durch die Ligatur, kann es von 30% bis 60% der Gesamt CD11b + Zellen in Abhängigkeit von der Größe der Läsion und der Zeit, wenn die Charakterisierung wurde getan variieren. Neutrophile, gekennzeichnet als Ly-6G + Zellen am stärksten vertreten sind infiltriert Zellpopulation bei 24 h nach MCAO gefunden in der ischämischen Gehirn der Maus mit diesem Modell von zerebraler Ischämie, da sie die 70-80% des CD11b + CD45 umfassen hallo. Der Rest der Zellen sind meist eine Subpopulation von CD11b + CD45 hallo Ly-6G - Ly-6C hallo pro-inflammatorischen Monozyten. In diesem Modell, diese Population wird in Reihe in den ischämischen Gehirnbereichen 24 bis 48 h nach MCAO erhöhen. Abb. 1: Die chirurgische Verfahren für die MCA-Ligation (A) nach dem Zurückziehen des Schläfenmuskels wird eine kleine Kraniotomie im Mausschädelgeführt. MCA wird durch einen Knoten oder eine slipknot mit einem 9/0 Naht ligiert. (B) Repräsentative Bilder der kortikalen Läsionen durch die MCAO-Modell generiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig2.jpg" /> Abbildung 2: Quantifizierung der Infarktvolumen von Cavalieri. (A) Repräsentative Bilder der Nissl-gefärbten Hirnschnitten 24 Stunden nach der Dauer MCA Ligation. Die hohe Vergrößerung zeigt die hipocromatic Bereich nach Nissl-Färbung dieidentifiziert den beschädigten Bereich (Kern) nach MCAO. Die (PI) Region Peri-Infarkt ist ebenfalls dargestellt. (B) Quantifizierung der Infarktvolumen mit der Cavalieri Verfahren in Serien Nissl-gefärbten Schnitten, 24 h nach MCAO (n = 50 Mäuse als% Infarkt Hemisphäre (% IH) vertreten ). <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig3.jpg" /> Abbildung 3: stereo Quantifizierung von Neutrophilen im Infarktareal 24 und 48 Stunden nach der Ligation mit dem Optical Fractionator Verfahren. (A) Repräsentatives Bild infiltriert Neutrophilen (Ly6G-positiven Zellen) in den ischämischen Bereich bei 24 h nach MCAO. Abgrenzung zeigt die Infarktareal. (B, C) ​​Beispiele eines optischen Dissektor für neutrophile Quantifizierung mittels optischen Fraktionator. (D) Quantifizierung der gesamten Neutrophilen im Infarktbereich 24 und 48 h (n = 4 Mäuse). (E)Die Korrelation der Zahl der Neutrophilen mit der Infarktgröße 24 und 48 Stunden nach MCA Ligation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig4.jpg" /> Abb. 4: Repräsentative Dot-Plot Scatter Analyse der Gehirn Leukozyten aus naiven, Schein und ischämische (24 h nach MCAO) Halbkugeln auf der Basis von physikalischen Parametern (SSC und FSC) erreicht eine Population von Ereignissen, die CD11b (rot) zum Ausdruck identifiziert in allen Gruppen. Diese Population wurde nach der Expression von CD45 gated und charakterisiert. Zellen exprimieren geringe Mengen an CD45 (grün) wurden in den ischämischen und nicht-ischämischen Hirnkortex vorhanden und entsprach Mikrogliazellen. Im Gegensatz dazu zeigten Zellen, die große Mengen von CD45 (gelb) nurin der ischämischen Hemisphäre und in geringerem Maße in der Sham-Gruppe gefunden. Die weitere Analyse der CD11b + CD45 hallo Population zeigt an, dass Neutrophile (Ly-6G + Zellen, blau) und pro-inflammatorische Monozyten (Ly-6C hallo Zellen, Orange) sind die Hauptzellpopulationen in Gehirn eindringt 24 Stunden nach dem Schlaganfall. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig4large.jpg" target="_blank">Bitte Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig5.jpg" /> Abb. 5: Gating Strategien Wohnsitz aus infiltriert myeloischen Zellen im ischämischen Gewebe zu unterscheiden CD11b + Zellen wurden zunächst nach Isotyp Fluoreszenzintensität (A) sucht. Eine repräsentative Punktdiagramm von Zellsuspensionen des ischämischen Hirn in der oben rechts auf der Tafel angezeigt. InZusätzlich typische Werte für die Gesamtzahl von Ereignissen und für die Anzahl von CD11b + Ereignisse unter Verwendung dieser Technik erworben gezeigt (keine der Zellen / ischämischer Hirnhemisphäre;. (A) CD45 Fluoreszenzintensitätsanalyse der CD11b + Zellen ist in Panel gezeigt B. Ein Vertreter Dot-Plot-Analyse von CD45 und CD11b Ausdruck der gated CD11b + Subpopulation in der oben rechts auf der Tafel angezeigt. Darüber hinaus ist die typische Anzahl von CD45 lo CD45 pro ischämischen Gehirnhälfte erworben hallo Zellen mit dieser Technik gezeigt ist (B). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col span="2" /></colgroup><tbody><tr><td colspan="2"> Parameter für Cavalieri Methode </td></tr><tr><td> Schnittdicke (t) </td><td> 30 &amp; mgr; </td></tr><tr><td> Ziel </td><td> 10X </td></tr><tr><td> Scheibe Auswahlsatz (SSF) </td><td> 1/ 20 </td></tr><tr><td> Die Entfernung zwischen Abschnitten </td><td> 600 um </td></tr><tr><td> Rasterabstand </td><td> 100 um </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Parameter für die stereo Quantifizierung der Infarktgewebe verwendet. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Ergebnisse </td><td> Kontraläsionalen </td><td> Ipsilesional </td><td> Infarkt </td></tr><tr><td> Area (um²) </td><td> 151.460.000 </td><td> 155.060.000 </td><td> 22.600.000 </td></tr><tr><td> Volume (um³) </td><td> 90,876 Mrd. </td><td> 93036000000 </td><td> 13,56 Mrd. </td></tr><tr><td> Volume für Korrigierte Über Projection (um³) </td><td> 89,9571 Mrd. </td><td> 92046300000 </td><td> &lt;strong&gt; 13,4166 Mrd. </td></tr><tr><td> Coefficient of Error (Gundersen) m = 0 </td><td> 0,068 </td><td> 0,077 </td><td> 0,067 </td></tr><tr><td> Coefficient of Error (Gundersen) m = 1 </td><td> 0,015 </td><td> 0,017 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> Coefficient of Error (Gundersen) alpha (q) </td><td> 0,068 </td><td> 0,077 </td><td> 0,067 </td></tr><tr><td colspan="2"> % Infarkt Hemisphäre </td><td colspan="2"> 14,90 </td></tr><tr><td colspan="2"> Gehirn-Ödem (Ips Vol / Cont Vol) </td><td colspan="2"> 1.02 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: Typische Beispiele für kontraläsionalen, ipsilesional und der Infarktvolumen durch die Cavalieri Verfahren unter Verwendung des Stereo Investigator Software. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colSpan = &quot;2&quot;&gt; Parameter für die optische Fraktionator verwendet </td></tr><tr><td> Schnittdicke (TSF) </td><td> 30 &amp; mgr; </td></tr><tr><td> Ziel </td><td> 100X </td></tr><tr><td> Scheibe Auswahlsatz (SSF) </td><td> 1/10 </td></tr><tr><td> Zählen Rahmenhöhe </td><td> 40 um </td></tr><tr><td> Zählen Rahmenbreite </td><td> 40 um </td></tr><tr><td> X Rastergröße </td><td> 230 um </td></tr><tr><td> X Rastergröße </td><td> 230 um </td></tr><tr><td> Safe Guard </td><td> 2 um </td></tr><tr><td> Optische disector Höhe </td><td> 14 &amp; mgr; m </td></tr></tbody></table> Tabelle 3: Parameter mit Hilfe der Stereo Investigator Software für die stereo Quantifizierung von Neutrophilen infiltriert nach Hirnischämie mit dem optischen Fraktionator Sonde verwendet. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="2"> Die Einschätzung der Neutrophilen von der Optical Fractionator </td></tr><tr><td> Anzahl der Probenahmeflächen </td><td> 430 </td></tr><tr><td> Formfaktor </td><td> 6.24 </td></tr><tr><td> Insgesamt Marker gezählt </td><td> 166 </td></tr><tr><td> Geschätzte Neutrophile von Optical Fractionator </td><td> 117,608.03 </td></tr><tr><td> Coefficient of Error (Gundersen), m = 0 </td><td> 0,22 </td></tr><tr><td> Coefficient of Error (Gundersen), m = 1 </td><td> 0,09 </td></tr></tbody></table> Tabelle 4: Repräsentatives Beispiel der geschätzten infiltriert Neutrophilen nach Hirnischämie mit dem Optical Fractionator Sonde mit Hilfe der Stereo Investigator Software. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> CD11b + </td><td> Neutrophile </td><td> Monozyten </td><td> Mikroglia </td></tr><tr><td> Naiv </td><td> 25.863 ± 4,575.8 </td><td> 473 ± 75,8 </td><td> 525 ± 191,4 </td><td> 19.012 ± 1523 </td></tr><tr><td> Sham 24-Stunden- </td><td> 24.563 ± 5263 </td><td> 873 ± 192,5 </td><td> 1124 ± 391,5 </td><td> 23.734 ± 2910 </td></tr><tr><td> pMCAO 24-Stunden- </td><td> 47.922 ± 23.174 </td><td> 4874 ± 748,7 </td><td> 4826 ± 1345 </td><td> 35.395 ± 10.833 </td></tr></tbody></table> Tabelle 5: Repräsentative Ergebnisse der geschätzten Knochenmarkzellen nach Hirnischämie mit der Durchflusszytometrie Ansatz.

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Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Gehirn Myeloidzellen Charakterisierung nach Schlaganfall kann durch Stereologie unter Verwendung des optischen Fraktionator Verfahren durchgeführt werden, oder durch eine durchflusszytometrische Analyse von Gehirn Leukozyten Suspensionen. Beide sind nützliche Techniken, um eine genaue phänotypische Unterscheidung der Haupt myeloischen Zellen-Untergruppen in der ischämischen Gehirn führen.

Stereo und Durchflusszytometrie Charakterisierung von Leukozyten-Subpopulationen in Models der vorübergehend oder bleibend zerebrale Ischämie

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

stereological-flow-cytometry-characterization-leukocyte

Research

JoVE Journal

Medicine

15.5K Aufrufe.  Universidad Complutense de Madrid y Instituto de Investigación Hospital 12 de Octubre, Madrid.  Gehirn Myeloidzellen Charakterisierung nach Schlaganfall kann durch Stereologie unter Verwendung des optischen Fraktionator Verfahren durchgeführt werden, oder durch eine durchflusszytometrische Analyse von Gehirn Leukozyten Suspensionen. Beide sind nützliche Techniken, um eine genaue phänotypische Unterscheidung der Haupt myeloischen Zellen-Untergruppen in der ischämischen Gehirn führen. 

Serie: Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to develop suitable animal models to study the events that unfold during ischemic insult. These techniques include transient or permanent, focal or global ischemia models using many different animal models, with the most common being rodents.
The permanent MCA ligation method which is also referred as pMCAo in the literature is used extensively as a focal ischemia model in rodents 1-6. This method was originally described for rats by Tamura et al. in 1981 7. In this protocol a craniotomy was used to access the MCA and the proximal regions were occluded by electrocoagulation. The infarcts involve mostly cortical and sometimes striatal regions depending on the location of the occlusion. This technique is now well established and used in many laboratories 8-13. Early use of this technique led to the definition and description of &#x201C;infarct core&#x201D; and &#x201C;penumbra&#x201D; 14-16, and it is often used to evaluate potential neuroprotective compounds 10, 12, 13, 17. Although the initial studies were performed in rats, permanent MCA ligation has been used successfully in mice with slight modifications 18-20 .
This model yields reproducible infarcts and increased post-survival rates. Approximately 80% of the ischemic strokes in humans happen in the MCA area 21 and thus this is a very relevant model for stroke studies. Currently, there is a paucity of effective treatments available to stroke patients, and thus there is a need for good models to test potential pharmacological compounds and evaluate physiological outcomes. This method can also be used for studying intracellular hypoxia response mechanisms in vivo. 
Here, we present the MCA ligation surgery in a C57/BL6 mouse. We describe the pre-surgical preparation, MCA ligation surgery and 2,3,5 Triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining for quantification of infarct volumes.

Middle cerebral artery (MCA) ligation is a technique to study focal cerebral ischemia in animal models. In this method, the middle cerebral artery is exposed by craniotomy and ligated by cauterization. This method gives highly reproducible infarct volumes and increased post-operative survival rates compared to other methods available.

Die Anwendung des dauerhaften mittleren Hirnarterie Ligation in der Maus

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to ...

Forschung

Medizin

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury (IRI) of the Rat Cremaster Muscle

Ischemia-reperfusion injury (IRI) has been implicated in a large array of pathological conditions such as cerebral stroke, myocardial infarction, intestinal ischemia as well as following transplant and cardiovascular surgery.1 Reperfusion of previously ischemic tissue, while essential for the prevention of irreversible tissue injury, elicits excessive inflammation of the affected tissue. Adjacent to the production of reactive oxygen species, activation of the complement system and increased microvascular permeability, the activation of leukocytes is one of the principle actors in the pathological cascade of inflammatory tissue damage during reperfusion.2, 3 Leukocyte activation is a multistep process consisting of rolling, firm adhesion and transmigration and is mediated by a complex interaction between adhesion molecules in response to chemoattractants such as complement factors, chemokines, or platelet-activating factor.4
While leukocyte rolling in postcapillary venules is predominantly mediated by the interaction of selectins5 with their counter ligands, firm adhesion of leukocytes to the endothelium is selectin-controlled via binding to intercellular adhesion molecules (ICAM) and vascular cellular adhesion molecules (VCAM).6, 7 
Gold standard for the in vivo observation of leukocyte-endothelial interaction is the technique of intravital microscopy, first described in 1968.8
Though various models of IRI (ischemia-reperfusion injury) have been described for various organs, 9-12 only few are suitable for direct visualization of leukocyte recruitment in the microvascular bed on a high level of image quality.8 
We here promote the digital intravital epifluorescence microscopy of the postcapillary venule in the cremasteric microcirculation of the rat 13 as a convenient method to qualitatively and quantitatively analyze leukocyte recruitment for IRI-research in striated muscle tissue and provide a detailed manual for accomplishing the technique. We further illustrate common pitfalls and provide useful tips which should enable the reader to truly appreciate, and safely perform the method.
In a step by step protocol we depict how to get started with respiration controlled anesthesia under sufficient monitoring to keep the animal firmly anesthetized for longer periods of time. We then describe the cremasteric preparation as a thin flat sheet for outstanding optical resolution and provide a protocol for leukocyte imaging in IRI that has been well established in our laboratories.

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury IRI of the Rat Cremaster Muscle

Digital intravital epifluorescence microscopy of postcapillary venules in the cremasteric microcirculation is a convenient method to gain insights into leukocyte-endothelial interaction in vivo in ischemia-reperfusion injury (IRI) of striated muscle tissue. We here provide a detailed protocol to safely perform the technique and discuss its applications and limitations.

Real-time Digital Imaging von Leukozyten-Endothel-Interaktion in der Ischämie-Reperfusionsschaden (IRI) der Ratte Cremastermuskel

Ischemia-reperfusion injury (IRI) has been implicated in a large array of pathological conditions such as cerebral stroke, myocardial infarction, ...

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow (ischemia) 1. Middle cerebral artery (MCA) delivers a great majority of blood to the lateral surface of the cortex 2, is the most common site of human stroke 3, and ischemia within its territory can result in extensive dysfunction or death 1,4,5. Survivors of ischemic stroke often suffer loss or disruption of motor capabilities, sensory deficits, and infarct. In an effort to capture these key characteristics of stroke, and thereby develop effective treatment, a great deal of emphasis is placed upon animal models of ischemia in MCA.
Here we present a method of permanently occluding a cortical surface blood vessel. We will present this method using an example of a relevant vessel occlusion that models the most common type, location, and outcome of human stroke, permanent middle cerebral artery occlusion (pMCAO). In this model, we surgically expose MCA in the adult rat and subsequently occlude via double ligature and transection of the vessel. This pMCAO blocks the proximal cortical branch of MCA, causing ischemia in all of MCA cortical territory, a large portion of the cortex. This method of occlusion can also be used to occlude more distal portions of cortical vessels in order to achieve more focal ischemia targeting a smaller region of cortex. The primary disadvantages of pMCAO are that the surgical procedure is somewhat invasive as a small craniotomy is required to access MCA, though this results in minimal tissue damage. The primary advantages of this model, however, are: the site of occlusion is well defined, the degree of blood flow reduction is consistent, functional and neurological impairment occurs rapidly, infarct size is consistent, and the high rate of survival allows for long-term chronic assessment.

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

We describe a highly reproducible method for the permanent occlusion of a rodent major cerebral blood vessel. This technique can be accomplished with very little peripheral damage, minimal blood loss, a high rate of long-term survival, and consistent infarct volume commensurate with the human clinical population.

Permanent Cerebral Gefäßverschluss<em&gt; Über</em&gt; Double Blattschraube und Durchtrennung

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie zellbasierten Assay auf Antikörper gegen N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor oder Dopamin-2-Rezeptor im menschlichen Serum Detect

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

Halbautomatische Anpassung der Umlauftumorzellen (CTC)-Assays für die klinische und vorklinische Forschungsanwendungen

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical options are available for a small proportion of stroke patients in the acute phase. Current research is intensively searching for novel therapeutic strategies and is increasingly focusing on the sub-acute and chronic phase after stroke because more patients might be eligible for therapeutic interventions in a prolonged time window. These delayed mechanisms include important pathophysiological pathways such as post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticity and regeneration. In order to analyze these mechanisms and to subsequently evaluate novel drug targets, experimental stroke models with clinical relevance, low mortality and high reproducibility are sought after. Moreover, mice are the smallest mammals in which a focal stroke lesion can be induced and for which a broad spectrum of transgenic models are available. Therefore, we describe here the mouse model of transcranial, permanent coagulation of the middle cerebral artery via electrocoagulation distal of the lenticulostriatal arteries, the so-called &#8220;coagulation model&#8221;. The resulting infarct in this model is located mainly in the cortex; the relative infarct volume in relation to brain size corresponds to the majority of human strokes. Moreover, the model fulfills the above-mentioned criteria of reproducibility and low mortality. In this video we demonstrate the surgical methods of stroke induction in the &#8220;coagulation model&#8221; and report histological and functional analysis tools.

Various murine models of middle cerebral artery occlusion (MCAO) are widely used in experimental brain research. Here, we demonstrate the model of transcranial permanent distal MCAO which produces consistent cortical infarction of a size corresponding to damage imposed by the majority of human ischemic strokes.

Modellierung Schlaganfall bei Mäusen: Permanent Koagulation der distalen A. cerebri media

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

A Thrombotic Stroke Model Based On Transient Cerebral Hypoxia-ischemia

Stroke research has endured many setbacks in translating neuroprotective therapies into clinical practice. In contrast, the real-world therapy (tPA thrombolysis) rarely produces benefits in mechanical occlusion-based experimental models, which dominate preclinical stroke research. This split between the bench and bedside suggests the need to employ tPA-responsive models in preclinical stroke research. To this end, a simple and tPA-reactive thrombotic stroke model is invented and described here. This model consists of transient occlusion of the unilateral common carotid artery and delivery of 7.5% oxygen through a face mask in adult mice for 30 min, while maintaining the animal rectal temperature at 37.5 &#177; 0.5 &#176;C. Although reversible ligation of the unilateral carotid artery or hypoxia each suppressed cerebral blood flow only transiently, the combination of both insults caused lasting reperfusion deficits, fibrin and platelet deposition, and large infarct in the middle cerebral artery-supplied territory. Importantly, tail-vein injection of recombinant tPA at 0.5, 1, or 4 hr post-tHI (10 mg/kg) provided time-dependent reduction of the mortality rate and infarct size. This new stroke model is simple and can be standardized across laboratories to compare experimental results. Further, it induces thrombosis without craniectomy or introducing pre-formed emboli. Given these unique merits, the tHI model is a useful addition to the repertoire of preclinical stroke research.

Thromboembolic stroke models are vital tools for optimizing the recanalization therapy. Here we report a murine thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxic-ischemic (tHI) insult, which triggers thrombosis and infarction, and responds favorably to tissue plasminogen activator (tPA)-mediated fibrinolysis in a therapeutic window similar to those in stroke patients.

A thrombotischer Schlaganfall Modell basierend auf Transient zerebrale Hypoxie-Ischämie

Stroke research has endured many setbacks in translating neuroprotective therapies into clinical practice. In contrast, the real-world therapy (tPA ...

Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, obesity and diabetes. Accordingly, when evaluating therapies for stroke in animals, it is important to select a model with excellent face validity. Ischemic stroke accounts for 80% of all strokes, and the majority of these occur in the territory of the middle cerebral artery (MCA), often inducing infarcts that affect the sensorimotor cortex, causing persistent plegia or paresis on the contralateral side of the body. We demonstrate in this video a method for producing ischemic stroke in elderly rats, which causes sustained sensorimotor disability and substantial cortical infarcts. Specifically, we induce permanent distal middle cerebral artery occlusion (MCAO) in elderly female rats by using diathermy forceps to occlude a short segment of this artery. The carotid artery on the ipsilateral side to the lesion was then permanently occluded and the contralateral carotid artery was transiently occluded for 60 min. We measure the infarct size using structural T2-weighted magnetic resonance imaging (MRI) at 24 hr and 8 weeks after stroke. In this study, the mean infarct volume was 4.5% &#177; 2.0% (standard deviation) of the ipsilateral hemisphere at 24 hr (corrected for brain swelling using Gerriet&#8217;s equation, n = 5). This model is feasible and clinically relevant as it permits the induction of sustained sensorimotor deficits, which is important for the elucidation of pathophysiological mechanisms and novel treatments.

Here we present a protocol to produce permanent distal middle cerebral artery occlusion in elderly female rats with simultaneous occlusion of the carotid arteries to generate large cortical infarcts and sustained deficits. We show confirmation of the lesion size using structural MRI at 24 hr and 8 weeks after stroke.

Darstellende Permanent Distal cerebri mit Arteria carotis communis Occlusion bei alten Ratten zu studieren kortikale Ischämie mit anhaltenden Behinderungs

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, ...

Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Model of Neonatal Stroke in P10 Rats

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature and mature brain. Stroke occurs commonly in the perinatal period in humans, and transient ischemia-reperfusion is the most common form of stroke in neonates. The reperfusion phase is a critical component of injury progression, which occurs over a period of days to weeks, and of the endogenous response to injury. This postnatal day 10 (p10) rat model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) creates a unilateral, non-hemorrhagic focal ischemia-reperfusion injury that can be utilized to study the mechanisms of focal injury and repair in the full-term-equivalent brain. The injury pattern that is produced by tMCAO is consistent and highly reproducible and can be confirmed with MRI or histological analyses. The severity of injury can be manipulated through changes in occlusion time and other methods that will be discussed.

Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.

Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Modell von Neugeborenen Stroke in P10 Ratten

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.